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菌株分离鉴定、药敏实验及PCR扩增实验过程

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目录2.1菌株的分离纯化 (1)2.1.1菌株的分离 (1)2.1.2菌株的纯化 (1)2.2菌株的鉴定 (2)2.2.1革兰氏染色镜检 (2)2.2.2菌株的生化鉴定 (2)2.3药敏试验 (3)2.3.1药物的配制 (3)2.3.2质控 (4)2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验 (4)2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 (7)2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 (7)2.5.1 PCR 扩增引物及条件 (7)2.5.2电泳检测PCR扩增产物 (8)2.1菌株的分离纯化2.1.1菌株的分离2.1.1.1实验的准备1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管（1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁；（2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡；（3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25℃,100Hz；（4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25℃，100 Hz；（5）倒出管中水，重复（4）一次；（6）倒出管中水，放入60℃烘箱中烘干；（7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121℃，20min；（8）高压后取出放入烘箱中，烘干后待用。

2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。

注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。

3.试管的准备：本实验需要100根试管（1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁；（2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压；（3）取出后烘干待用。

4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121℃高压15min，烘干待用。

5.麦康凯琼脂培养基的准备：按所选商品说明配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。

2.1.1.2实验过程（1）每个分离管装入20mlBPW；（2）三点取样剪取100份待检肉样分装到100个分离管中，按肉样的标号在分离管上标号，放入37±1℃温箱摇床上培养6h，200r；（3）取分离管中的菌液50μL加入LB管中，标号，37±1℃温箱摇床上培养10-12h，200r；（4）用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1℃温箱过夜培养。

2.1.2菌株的纯化2.1.2.1实验的准备1.伊红美兰（EMB）琼脂培养基的准备：按所选商品的规格配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。

2. LB肉汤培养液的准备：同2.5.1.1.1中LB肉汤培养液的准备。

2.1.2.2实验过程（1）接菌：用2.5μL或10μL移液枪的枪头挑取麦康凯琼脂培养基上的单菌落，将枪头打到LB管中，标号，37±1℃温箱摇床上培养10-12h，200r；（2）划板：用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1℃温箱过夜培养；（3）用接种环挑取麦康凯琼脂培养基上的单菌落划到EMB板上，标号，37±1℃温箱培养18-20h；2.2菌株的鉴定2.2.1革兰氏染色镜检在麦康凯琼脂上长出红色的菌落，在伊红美兰琼脂上长出黑色、带金属光泽的菌落。

挑取典型菌接种于MH肉汤培养基，37± 1 ℃培养12-24 h，取出1接种环菌液进行固定、革兰氏染色和镜检，根据细菌形态和染色特点，将革兰氏染色为阴性、两端钝圆、无芽胞、中等大小的杆菌初步判定为大肠杆菌。

2.2.2菌株的生化鉴定1.实验准备生理盐水、液体石蜡高压进行灭菌，待用。

提前复活菌株，吸取30-50μL甘油保存菌液于LB肉汤，摇床培养3-5h（时间因菌株活性不同做适当调整，此步主要是保证菌株全部复活）。

纯化菌株：将LB肉汤复活的菌株接种到麦康凯板，37℃过夜培养，18-24h。

要求所有受试菌株必须是单一的菌落形态而且有单个菌落存在。

2.实验过程（1）接种前准备安瓿瓶：从包装盒中取出安瓿瓶，朝易折点(瓶颈上蓝点)反方向用力折开安瓿瓶，或用砂轮划一圈安瓿瓶瓶颈处，然后用力掰开安瓿瓶，插入安瓿瓶架或双面板中。

试管：从包装盒中取出试管，插入试管架中。

注：如果染菌或变色，则不能使用，重新拿一支。

折开安瓿瓶时最好包裹纱布，以免划伤手指。

（2）接种方法直接接种：用接种针从平板上挑取已纯化分离的菌落接种于需要试验的安瓿瓶（试管）中。

菌悬液法：取一内盛有2ml无菌水试管，用接种针从平板上挑取已纯化单个菌落至无菌水中仔细研磨制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液，滴入需要试验的试管（安瓿瓶）中，每管3滴。

注：如内容物为半固体或半固体生化管，采取直接穿刺接种。

（3）接种完后用封口膜封口放于37±1℃培养箱中培养或根据检测标准中所规定的培养温度进行培养。

注意，肠杆菌科葡萄糖鉴定管接菌后封口，倒放置进行培养；氨基酸类的要先用石蜡封口。

(4)读生化鉴定的结果，根据肠杆菌科细菌生化鉴定编码册查找到菌株的菌名以及阳性机率。

生化反应判断标准见表1，其中蛋白胨水需加靛基质溶液，苯丙氨酸需加三氯化铁溶液，之后观察颜色变化。

葡萄糖产酸为阳性变成黄色标记A，不产酸则为阴性颜色不变，产气则标记G，即产酸产气标记为AG，产酸不产气标记为A，产气不产酸标记为G。

果萄糖氨酸氨酸化氢白胨水糖茅醇丙氨酸素橼酸盐阴性紫色黄色黄色无色无色紫色紫色无色黄色绿色阳性黄色紫红紫红灰褐红色黄色黄色绿色环红色蓝色经生化反应鉴定为大肠杆菌者，用大接种环在接有分离纯化菌株的LB琼脂平板上轻轻刮取菌落，接到含1 mL 30%甘油肉汤的EP管中；放于-20 ℃冰箱中保存，便于后续实验用。

如要长久保存，可用磁珠式菌种保藏管于-80 ℃冰箱中保存菌株。

2.3药敏试验2.3.1药物的配制2.3.1.1实验准备1.储药管的准备：用50ml离心管做为储药管，其准备过程同2.5.1.1.1中分离管的准备。

2.虑管的准备：虑管用保鲜膜包好后放于烧杯中，报纸或牛皮纸封口，于121℃高压20min，烘干待用。

2.3.1.2实验过程本实验所用药品需要配制成浓度为5120μg /mL，体积40 mL。

（1）称药：根据所购药品的包装上的浓度计算所要称量的药品量。

如果包装上没有注明药品浓度可根据瓶装药品按5120×40/90% = 0.2276 g 称取；袋装药品按5120×40/95% = 0.2156 g 称取。

（2）溶解药品：根据每种药品的溶解方法来溶解以及定容称量好的药品；如氨苄西林（AMP）用超纯水溶解即可，然后定容到40ml；氯霉素（CHL）用95%的乙醇溶解后，定容到40ml；环丙沙星（CIP）用10%的醋酸溶解后，定容到40ml。

表2 抗菌药物的质控范围及稀释浓度梯度抗菌药物溶剂质控范围稀释浓度梯度氨苄西林AMP超纯水2-8 0.5-512头孢噻呋CTF PBS+PBC0.25-1 0.125-512头孢噻肟CTX超纯水0.03-0.12 0.008-512头孢他啶CTZ超纯水0.06-0.5 0.03-512头孢曲松CTR超纯水0.03-0.12 0.008-512头孢西丁CXT超纯水2-8 0.25-512庆大霉素GEN超纯水0.25-1 0.25-512卡那霉素KAN超纯水1-4 0.5-512四环素TET超纯水0.5-2 0.25-512环丙沙星CIP10%醋酸+超纯水0.004-0.015 0.004-512恩诺沙星ENR超纯水0.004-0.03 0.004-512萘啶酸NAL1mol NaOH+超纯水1-4 0.25-512链霉素STR超纯水2-8 0.5-1024阿米卡星AMI二甲基甲酰胺（DMF）+PBS0.5-4 0.25-512氟苯尼考FLF95%乙醇0.03-0.12 0.5-512氯霉素CHL95%乙醇+超纯水2-16 0.125-512喹乙醇OQX超纯水0.25-512（3）滤药：在无菌的条件下进行，将高压过的离心管、滤管，注射器，平皿，标签纸，镊子等在无菌超净台中紫外照射15min；①将配好的药液倒入平皿中，注射器抽取，用镊子在火焰上灭菌后夹取滤管的粗管处，安装到注射器上；②注入到高压过的储药管中；③用镊子将滤管取下，再抽取药液重复①②，直至药液完全滤完；过滤另一种药液时，要将平皿、注射器、滤管全部换新，不可重复用；④贴标签：要注明药品名称、浓度、配制时间；如 AMP 5120 μg /mL2013.4.2。

放于—20 ℃冰箱中，可保存半年之久。

2.3.2质控2.3.2.1实验准备MH肉汤培养液按其商品说明进行配制，配制好后于121℃高压20min，放于超净台中待用。

大肠杆菌标准菌株ATCC25922, 购自中国兽医药品监察所。

2.3.2.2实验过程（1）复活大肠杆菌标准菌（A TCC25922）：取大肠杆菌ATCC25922接入LB肉汤试管中37 ± 1 ℃温箱摇床中培养3-4h；（2）计算初始浓度：根据药品的质控计算出第一孔所要稀释的浓度；（3）第一孔中加入180μLMH肉汤，其余用排枪每孔加100μLMH肉汤，；（4）药液的稀释：用去离子水或MH肉汤稀释，初始浓度 = 512/（n + 2）以2μL药液为初量进行稀释，n为稀释药液所加MH肉汤的量；n:2即为药品稀释的倍数。

（5）加药液：取出稀释的药液20μL加入第一孔；每种药物做两行，96孔板的最后一行不加药液也不加菌液，作为阴性对照。

（6）倍比稀释：取第一孔100μL液体移加到第二孔，从第二孔开始倍比稀释，最后一孔吸取100μL弃去。

（7）加菌液：用排枪除最后一排外每孔加100μL菌液；（8）盖好96孔板，放于37±1℃温箱摇床中培养10-12h；（9）读取结果。

2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验参照2012版CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute，临床实验室标准研究所）指导原则和执行标准，用琼脂二倍稀释法，测定63株大肠杆菌对17种常用抗菌药物的敏感性。

用二倍稀释法把各种药物稀释到所需的各个浓度梯度，分别定量加入高压灭菌过的MH 琼脂在平皿中轻轻摇晃使之混合均匀，冷却凝固，制成含所需药物浓度的琼脂平板。

把稀释至含菌量约为1. 0 × 106CFU/mL 的菌液用微量多点接种仪接种到MH 琼脂平板上，于37 ℃培养箱中倒置培养16 ～ 18 h 后观察结果。

以完全不见细菌生长的最低药物浓度为该药物对细菌的最小抑菌浓度( Minimal inhibitory concentration，MIC) 。

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药敏试验的步骤

药敏试验的步骤

药敏试验的步骤药敏试验药敏纸片法药敏纸片法是最常用的一种试验方法,能直接体现出抗菌药物的抗菌效用,其优点是：直观明显,对比鲜明，有一定的实验依据。

缺点是：仅表现体外抗菌效果,由于抗菌药物在体内受体液环境,代谢分布,组织扩散浓度,半衰期等因素的影响,个别药物并不能真实反应出实际的抗菌疗效。

下面介绍抗菌药物的药敏纸片法。

试验材料经分离和鉴定后的纯培养菌株(例如大肠杆菌、链球菌等),营养肉汤,琼脂平皿,棉拭子,镊子,酒精灯, 药敏纸片若干。

1.1药敏纸片的制作方法将要试验的抗菌药物按其有效浓度稀释成1mL备用，脂溶性的抗菌药物使用乙醇或丙酮溶解。

用打孔器将滤纸打成6mm直径的圆片100张高压灭菌，加入到抗菌药物有效浓度1mL稀释液中充分混合，阴凉处干燥备用。

多种联合的抗菌药物制剂以其成分中某种含量最高的抗菌药物为标准稀释成有效浓度。

抗菌中草药药敏纸片的制作：取中草药粉剂1g加适量的水充分浸泡煮沸，滤液浓缩成1mL，也加入100张纸片干燥备用。

1.2药敏试验的操作步骤1.2.1 取自然发病动物的病料心血、脾、肝脏、淋巴结或病变明显的组织无菌操作接种鉴别培养基37℃分离培养24h，选典型菌落备用。

1.2.2 将病料中分离出的病原菌用密集划线法或涂布法接种至专用琼脂平板培养基上，均匀的粘贴各药敏纸片，并记录每种抗菌药物药敏纸片的位置。

1.2.3 37℃培养12～18h，取出观察结果。

1.3判定结果1.3.1 量取各药敏纸片抑菌直径大小，并仔细观察抑菌圈的清晰度,通常直径小于10mm的判为该抗菌药物为低度敏感,10～15mm之间为中度敏感，15～25mm为高度敏感，25mm以上为极度敏感。

1.3.2 抑菌圈边缘分界清晰，内部洁净透明,说明该抗菌药物作用迅速，多半为杀菌剂；边缘十分清晰，内部朦胧说明该抗菌药物可能是慢效抑菌剂或有耐药的产生，或分解较快维持抗菌时间短。

1.3.3 抑菌圈中分层次形成同心年轮样，说明可能是联合使用抗菌药物或该抗菌药物失效过快或细菌产生了耐药性。

药敏试验操作方法

药敏试验操作方法

药敏试验操作方法
药敏试验操作方法一般包括以下步骤：
1. 菌株选取：选择适当的病原菌株进行测试，一般使用已知药敏性的参比菌株作为对照。

2. 菌液的制备：将菌株接种到培养基上培养，培养至菌量合适后，采用生理盐水调制成适宜浓度的菌悬液。

3. 菌液的稀释：取一定数量的菌悬液，根据草浆法或直接法进行适当稀释，使菌量达到目标细菌的浓度，一般为0.5-2×10^8个CFU/mL。

4. 抗生素的制备：按照制备好的抗生素试纸或试剂盒的说明，将抗生素溶液或药片溶解成合适浓度的抗生素溶液。

5. 稀释菌液的扩散：将已制备好的菌液均匀涂布在含有良好的抗生素稀释浓度梯度的培养基上。

6. 培养基的培养：将涂布了菌液的培养基在合适的温度（通常为35-37）下培养约16-20小时。

7. 结果的解读：通过观察培养基上微生物的生长情况，判断细菌对抗生素的敏
感性。

一般，对抗生素敏感细菌培养后，会在培养基上形成清晰的抑菌圈，直径会随着对菌体敏感程度的增加而扩大。

8. 数据记录和分析：记录抗生素的名称、浓度、菌株信息、抗菌圈直径等数据，并进行统计和分析。

需要注意的是，药敏试验的具体操作方法可能会因实验目的、试验样本、试剂等因素而有所不同，因此在进行药敏试验前应详细阅读试剂盒或试纸的使用说明，并按照说明书操作。

大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案

大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案

鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。

1 病料采集1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。

1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。

1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。

将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。

都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。

将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。

2 菌的分离培养及鉴定2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。

培养基：A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1），B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。

），C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。

2．2 样品触片镜检涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。

2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。

2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。

一例孔雀大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验分析

一例孔雀大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验分析

一例孔雀大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验分析一、实验目的：了解孔雀大肠杆菌的分离、鉴定及药敏试验方法，掌握细菌学的实验技能。

二、实验原理：1、孔雀大肠杆菌是一种强致病性的肠道病原菌，引起各种疾病。

2、分离方法：运用细菌学的分离技术，将样品经过适当的处理后，接种到含有适宜培养基的培养皿中，并能够选择性地分离出孔雀大肠杆菌。

3、鉴定方法：定义特定的生化特征，使得与该菌密切相关的物质也能够被检测到。

常用的鉴定方法包括酸生产、气体生成、蛋白分解等。

4、药敏试验方法：通过对孔雀大肠杆菌进行不同的药物敏感性试验，以便筛选出最佳的治疗方案。

三、实验步骤：1、样品采集：采集饮食、水源、分泌物等样品。

2、分离培养：将样品处理后接种到营养琼脂平板中，放置于37℃的孵育箱中；24小时后，嫩白色的菌落将出现在琼脂平板表面。

3、鉴定：取少量细菌放到琼脂饼中，利用酸生产，气体产生、蛋白分解等反应进行鉴定。

4、药敏试验：对孔雀大肠杆菌进行药物敏感性试验，以便找出最佳的治疗方案。

四、实验结果：1、分离结果：样品中分离出嫩白色的菌落，证实样品中含有孔雀大肠杆菌。

2、鉴定结果：样品中分离出孔雀大肠杆菌，并通过酸生产、气体产生、蛋白分解等方法鉴定出该菌种。

3、药敏试验结果：孔雀大肠杆菌对盐酸多西环素、甲硝唑、磺胺、氨苄西林等抗菌药物敏感，对青霉素、环丙沙星、庆大霉素等药物耐药。

五、实验分析：1、该实验成功地分离出了样品中的孔雀大肠杆菌。

2、孔雀大肠杆菌对某些抗菌药物具有耐药性，药敏试验结果提示其对青霉素、环丙沙星及庆大霉素等药物比较耐药，建议在治疗过程中避免使用这些药物。

3、用于孔雀大肠杆菌药敏试验前，药物浓度、孔径的选取要科学合理，保证药敏试验结果的准确性和可靠性。

六、注意事项：1、在实验中操作要细心、仔细，注意个人防护。

2、所有培养皿要完好无损，无裂缝、污染和漏洞。

3、样品处理要完全避免菌落的污染，以免影响实验结果。

4、在实验过程中要遵守消毒等规定，保持操作区域的整洁干净。