trizol提DNA

CTAB法提取DNA及注意事项0.1g菌丝体（植物新鲜组织）+ CTAB+适量石英砂研磨－→混匀－→ 65℃水浴1 h－→ 冰浴10min－→ 离心取研磨液于1.5mL 离心管－→ +700μL苯酚，混匀（5~20min）－→ 离心15min(10,000r) －→取上清液三次－→ +500μL（等体积）氯仿，混匀5—10 min－→ +离心15min －→取200μL上清液2次－→ 400μL异丙醇（等体积）上下颠5次，静置15min,离心10min－→去溶液，+700μL70%乙醇－→摇晃、离心10min－→去溶液，倒扣于纸上至酒精及水分挥发完原理及注意事项：1、加CTAB研磨：这一步骤是使得细胞裂解，CTAB是离子型表面活性剂能溶解细胞膜及核膜蛋白，使核蛋白解聚、DNA游离。

（注意：若是用液氮研磨，则加CTAB前需将CTAB65℃预热，因为当环境温度低于15℃时，CTAB析出，加冰冷样品前需预热。

在液氮中研磨使材料易于破碎，减少酶的作用）2、水浴过程中每需10 min混匀一次，使样品裂解充分。

3、加氯仿：异戊醇（24:1），使蛋白质变性、抽提液分相，核酸水溶性强，离心可除去细胞碎片及大部分蛋白质。

4、取上清液（400微升，避免吸油层），RNA提取（提前分装75%乙醇-DEPC及DEPC水）Trizol一步法1. 100 mg 叶片，液氮研磨（进口2 mL 管）。

2. 加入1 mL左右（800 μL）Trizol抽提液，摇匀，静置5 min （室温）。

3. 按每mL Trizol提取液加入200 μL 氯仿，剧烈震荡15 s ，室温静置5 min （3 min）。

4. 1,2000 r ,4℃离心15 min （提前将离心机调至4℃，盖上盖子，按下short键）。

取400-500μL 上清液（1.5 mL进口），加入等体积（500-600μL）异丙醇，颠倒混匀，-20℃，20 min （可省）。

用Trizol提取DNA1、将残留在中间相上层的水相全部移除，这对于提取的DNA的质量至关重要，2、均一化时，每1ml的trizol试剂中加300ul 100%的乙醇，3、盖盖，多次颠倒样本混匀4、室温下孵化样本2-3min5、 4 ℃下以2000xg离心5min6、将酚-乙醇上层液移除，如果要求提取蛋白就将上层液移到一个新的管中。

上层液可以在-70℃条件下保存几个月。

7、继续用DNA洗脱步骤洗脱DNA颗粒1)每1mltrizol试剂用1ml柠檬酸钠或者乙醇溶液（10%乙醇加入0.1M的柠檬酸钠，PH 为8.5）用于初步均化2)室温下孵育30min,偶尔轻柔的颠倒混合物，（注意：DNA可以储存在柠檬酸钠和乙醇溶液中至少2小时）3) 4 ℃下以2000xg离心5min孵育，移除和废除上清液4)重复洗脱（步骤1-3）注意：大的DNA颗粒（>200ug）重复洗脱两次5)每1ml trizol试剂加1.5-2ml的75%的乙醇，用于均化（注意DNA样本可以储存于4 ℃下的75%乙醇几个月）6)室温下可以孵化10-20min,偶尔轻柔的颠倒混匀管7) 4 ℃下以2000xg离心5min孵育，移除和废除上清液8)通过空气或者真空干燥DNA颗粒5-10min。

不允许DNA颗粒太干燥，不要通过真空离心干燥DNA颗粒。

9)重悬浮DNAa)每50-70mg的组织或者1*107的细胞加8Mm的NAOH0.3-0.6ml。

（注意：因为提取的DNA在水或者Tris缓冲液中不能很好地重新混匀，强烈建议在弱碱条件下悬浮DNA）b)4 ℃下以12000xg离心样本10min，来移除任何不溶的材料c)将包含DNA的上清液转移至一个新的管中，用HEPES来调节需要的PH，进行下游选择的应用。

DNA可以在4 ℃下储存过夜，但是为了长期存储，用HEPES调节PH至7-8，加1mM的EDTA,储存在4 ℃或者20 ℃下。

TRIzol法同时提取RNA,,蛋白质TRIzol法同时提取RNA,,TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。

TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\\．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收；用异丙醇沉淀有机相可回收。

TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。

对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。

分离的总RNA无和污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。

在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。

共纯化的可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。

可用于Western Blotting。

规格：100ml 黄色透明液体储存条件：2-8℃避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。

如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。

忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。

预防RNase污染注意事项：1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱 4℃ 3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、管、200μl EP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在管中，4℃保存。

2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。

3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。

注：均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。

均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。

b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。

TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。

TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。

步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的 PBS 清洗 1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。

2.收集标本悬浮于 EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。