质粒DNA提取实验常见问题解答1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块,导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液I :50mM 葡萄糖，25mMTris-HCI(pH8. "0)，10mMEDTA(pH8."0)。
1MTris-HCI<!--[if !supportAnnotations]-->[t1]<!--[endif]--> (pH8."0)12."5mI，0."5M EDTA(pH8.0）10ml，葡萄糖4."730g,加ddH20至500ml。
在10lbf/in2 高压灭菌15min，贮存于4C。
基因组DNA提取步骤1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中，剪碎；2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润，入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）；3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min；4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后，4℃13000转/分离心10min；5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min；7.4℃13000转/分离心15min，弃上清；8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上清；9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。
利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。
在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。
一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
dna提取方法DNA提取方法。
DNA提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从生物样本中分离出DNA分子的过程。
DNA提取方法的选择对后续实验结果有着重要影响，因此需要根据具体的实验目的和样本类型选择合适的提取方法。
下面将介绍几种常用的DNA提取方法。
1.酚/氯仿提取法。
酚/氯仿提取法是最早应用的DNA提取方法之一，它利用酚和氯仿的不同密度来分离DNA、RNA和蛋白质。
首先，将生物样本溶解在盐溶液中，然后加入等体积的酚/氯仿混合液，混合均匀后离心。
DNA会沉淀在上清液和酚层之间的界面上，可以用吸管或者移液器将其吸取出来。
这种方法操作简单，适用于提取中小片段的DNA。
2.离心柱法。
离心柱法利用离心柱中的硅胶膜或硅胶颗粒来吸附DNA，通过离心将其他杂质分离。
首先，将生物样本溶解在裂解液中，然后加入乙醇使DNA沉淀，将混合液加入离心柱中，离心后DNA会被固定在柱子上，然后通过洗涤和离心的步骤去除杂质，最后用去离子水洗脱DNA。
离心柱法提取的DNA纯度高，适用于高通量实验。
3.磁珠法。
磁珠法是近年来发展起来的一种DNA提取新方法，它利用表面修饰的磁珠与DNA的亲和性来实现DNA的分离纯化。
首先，将生物样本与磁珠混合，磁珠上的表面修饰物能够与DNA结合，然后利用磁力将磁珠与DNA一起沉淀，将上清液去除，再进行洗涤和溶解步骤，最后用磁场将磁珠与DNA分离。
磁珠法可以高效地提取DNA，并且适用于自动化操作。
4.酶解法。
酶解法是一种通过酶的作用来分解细胞壁和膜，释放DNA的方法。
首先，将生物样本加入含有蛋白酶和细胞壁裂解酶的裂解液中，经过一定时间的酶解后，细胞壁和膜会被破坏，DNA被释放出来。
然后通过加入蛋白酶抑制剂来停止酶的作用，最后进行离心等步骤来分离DNA。
酶解法适用于提取含有细胞壁和膜的样本。
综上所述，DNA提取方法的选择应根据实验的具体要求和样本的特点来确定。
不同的提取方法有着各自的优缺点，科学家们可以根据实际情况选择合适的方法来提取DNA，以保证后续实验的顺利进行。
