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组织总RNA提取--用于miRNA分析(TRIZOL)

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组织总RNA提取（TRIZOL）
器具和耗材
加样器一套、匀浆机、离心机
RNase-free的2ml管、RNase-free的各种规格吸头（1ml、200ul、10ul）
镊子、研苯、保温杯
试剂：
Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase-free水
操作步骤：
A 准备工作
1．至少在实验前2小时将清洗干净的研钵加入适量酒精,点燃；
2．清理实验台面，清除易燃物品；
3．根据样品编号清晰标记RNase-free的1.5ml管；
4．每管加1.2mlTrizol试剂，盖好盖子；
5．将冻存样品从-70℃冰箱转移至装有液氮的保温杯中。

B 组织研磨和匀浆
1. 取冰冻组织材料50－100mg置于放有液氮的研钵中，在研钵中加液氮研磨成粉末（尽
量细），注意持续补充液氮；（如果组织块很小，一般不用研钵研磨，直接加入Trizol，用匀浆器匀浆。

）
2. 用在液氮中预冷的1ml吸头转移组织粉末至已装有1.2mlTrizol的离心管中，迅速摇
开冰冻组织;
3. 立即用组织匀浆机匀浆，如果没有组织匀浆机可用V otex；
4. 匀浆后置于室温静置5分钟（或更长）。

C 氯仿抽提去除蛋白和DNA
1.加入300ul氯仿（每毫升Trizol加0.2ml氯仿），剧烈震荡混匀，室温静置10分钟
或更长。

2.12000g，4℃离心15分钟
D 沉淀、溶解RNA
1.将上清液转移到新的
Trizol加0.5ml
miRNA的得率）；
温搁置10
得率）。

2.12000g，4℃离心30分钟（一般，离心10分钟即可，但如果离心时间为20-30分
钟，会增加RNA尤其是miRNA的得率。

另外，我们在提取总RNA用于miRNA
分析时，这一步使用25000×g离心15分钟）。

3.小心去掉上清液，沉淀用2ml 的75%乙醇洗涤（将沉淀飘浮起来即可），不需打碎。

4.12000g，4℃离心15分钟。

（我们在提取总RNA用于miRNA分析时，这一步使用
25000×g离心10分钟）
5.弃掉乙醇，室温干燥沉淀3分钟（注意不要过渡干燥沉淀，否则难以溶解），视沉
淀多少将其溶于适量DEPC水中，分装一部分用于质量检测，其余冻存于-70℃冰
箱中备用。

F RNA质量检测
1. 取1μl样品，1％琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。

如果28S和18SrRNA条带清晰
整齐，且28S条带的亮度是18S的两倍，说明RNA完整性较好。

2. 浓度测定：取1μl样品，稀释至50ul，测定OD260和OD280及其比值。

若OD260/
OD280>1.8，说明RNA纯度较好。

对于RNA样品：OD260的值为1时，RNA的浓度为40μg/ml,
即：1 OD260=40μg/ml RNA, 所以如果稀释倍数为200，则：
RNA样品浓度= OD260 ×40μg/ml ×稀释倍数
= OD260 ×40μg/1000μl × 200
=OD260×8（μg/μl）
G 提取RNA注意事项
①Trizol用量为材料的10倍体积，材料过多易造成降解。

研磨材料时要保持低温，以
防RNA降解。

②RNA干燥时间过长则不易溶解，注意当沉淀边缘变模糊时即可停止干燥，开始溶解。

③实验中所用有机废液应倾倒至指定容器中，以免腐蚀下水管道。

④Trizol有一定毒性，避免接触皮肤和眼睛。

附RNA电泳图谱：。

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TRIZOL说明书

TRIZOL说明书

trizol 中文说明书trizol 试剂是一种从组织及细胞中提取总rna的专用试剂。

这种试剂是一种酚和硫氰酸胍的单相溶液，是将chomczynski 和sacchi发明的一步rna提取法的改进。

在样品匀浆或分析过程中，trizol 试剂可在分裂细胞及溶解胞膜的同时保持rna的完整。

在匀浆后加入氯仿，可将溶液分为水相和有机相。

rna均在水相中。

吸取水相加入异丙醇，得到rna沉淀。

去除水相后，样品中的dna及蛋白质可通过进一步连续的沉淀而得到。

中间相加入乙醇可沉淀dna而有机相加入异丙醇则能沉淀出蛋白质。

dna的再纯化可能对标化样品的rna产量有作用。

2．这一技术可以用于人，动物，植物或细菌株的微量组织（50—100mg）及细胞（5×106），也可以用于大量检材（≥1g）及细胞(﹥107).该方法简便易行,可用于同时检测大量样品,全部过程1小时内可以完成.用trizol 试剂分离的rna 没有dna及蛋白质成分.这种rna可用于northern印迹分析,斑点杂交,多聚(a)+检出及vitro转移, rna酶蛋白分析及分子克隆.用于pcr反应时,当两个引物位于同一外显子时应用扩增特异dna酶i处理提取出的rna.3． trizol 试剂可用于分子量从大到小的各种rna的提取.例如,大鼠肝脏提取出的rna,经琼脂糖凝胶电泳,eb染色后可显现出7kb和15kb的大分子量的rna谱带(包括mrna和hnrna), 位于～5kb(28s)和～2kb (18s)的两条主要的核糖体rna谱带及大小在0.1kb-0.3kb之间的低分子量rna(trna,5s).分离出的rna当溶于双蒸水中时a260/280为1.6-1.8之间.每毫克组织所能提取的rna量约为:肝和脾,6-10μg;肾,3-4μg;骨骼肌和脑,1-5μg;胎盘,1-4μg.从1×106培养细胞中提取的rna量约为:上皮细胞,8-15μg;成纤维细胞,5-7μg.需要但未提供的试剂:1. 氯仿2. 异丙醇3. 75%乙醇(depc处理水配制)4. 无rna酶水或0.5%sds溶液(制备无rna酶水:将水倒进无rna酶的玻璃容器中,加入depc至0.01%(v/v)放置过夜后高压灭菌). sds溶液必须用depc处理后高压灭菌的水配制.rna分离提取步骤:1．匀浆a. 组织每50-100mg组织加入1ml的trizol 试剂后用匀浆机或玻璃棒匀浆。

组织细胞总RNA提取步骤及方法

组织细胞总RNA提取步骤及方法

组织细胞总RNA提取步骤及方法细胞总RNA提取是一种常用的实验技术，用于分离和提取细胞内的总RNA。

以下是一种常用的细胞总RNA提取方法的步骤：1.收集细胞样品：根据实验需要，收集适量的细胞样品。

可以选择培养细胞、悬浮细胞或组织细胞等。

2. 细胞溶解：将细胞样品转移到离心管中，并使用适当的缓冲液（如TRIzol）进行细胞溶解。

缓冲液中的离子和表面活性剂能够破坏细胞膜，使RNA释放到溶液中。

3.加入氯仿：向细胞溶解液中加入等体积的氯仿，并轻轻倒置离心管混匀。

氯仿会与缓冲液中的酚类结合，形成有机相和水相。

4.离心分离：将混合液在高速离心下离心10-15分钟，使其分成有机相（上层）、界面层（中间层）和水相（下层）。

RNA主要分布在界面层和水相之间。

5.收集上清液：使用滴管、移液器等工具小心收集上层的有机相液体，并转移到新的离心管中。

这一步的目的是尽可能减少界面层和下层的干扰物。

6. 沉淀RNA：将等体积的异丙醇（isopropanol）加入上清液中，并轻轻倒置离心管混匀。

异丙醇能够沉淀RNA，将其从溶液中去除。

7.离心分离：将混合液在高速离心下离心10-15分钟，使RNA沉淀在离心管底部形成一个白色沉淀。

8.去除上清液：小心将上清液倒掉，避免损失RNA沉淀。

9.RNA洗涤：使用70%乙醇洗涤RNA沉淀，将沉淀中的杂质去除。

10. 重新溶解：将洗涤后的RNA沉淀用RNase-free水或缓冲液中重新溶解，以便后续实验使用。

注意要避免酶的污染。

以上是一种常见的细胞总RNA提取方法的步骤。

这个方法简单、操作方便，并且能够高效地提取细胞内的总RNA。

根据实验需要，也可以根据具体步骤来进行微调和改进。

RNA提取步骤trizol法

RNA提取步骤trizol法

Trizol-RNA提取步骤
1；取1.5ml去核酸酶EP管，分别加入250ul样品和750Trizol裂解液剧烈震荡30S，室温静置10min。

；
2；直接往EP管中再加入200ul三氯甲烷（氯仿），剧烈震荡混匀30S 直至无分相出现，室温静置5min。

3；把样品放入事先预冷的离心机中，12000rpm,4℃离心15Min。

小心将样品取出。

4；另取干净的去核酸酶EP管，分别往EP管中加入600ul异丙醇。

将离心完后的样品管中的上清液（约600ul左右）小心转移到装有异丙醇的管子中并轻轻上下颠倒混匀，4℃静置10min.（注意：吸取上清液时严禁吸到中间蛋白层或下层液。

）
5；将样品放入预冷的离心机中12000rpm,4℃离心10Min.小心把样品管取出并轻轻倒掉上清液。

6；往样品管中加入1ml 75%乙醇溶液（DEPC水配制）。

轻轻上下颠倒几次，12000rpm,4℃离心5Min。

小心把样品管取出并轻轻倒掉上清液。

7；把样品放入抽干机中60℃抽干5-7分钟。

（或者尽量把乙醇去除干净后室温晾干10-15min直至乙醇挥发干净）。

此步骤勿关闭管盖。

8；将抽干好的样品取出，并根据需要加入20-50ul DEPC水（或Elution Buffer）溶解沉淀物。

此溶液即为总RNA溶液。

Trizol法提取细菌总RNA

Trizol法提取细菌总RNA

实验三Trizol法提取细菌总RNA一、实验原理Trizol要紧物质是异硫氰酸胍，它能够破坏细胞使RNA释放出来的同时，爱惜RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

搜集上面的的水样层后，RNA 能够通过异丙醇沉淀来还原。

不管是人、动物、植物仍是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)和大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离成效。

Trizol试剂操作上的简单性许诺同时处置多个的样品。

所有的操作能够在一小时内完成。

Trizol抽提的总RNA 能够幸免DNA和蛋白的污染。

二、要紧试剂和器材Trizol 溶液氯仿异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水超净工作台 2.0 mL离心管（无Rnase）移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌三、实验步骤（一）. 采纳 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA1. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培育至稳按期，取菌液2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体；二、每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，猛烈振荡15 s，室温静置5 min 4℃，12000 g，离心 10 min；取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中；3、每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，猛烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；警惕吸取上层水相，转入另一新的 2.0mL 离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。

）4、加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，猛烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃，12000 g，离心 10 min；警惕吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管；五、加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)，轻轻倒置混匀；室温，静置 10 min；4℃，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；警惕吸去上清；六、加1 mL75%的乙醇(预冷)，并轻柔倒置，洗涤沉淀；4℃，7500 g，离心 5 min；警惕弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min；7、各管用 30μL DEPC 处置过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5 min，分装，-80℃贮存(可贮存5周)；（二）. RNA 浓度的测定取10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，警惕排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中别离测定 260 nm、280 nm 的光吸收值，依照公式计算 RNA 的浓度。