第28卷第5期河南工业大学学报(自然科学版)Vo.l 28,N o .52007年10月Journa l o fH enan Un iversity of Techno l o gy(N atural Sc i e nce Edition)O c.t 2007收稿日期:2007 06 05基金项目:国家863项目(2006AA02Z216)作者简介:黄金(1979 ),男,安徽利辛县人,博士研究生,主要从事代谢调控方面的研究.*通讯作者文章编号:1673 2383(2007)05 0088 05L-苏氨酸的生产方法及研究进展黄 金,徐庆阳,陈 宁*(天津科技大学天津市工业微生物重点实验室,天津300222)摘要:介绍了L-苏氨酸的理化性质、用途、生产方法,重点介绍了发酵法生产L-苏氨酸的生产现状.依据代谢调控理论综述了L-苏氨酸生物合成调控机制及研究实例,并对L -苏氨酸市场前景进行了展望.关键词:L-苏氨酸;生产方法;研究进展中图分类号:TS201 2 文献标识码:A0 L-苏氨酸的理化性质苏氨酸(Threon i n e)化学名称为 -氨基- -羟基丁酸,1935年由W.C .Rose 在纤维蛋白水解物中分离和鉴定出来.1936年,M eger 对它的空间结构进行了研究,因结构与苏糖相似,故将其命名为苏氨酸[1].苏氨酸有4种异构体,天然存在并对机体有生理作用的是L-苏氨酸[2].其化学结构式为:图1 L-苏氨酸结构式分子式为C 4H 9NO 3,相对分子质量为119.12,熔点为255~256 ,比旋光度[ ]20D=-25.0~-29.0 (5m ol/L H C l),白色晶体或结晶性粉末微甜;解离常数p K COO H =2.15,p K N H2=9.12,等电点p I(25 )=5.64,溶解度为20g /100m L 水(25 ),不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂.1 L-苏氨酸的应用在人体和动物所需的8种必需氨基酸中,苏氨酸是仅次于蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸的第4种氨基酸[3-6].苏氨酸在人的生长发育中发挥越来越重要的作用,被广泛应用于食品工业、饲料工业、以及医疗等方面.在食品方面,由于当前食品加工度高、生产量大、保存期长、流通领域广,营养素容易受到破坏和损失,需要加以补充.因此,食品强化剂在食品工业中的重要性日益突出,氨基酸类强化剂在食品强化剂生产中占有重要的地位.苏氨酸与葡萄糖共热可产生焦香味,有增香作用.一般与其他氨基酸合并用于强化谷物,有时也用于糕点、婴儿食品、牛奶中,起抗氧化作用[7].在饲料添加剂方面,苏氨酸和赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸一起列为4大饲料添加剂,主要用于未成年仔猪和家禽等.苏氨酸是畜禽饲料中的重要元素,在畜禽饲料中添加苏氨酸,能提高饲料蛋白质的生物学价值,平衡各种氨基酸,促进蛋白质沉积,降低动物氨的排泄,减轻环境污染,改善饲养条件.在医药工业方面苏氨酸应用也十分广泛,其铁盐可作抗贫血药,可用于配置氨基酸输液和综合氨基酸制剂,同时其自身还具有促进人体发育和抗脂肪肝的药用疗效,也是制造高效抗生素单酰胺菌素的中间体,以及用于生化研究.在临床上苏氨酸还具有提高免疫的功能:苏氨酸有促进骨髓T 淋巴细胞前体分化发育成为成熟T 淋巴细第5期黄 金等:L-苏氨酸的生产方法及研究进展89胞的作用.苏氨酸是谷蛋白中第二限制性氨基酸,它的分子结构中含有羟基,对人体皮肤有保湿作用.在膜蛋白中苏氨酸的羟基能与寡糖链结合,对保护细胞膜起重要作用.此外,苏氨酸代谢生成甘氨酸,提供一碳单位.另外,苏氨酸是11种、14种、17种、18种、20种氨基酸大输液的主要成分之一.氨基酸大输液常用于手术前后、创伤、烧伤、骨折、营养不良、慢性消耗性疾病等的辅助治疗,在临床方面有着广泛的应用.2 L-苏氨酸生产方法研究进展L-苏氨酸的生产方法有蛋白质水解法[8]、化学合成法[9]和直接发酵法[10].蛋白质水解法和化学合成法因其存在种种弊端,工业化生产已经基本不再使用.直接发酵法以其生产成本低、资源节约、环境污染小等优点逐渐成为工业化生产L -苏氨酸的主要方式.2.1 蛋白质水解提取法苏氨酸主要以L 型存在于血粉、角蹄、玉米麸质粉、棉籽饼、丝胶等天然蛋白质中,可将上述蛋白质经水洗、搅碎、干燥、酸解得水解液经浓缩得浓缩液,用活性炭脱色、上柱,接收液作纸层析,收集苏氨酸部分.但该方法存在不少问题,操作复杂,需处理大量洗脱液,最主要的是苏氨酸在这些蛋白质中含量较低,尤其是提取目标氨基酸时,其他氨基酸作为废料处理掉,造成资源的浪费.2.2 化学合成法苏氨酸的化学合成路线,主要有巴豆酸法、乙酰乙酸乙酯法、甘氨酸铜法及不对称环氧化法等,其中路线较短、收率较高、具有较高工业价值的方法是甘氨酸铜法.2.2.1 巴豆酸合成法巴豆酸在乙醇中进行汞化反应,再经溴化、脱汞、氨化得DL-苏氨酸.该法反应条件缓和、产率也不低,但步骤较繁、溶剂成本高,加之含汞废液处理困难等,使其利用价值不大.2.2.2 乙酰乙酸乙酯合成法将乙酰乙酸乙酯氨化、还原,即可得DL-苏氨酸,该路线反应条件要求高,且产率低.2.2.3 甘氨酸铜合成法甘氨酸由于与Cu 2+络合,生成螯合物,从而增强了 氢的酸性,更利于其与乙醛缩合,最终脱去铜,生成DL-苏氨酸.Cu 2+起到了催化剂的作用.也有用五水硫酸铜或氯化铜与甘氨酸和乙醛来制备的.Aune 则采用中间体双(2,5-二甲基-4-恶唑烷羧酸酯)二水合铜,与甘氨酸反应合成DL-苏氨酸.这样,可以较大地提高产率.但成本也大大增加了.通常,采用廉价的Cu(OH )2CO 3和CuC l 2为催化剂.合成路线如图2.图2 甘氨酸铜合成路线2.2.4 不对称环氧化法不对称环氧化法,具有选择性高的优点,但由于其反应过程复杂,原料成本太高,难以实现工业化生产.该法以C H 2C HC H (OH )C H 3为原料,双键经环氧化后,与phCONCO 反应,生成五元杂环化合物,再酸化开环,生成DL-苏氨酸.2.2.5 非水相反应合成以苯为溶剂,将氰基乙酸丁酯与乙醛,在30~35 搅拌反应6h ,经过滤,酸化滤液,可得88%的苏氨酸.上述几种方法,各有优劣,其中甘氨酸铜合成法得到普遍使用.该法成本低,合成路线短,产率高(以甘氨酸计,可达80%以上).但铜盐的回收再利用,离子交换脱铜过程繁杂、且洗脱液不易浓缩.2.3 微生物发酵法直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需要的氨基酸的能力,通过对特定微生物的诱变处理,选育出营养缺陷型或结构类似物抗性菌株,以解除代谢调控中的反馈抑制和反馈阻遏,从而达到过量积累某种氨基酸的目的[11].随着基因工程技术的发展、工业微生物生物化学信息的增多、特别是工业生物载体系统的成功构建,从上世纪70年代末起前苏联研究者开始用基因工程技术构建苏氨酸菌种[6],为优良的L -苏氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障,使微生物直接发酵法生产L -苏氨酸成为一种廉价的工业化生产方法.90 河南工业大学学报(自然科学版)第28卷2.4 L -苏氨酸代谢调控育种研究2.4.1 L-苏氨酸合成及调控机制由L-天冬氨酸为起点产生L-苏氨酸和L -异亮氨酸的生物合成途径如图3所示.图3 L-苏氨酸生物合成途径及调控机制 整个合成途径中含有两大节点,即由L-丁氨醛酸合成L-赖氨酸或高丝氨酸以及由高丝氨酸合成L-甲硫氨酸或L-苏氨酸直至L-异亮氨酸.前一节点两条途径的代谢流的流向由高丝氨酸脱氢酶(H D)和二氢吡啶二羧酸合成酶对其共同底物丁醛氨酸的相对亲和性控制.这两个酶的编码基因分别为ho m 和dapA.在正常情况下,HD 的第五亲和性以及转化率是其竞争对手二氢吡啶二羧酸合成酶的25倍,因此碳源主要流向苏氨酸-甲硫氨酸生物合成途径.但当生产菌细胞内L-苏氨酸大量积累时,由于HD 对L-苏氨酸的变构抑制作用极为敏感,从而导致丁氨醛酸优先合成赖氨酸[12-15].L-苏氨酸的代谢调控机制中二氨基庚二酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸及异亮氨酸中的碳原子都来源于天冬氨酸.其共同途径的第一步是由3种不同的门冬氨酸激酶所催化的.天冬氨酸激酶I 能被苏氨酸抑制,它的合成被苏氨酸及异亮氨酸所阻遏.天冬氨酸激酶II 的合成则被甲硫氨酸所阻遏.而赖氨酸则能抑制天冬氨酸激酶!的活性,并且阻遏其合成.从丁氨醛酸到高丝氨酸的则由两种不同的高丝氨酸脱氢酶所催化的,高丝氨酸脱氢酶I 的合成可被苏氨酸及异亮氨酸阻遏,其中苏氨酸又能抑制其活性;而高丝氨酸脱氢酶I 的合成由甲硫氨酸所阻遏[16-17].2.4.2 育种实例20世纪50年代日本的志村、植村两位教授采用添加前体物的方法发酵生产苏氨酸.国外从60年代就开始有直接发酵法生产L-苏氨酸的报道.70年代末苏联的研究者们用基因工程菌规模生产L-苏氨酸.国内从1982年才开始有L -苏氨酸产生菌选育的报道,黄和容等报道了以钝齿棒杆菌(C orynebacteri u m crenatum )为出发菌株选育苏氨酸产生菌,产量为13g /L ;1986年檀耀辉等报道以乳糖发酵短杆菌(B revibacterium lacto fer m entum )出发选育出一株L-苏氨酸产生菌,在适宜条件下发酵72h 可产酸16g /L ;1990年沈阳药学院的常尊学等用亚硝基胍(NTG )和紫外线(UV )诱变处理黄色短杆菌获得一株苏氨酸高产菌株ME7(AHV rAEC rM et E th s),在含有葡萄糖10%的培养基中发酵48h 可积累L -苏氨酸17.9g /L.2000年韩国K.-H.Song H.-H.Lee 等构建一耐高盐浓度菌株H S528在5L 罐发酵产酸可达74g /L .2002年华东理工大学沈琼构建苏氨酸基因工程菌E.coli V NBk B -3507发酵48h 产酸52.7g /L .2005年广东肇庆星湖生物科技公司的王焕章、吴新等人利用大肠杆菌K12通过同源重组缺失苏氨酸脱氨酶基因,筛选L-Ile 营养缺失菌株,导入苏氨酸操纵子质粒,获得基因工程菌E.coliTHR 6,发酵32h 产酸可达75g /L .2006年韩国的M an -H yo ,H ong -W eon Lee 等利用蛋氨酸缺陷菌大肠杆菌MT201,添加生物素和蛋氨酸发酵33h 产酸可达80.2g /L .3 L-苏氨酸市场概况及展望苏氨酸为一种重要的氨基酸,主要用于医药、食品强化剂、饲料添加剂等方面.近年来,国内外市场对苏氨酸的需求逐年强劲增长,国际市场年增长率达到20%多.我国市场多年来对苏氨酸的需求平衡,近几年市场开始升温.国内生产不能满足市场需求,每年都需大批进口.预计今后国内外市场对苏氨酸的需求量还将以较大比率上升,短期内国内市场供需矛盾无法根本解决,仍需进口.因此,开发苏氨酸市场前景看好.最近几年,全球苏氨酸市场以每年20%多的增长率高速增长,亚洲、北美等地区的需求快速增长.需求的旺盛拉动了生产,1993年,全世界苏氨产量为4000,t 1996年为5000,t 1999年猛增至2.5万,t 2001年达3万,t 2002年达4万,t 目前约为5万,t 比10年前增长了10倍左右.全世界主要的苏氨酸生产企业为日本味之素公司、德国德固赛公司、美国AD M 公司、日本协合发酵工业公司等.这几大公司的产量占全球份额的90%左右.其中,日本味之素公司是世界上最大的苏氨酸生产企业,多年来该公第5期黄 金等:L-苏氨酸的生产方法及研究进展91司生产的苏氨酸占据全球市场60%以上的份额.日本协合发酵工业公司和美国AD M公司分别拥有1万t和5000t的苏氨酸生产规模.近年来,这两大企业密切合作,拟共同投资生产苏氨酸等氨基酸产品.此外,韩国希杰公司、Che il三星印尼公司等也生产苏氨酸.由于市场持续热销,各公司都有意扩大苏氨酸的产能,以满足市场需求.未来的苏氨酸市场仍有多个增长点,发展空间广阔.首先,在饲料添加剂方面的用量将持续大量增加.近10多年来,我国饲料工业产量平均年增幅达到2位数.现在全国饲料年产量已超过亿吨,成为世界第二大饲料生产国.预计到2010年,我国各种饲料添加剂的产量将达300万,t市场对苏氨酸的需求量将达到6万~8万.t其次是医药及其他领域.氨基酸大输液一直是临床用量很大的品种,苏氨酸是其主要成分之一.近年来多种氨基酸饮料正在欧美、日韩等发达国家流行,今后将向我国等发展中国家扩展.氨基酸在化妆品特别是中高档化妆品中的用量也在增多.此外,多种氨基酸片剂及口服液等保健产品现已在我国市场上崭露头角,∀瑞年#、∀万基#∀金日#等品牌的多种氨基酸保健品市场销售状况良好.各种营养食品对氨基酸的需求也在增加.参考文献:[1] 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![一种从L-苏氨酸发酵液中提取和精制L-苏氨酸的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/cfe2087cff4733687e21af45b307e87100f6f860.png)
