2010版《中国药典》菌种的传代与保藏

1. 目的建立菌种的传代、保藏及菌液制备的操作规程。

2. 范围适用于质检中心菌种的传代、保藏及菌液制备。

3. 责任人实验室检定菌保管员、检验中心主任。

4. 内容4.1 标准菌种的概念及其管理4.1.1标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。

我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供。

4.2 菌种代号的意义4.2.1国内药品微生物检验所用的菌种代号是：CMCC（F）或 CMCC（B）CMCC ——中国医学菌种保藏中心；B ——代表细菌， F ——代表真菌。

4.2.2 菌种的名称▪铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］▪生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］▪大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］▪金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］▪枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］▪白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］▪黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］4.3 标准菌种的保藏形式我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。

在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。

4.4 培养基的选择细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代，真菌一般用改良马丁培养基。

4.5 菌种的传代4.5.1 菌种的复苏4.5.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。

4.5.1.2先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。

点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。

4.5.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。

菌种传代与保藏作业指导书菌种传代与保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。

2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。

接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。

在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。

在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。

新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。

购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。

储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。

3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。

c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。

e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。

f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。

g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。

观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。

h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。

依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection , CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。

黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。

中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。

2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。

接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。

在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。

在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。

新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。

从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。

储存于2～8 ℃，有效期为3个月。

3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。

c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。

菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。

范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。

职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。

内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。

操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。

检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。

使用前需将其复苏。

.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。

②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基〔营养肉汤培养基或改进马丁培养基〕、营养琼脂〔或改进马丁琼脂〕斜面数支。

③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。

操作：.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。

.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。

.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。

.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。

.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。

用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。

.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下〔一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃〕培养24h。

.7 取出培养物〔第1代〕，仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，假设呈典型菌落即可应用。

如发现菌型不典型，可进行平板别离单菌落。

为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液〔第1代〕冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。

菌种得复苏传代及保存标准程序目得:建立菌种得复苏、传代及保存标准程序、范围:适用于检定用菌种得复苏、传代及保存得操作、职责:质管部生物测定人员对本规程得实施负责。

内容:菌种得复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行、操作中使用过得滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡,试验结束后经1２1℃３0分钟高温灭菌处理。

１.菌种得复苏1.1冻干菌种得复苏检定用标准菌种,由中国药品生物制品检定所提供,为冷冻干燥菌种(0代)。

使用前需将其复苏。

1．１.１准备:①用具:灭菌1ｍl滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。

②培养基:根据菌种得性质选择合适得液体培养基(营养肉汤培养基或改良马丁培养基)、营养琼脂(或改良马丁琼脂)斜面数支。

③消毒液:7５%酒精、碘酒、0.1％新洁尔灭或84消毒液等。

1.１。

2操作:1。

1。

２.１将准备妥得冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台、1.1.2。

2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕,再７5％酒精棉擦净菌种管外壁,放在灭菌双碟内待干。

1.1。

2。

3点燃酒精灯,将菌种安瓿得封口一端在火焰上灼烧红热,用灭菌滴管吸取液体培养基少许,滴在灼热得菌种安瓿封口一端,使其骤冷而炸裂。

１．1.2.4取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂得管口打开后,把菌种安瓿放入灭菌双碟内。

1．1。

2、5另取一支灭菌滴管,在火焰旁吸取适用液体培养基少许,加至菌种管底部,将冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至液体培养基内、用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。

1.1。

2。

6将已接种得液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下(一般细菌在3０~35℃,真菌在23~28℃)培养24ｈ。

１。

1.2。

7 取出培养物(第1代),仔细观察菌苔形态、有无杂菌,必要时涂片、革兰氏染色镜检,若呈典型菌落即可应用。

如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。

１、２为保证工作用菌株得传代次数不超过5代,并减少购买冻干菌种得次数,可在对冻干菌种复苏得同时制备部分菌悬液(第1代)冷冻保存,并将此冻存菌液复苏后得第２代培养物冻存保藏。

2015版药典菌种传代中国药典2010年版二部及菌种使用说明书导读:就爱阅读网友为您分享以下“中国药典2010年版二部及菌种使用说明书”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。

黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。

中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签1CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。

2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。

接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。

在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。

在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。

新购入的0代原始菌种储存于,20?，有效期为三年。

从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。

储存于2, 8 ?，有效期为3个月。

3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基2改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤:a.打开洁净工作台。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。