植物原生质体相关材料
2013-9-2 From HZB
一、植物材料
研究表明，几乎从植物的所有部位都能得到原生质体，其中以叶片为多。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。
但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。
1. 细胞悬浮培养物
在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织：
取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4－D 2-4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2-4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80-120r/min，在25±1℃下暗培养。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
2. 叶肉细胞
叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，下列外界因素是需要着重考虑的：
（1）光强为3000-6000lx。
（2）温度为20-25℃培养。
（3）相对湿度在60％-80％左右。
植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。
3. 植物材料的预处理
对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。
例如，把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁；经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体。龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。
植物原生质体的分离及融合
生93沈睿2009012372同组：古梦婷
实验日期：2011年11月2日
一．实验原理
1.原生质体分离
原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它
们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和
诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学
法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。本实验用PEG诱导原生质体
融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，
20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。PEG诱导
融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基
团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，
从而引起原生质体融合。高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融
合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞
膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细
胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。二．实验步骤
1.原生质体的制备
（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸
馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27oC恒温振荡1h
左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大
- 1 - 植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体(plant protoplasts)是植物细胞核以外的细胞质组成，它们可以通过去核反应获得。原生质体可以分离出来，是植物胚性转化的一种重要方法，可以用来分离和获得植物细胞和细胞器的活性。
植物原生质体的分离可以采用不同的方法，以下是常用的几种方法：
一是用果胶酶和裂解酶将细胞膜降解，使细胞质中的内质网结构改变，使原生质体从细胞壁中分离出来。
二是用保护剂处理和胞质囊泡技术。保护剂处理，把细胞质和细胞膜充分溶解，裂解出原生质体；而胞质囊泡技术，是通过用氯仿（等其他溶剂）将细胞膜脱落，或者将细胞膜和细胞质分开，使原生质体分离出来。
三是用低温处理，低温能使细胞膜结构改变，形成小孔，使原生质体从小孔中流出。
四是运用低温抗体介导的细胞膜破裂，在低温下用抗体对细胞膜特异性地结合，从而实现细胞膜的改变，使原生质体分离出来。
以上几种方法通常都能有效地获得植物原生质体。另外，还可以采用全自动分离系统，自动化地破碎、清洗细胞，最终得到原生质体。
植物原生质体相关材料
2013-9-2 From HZB
一、植物材料
研究表明，几乎从植物的所有部位都能得到原生质体，其中以叶片为多。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。
但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。
1. 细胞悬浮培养物
在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织：
取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4－D 2-4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2-4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80-120r/min，在25±1℃下暗培养。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
2. 叶肉细胞
叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，下列外界因素是需要着重考虑的：
（1）光强为3000-6000lx。
（2）温度为20-25℃培养。
（3）相对湿度在60％-80％左右。
植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。
3. 植物材料的预处理
对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。
例如，把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁；经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体。龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。
