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基于代谢组学的热病证候模型评价方法研究[1]

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代谢组学在“病证效”结合研究中的应用

代谢组学在“病证效”结合研究中的应用
关键 词 ： “ 病 证 效” 结合 代谢组 学 应 用 疗 效
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． １ ｌ ８ ４ ２ ／ ｗ ｓ ｔ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ４ ． ０ ０ ２
中 图分 类 号 ： Ｒ ２ — ０ ３
文 献 标识 码 ： Ａ
中西 医 结 合 医 学 是 具 有 我 国特 色 的 优 势 学 科 ，
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ２ — １ ０ — １ ０
“ 病 证效 ” 结合 是 “ 病证 结合 ， 方 证 相应 ， 证 效 统 一 ” 的 中 西 医 结 合 学 说 ，它 不 仅 将 中 西 医 在
“ 病” 、 “ 证 ” 治 疗 上 的优 势 最 大 程 度 地 发 挥 出来 ， 同
用到 “ 病证效 ” 结 合 的研 究 中 。
一
等传 统 的 中医诊 断方式 ， 对患 者 自身的主观 感受 以
及外 在 的表观信 息进行 分析 归纳 ， 掌握 机体整 体功 能 的反应状 态 。因此 ， 若 想获得最佳 的治疗效果 ， 就
、
“ 病证效” 结 合 的 内涵 与 意 义
要将 中西 医两种不 同思 维方式 的 医学 体系相 融合 ， 将 辨病 与辨证相 融合川， 诊 断与 治疗 密切结合 ， 既重
世界科学技术一 中医药现代化 ★思路与方法
摘
要： “ 病证效” 结合的 临床模式是 中西 医结合 医学发展的趋势 ， 该模式在病证结合的基础上进行综
合 的疗效评价 ， 能够凸显 中医临床诊疗的优 势。机体在病证状 态和药物作用下， 引起全身水平的 内源性代 谢物及代谢 网络 变化。运用代谢组学技术考察和分析这些代谢 的变化 ， 可以探 究病证本质， 阐明药物作用 机理。本文对近年来代谢组学在“ 病证效” 结合研 究中的应用进行综述 ， 将代谢组学运 用到“ 病证效” 结合研 究中， 有助 于促 进 中西 医结合 的发展 。

代谢组学技术在中医证候研究中的应用概况

代谢组学技术在中医证候研究中的应用概况

学研 究 方 法 与 中 医药 治 疗 疾 病 的 整 体观 念 相 一 致 ， 中 医证 候 ， 研 究及 动物 模 型 研 究 中取 得 了一 定 成 果 ， 助 于揭 示 在 临床 有
中 医证 候 的本 质 ， 进 一 步推 动 中 医药 事 业现 代 化 的进 程 。 将
关键词 代谢组学 证候 综 述
『５ 江 丰 ， 常 度 ， 晓 丹 ， ． 刺 五 志 穴 治 疗 中风 后 抑 郁 症 的 临 床 ｌ１ 李 孟 等 针 疗 效 观 察 ． 灸 临 床 杂 志 ，０ ６，２ １ ）２ 针 ２ ０ ２ （２ ：５ 『６ 董 建 萍 ， １１ 孙伟 义 ， 顺 ， 头 部 电 针 透 穴 治 疗 脑 卒 中后 抑 郁 症 临 王 等．
现 将 其 研 究 进 展 概 述 如 下
１ 代 谢 组 学 的概 念 与特 点
谢 产 物 的分 析 分 为代 谢 物 靶 标 分 析 、 谢 轮 廓 分 析 、 谢 组 学 代 代
以及 代 谢 物 指 纹 分 析 几 个 层 次 对 这 种 区 分 有 助 于 技 术 的选 择 ． 整 体 代 谢 组 的 扫 描 往 往 采 用 核 磁 共 振 （ ＭＲ 或 者 基 于 对 Ｎ ）
代谢组 学技 术在 中医证候 研 究中的应 用概 况
范群 丽 １ 陈 晓虎 ２ （． １南京 中医药 大学 ， 苏南京 ２ ０ ２ ；２南京 中医药 大学 第一 附属 医院 ， 苏 南京 ２ ０ ２ ） 江 １０９ ． 江 １０９
摘
要
代 谢 组 学是 近 年 来新 发 展 起 来 的一 门 学科 ， 究过 程 包括 样 品 制 备 、 谢 产 物 的 检 测 、 析 与 鉴 定 。 代 谢 组 研 代 分

基于以药测证的热病证候模型评价方法研究

基于以药测证的热病证候模型评价方法研究

事， 主要从事 中药临床药效物质基础研究及 中药药性理论研
究。
６ ２ 电子数字式体温计 测定大 鼠肛温 ， 日早 晚各 １型 每 测量体 温 １次 ， 连续 ３天 ， 取基 础肛温 在 ３ ． 选 ８ ０～
３ ． ℃ ， 动 在 ０ ５ 以 内者 纳入 实 验 ， ９５ 波 ．℃ 随机 分 为 空 白
来衡量模 型是否成 立 ， 其弊 端 日益 明显。近 期有 学 者 … 强调 ， 治疗 作 为 反 证 法 ， 是 衡 量 模 型 是 否 成 功 也
的一 个必 要 的标 准 。治疗 诊 断 时 ， 选 择 不 同类 的 方 应 药， 进行证 属 Ｉ 眭的排 比性 的确 定 。也就 是说 ， 们必 须 我 制定 严格 科学 的动 物模 型判 定 标 准 ， 评 定 标 准 体 系 使 规范 化 ， 正 做 到 指 标 量 化 、 观 化 ， （ ）微 （ ） 真 客 宏 观 观
饮 用水 ， 制室 内温 度 为 （ ２４１ ℃ 、 对 湿度 在 ４ ％ 控 ２ － ） 相 ０
左右。
１１ 仪 器 ． 电子数 字 式 温 度 计 ＭＣ一６２型 （ 姆 龙 有 限 公 １ 欧
司） 电子天平 （ ； 北京赛 多利斯仪器 系统有 限公 司 ） ；
Ｋ Ｑ一 ０ ５ Ｂ超声 波 清洗器 （ 山市超 声 仪器 有 限公 司 ） 昆 ；
２ ４一 硝基 苯 酚 １５ ｇ 置 于 ４ ｍｌ ， 二 ２ｍ ， ０ 生理 盐 水 中 ， 滴
结合。这样 ， 才有利于提高科研工作中的准确性。
本课题组前期工作 已经确定 ２４一二硝基 苯酚诱 导 ， 热病证候模 型的最佳 造模条 件 ， 本研 究采用 以药测证 的
方法 ， 即利用寒性药物和温性药物对 比干预并结合动物

基于代谢组学的中医“证”本质研究进展

基于代谢组学的中医“证”本质研究进展
ABSTRACT: In this article, through finishing domestic nearly 15 years with metabonomics technology research of traditional Chinese medicine “syndrome” nature related papers, research of the related technologies and methods, don’t think the future can be from a test certificate and metabolic changes in matter as a breakthrough point, to explore the development of “syndrome” mechanism; Or to investigate the changes of the syndromes and metabolites in the experimental subjects before and after the intervention of a certain evidence, to determine the corresponding metabolic pathways or related targets. KEY WORDS: TCM syndrome type; Metabonomics; Metabolic marker; Summarize
“证”是准确“施治”的基础，为辨证施治诊疗体系的关键。王 永炎院士认为，“证”是机体形态、结构、功能、意识的有机整合，并 提 出 ：“ 证 ”既 是 疾 病 状 态 下 一 定 阶 段 病 机 概 括 ，又 是 非 疾 病 状 态 下 一 定 阶 段 亚 健 康 状 态 的 概 括 ，“ 证 ”具 有 动 态 时 空 、多 维 界 面 和 内实外虚等特征 [7]。自 20 世纪 60 年代肾本质的探索起，学界对 中医“证”本质探究大致分为 4 个时期：1.70 年代：证候动物模型 的研究，多用饮食结合药物、运动、人工气候箱等复合因素造模法 复制某证动物模型，可重复性好，但人体内环境与动物有别，且社 会人文因素等对人体的影响无法在动物造模中完全复制；2.80-90 年代：证候微观指标的研究，大量研究结果中，某“证”都存在着微 循环、微量元素、血液流变学等的改变，测得的微观指标与“证”具 有相关性，但特异性较低，且相互关系的证之间的指标系统难以筛 选建立；3.90 年代 -21 世纪初：病、证、方物质基础的研究，将“方 证 相 应 ”运 用 于 中 医 证 本 质 研 究 的 实 验 设 计 思 路 中 ，某 方 在 治 疗 某病某证模型时所调节的微观指标可视为该证的相关物质基础，

基于代谢组学的中医证候生物学标志物研究

基于代谢组学的中医证候生物学标志物研究

基于代谢组学的中医证候生物学标志物研究基于代谢组学的中医证候生物学标志物研究引言：中医作为我国传统医学的重要组成部分，具有悠久的历史和丰富的临床应用经验。

中医理论强调疾病的整体观念，强调个体的整体状态与健康密切相关。

传统中医诊断主要依靠望、闻、问、切四诊方法，并将疾病归类为不同的中医证候。

然而，由于中医证候的主观性和临床观察的局限性，中医的研究一直面临着较大的挑战。

近年来，代谢组学的出现为中医证候的研究提供了一种新的思路和方法。

代谢组学是对生物体内代谢物的全面测量和分析，可以有效地揭示生物体的整体代谢状态。

中医证候作为个体的整体状态在代谢组学中可以通过分析生物体内代谢物的组成、浓度变化以及代谢途径的异常来捕捉和反映。

代谢组学在中医证候生物学标志物研究中的应用：1. 通过代谢物组成分析研究中医证候的组成差异：研究发现，不同中医证候的患者体内代谢物组成存在明显差异。

例如，某些中医证候患者体内的氨基酸及其衍生物含量明显降低，而脂质类代谢物含量增加。

这些差异反映出中医证候不同的生物学特征和疾病机制，为中医证候的诊断和治疗提供了参考。

2. 通过代谢物浓度变化研究中医证候的病理机制：代谢组学的研究可以揭示中医证候与疾病之间的关系。

通过对不同中医证候患者体内代谢物浓度的测定和分析，可以了解不同中医证候的患者体内代谢途径的异常和紊乱。

例如，研究发现湿热痰饮证患者体内脂类代谢产物明显增加，反映出湿热痰饮证与脂质代谢异常相关。

3. 通过代谢途径异常研究中医证候的病因：代谢组学研究还可以揭示不同中医证候的病因和发病机制。

通过分析代谢途径的异常，可以揭示中医证候与某些特定疾病的关联以及潜在的病因。

例如，研究发现阴虚证患者体内代谢途径与骨质疏松相关的物质发生异常，表明阴虚证与骨质疏松症之间存在一定的关联。

4. 建立中医证候生物学模型：代谢组学的研究可以通过建立中医证候生物学模型来辅助中医诊断。

通过对不同中医证候患者体内代谢物的综合分析和建模，可以建立中医证候的生物学模型，实现中医诊断的客观化和标准化。

代谢组学在中医证候研究中的应用

代谢组学在中医证候研究中的应用

随着健康观念 、医学模 式 、医疗模式 的全面转变和
系统生物 学思维模 式的发展，现代医学 的发展逐渐 由微
集 、样品预处理、代谢物检测分析 、数据分析 以及研究 结果的解释与 实际应 用［，代谢产物 的检测 、分析与鉴 ２ 】
观 、实 体的探 索 向宏 观、系统 的角度过渡 。卫生部长 陈 竺 院士指 出： 中医强调整体论，西医则强调还 原论 ，所 “ 以多年来许 多学者认 为两者格格不入 。但事实证 明，到 了系统 生物学 时代 ，它们 找到了共 同语 言。 将现代化 的 ” 医学研 究策略融入 以整体观念 、辨证论治为特 点的中医 学 ，采用 系统生物学相关技术与方法进行 中医药研 究， 用现代 语言阐释中医 “ 因人制宜 ” 治未病 ”等独特 的 、“ 思维方 式和 治疗方法，将为中医药 的现代化和 国际化开 辟新 的方 向。 １ 代谢组学 作为系统生物学的重要组成部分， 代谢组学由英 国学 者 Ｎ ｃｏｓｎ ｌ １９ ｉ ｌ 等Ｌ ｈ ｏ Ｊ ９９年首次提 出，是继基因组学 、转 于 录组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科 。 以 它 生命体中 内源性小分子代谢物为对象， 系统研 究代谢产物
定是代谢 组学技术的核心部分 。可供检测标本有尿液 、 血浆 或血清 、 脊液 、唾液等生物 体液 以及细胞培养液 、 脑 细胞提取物和组织等 。 通过检测得 到一系列样 品的谱 图， 结合 化学模式识别的方法 ，可 以判断 出生物体 的病理生 理状 态、基因的功能 、药物 的毒性和药效等 ，并有可能 找出与之相 关的生物标志物 （ ｉ ｒｅ）Ｅ。 ｂｏ ｋｒ ３ ｍａ ］
（ １南京 中医药大学 ，南京 ２ ０ ４ ；２河南 中医学院第一附属医院，郑 州 ４ ０ ０ ；３河南 中医学 院，郑州 ４ ０ ０ ） １０ ６ ５０ ８ ５ ０ ０

代谢组学技术在中医证候学和药效物质基础研究中的应用


生 命 个体 对外 源性 物 质 的刺 激 、环 境 变 化 或 遗 传 证 和 复 方 ， 离 整 体 性 原 则 ， 裂 方 证 的 关 联 ， 背 割 无 修 饰 所 做 出 的所 有 代 谢 应 答 的全 貌 和 动 态 变 化 过 视 动态 的观念 ， 能将 失 去 中医 的特 色 和优 势 。代 可 系统 性 、 合 性 的特 征 与 中药 “ 综 多 程 ． 非仅 仅 某 一 代 谢 产 物 ， 并 两者 均 是 对 多 因素 进 谢 组 学 整 体 性 、 行 整体 分 析 。（ ） 的本 质是 对 疾病 过 程 中所 处 一 组 分 、 靶 点 、 合 调 节 作 用 ” ３证 多 整 的特 点 及 中 医药 理 定 阶段 的病 位 、 因 、 质 以及 病势 等 所 作 的病 理 论 的 “ 体 观 、 态 观 、 证 观 ” 吻 合 ， 以将 代 病 性 整 动 辨 相 所
学 之 父 Ｊｒｍ Ｎ ｃ ｏｓｎ教 授 也 认 为人 体 应 该 作 为 论 ” 想 指 导 下 ， 们 希 望 通 过证 候 物 质 基 础 的 寻 ｅｅ ｙ ｉｈ ｌ ｏ 思 人 个 完 整 的系 统来 研 究 ， 用 代谢 组 学 和 全 面性 系 找 ， 到 证 候 的特 异 性 指 标 ， 图建 立 证 候 实 验 诊 应 找 试
因 变 异 或 环 境 变 化 后 ） 代 谢 产 物 （ 源 性代 谢 物 的表 现 应是 使 生 物代 谢 网 络 、细 胞 产 生 的 内源 性 其 内
质） 类 、 种 数量 的 变化及 其 变化 规律 的科 学 。它研究 产 物 的种 类 、 度 、 对 比例 发 生 扰 动 。 种 扰 动 浓 相 这 的是 生 物 整体 、 系统 或 器 官 的 内源性 代 谢 物 质 的代 体 现 在小 分 子代 谢 产 物 集 合 轮 廓 的改 变 。 中医 认 谢 途径 及 其所 受 内在或 外 在 因素 的影 响。代谢 组学 为 “ 诸 内必 形 诸 外 ” 传 统 上 通 过 四诊 方 法 获 取 有 ， 与 中医 学在 许 多 方 面有 相 近 的属 性 ， 果 把 它们 有 患 者信 息 以 揣 推其 体 内变 化 ，获 得 所 谓 病 证 本 质 如 机 地结 合 起来 研究 将是 非 常有 意义 的工作 。代 谢组 的 认 识 。但 是 在 现 代 医学 的 “ 证 主义 ” “ 原 实 和 还

代谢组学与中医证候研究

一
“ ” 证 是辨证论 治 的起 点和 核心 。“ ” 证 是指在 疾
病的发生 、 发展过程 中 ， 一组具 有 内在联系 的 、 能够 反 映疾病 过程 在某 一 阶段 的病 机 ， 机体 对 体 内外 各 是 种环境 变化 和致病 因素作 出反应 的一 种功能状 态 ，
基 金 项 目：国 家 自 然 科 学 基 金 重 大 研 究 计 划 面 上 项 目
累 ， 至发生 新 的紊 乱 。 当这 种 紊 乱 在量 的水 平 积 统论 为指导 使用 代 谢 组学 方法 研 究 中 医证 候 ， 甚 以期 累到 一定程 度 时 ， 会 出 现细 胞 乃 至组 织 水 平 的 宏 找到 证候 的客 观 物 质 基础 或证 候 的 代 谢 组 学 特 征 就
关特定组分 的共性 ， 最终是要涉及 研究 每一个 代谢组
分 的共 性 、 性 和规 律 ， 然 目前 距 此 目标 还 甚 远。 特 虽 源性 因素 的改 变而 出现扰 动 时 ， 会 引起 代 谢 水 平 但人们仍坚 信 ， 就 与基 因组 学 和蛋 白质组 学 相 比， 代谢 某种 程度 的紊乱 ， 这种紊 乱进 一步发 展 ， 就会 逐渐 积 组学 与生理 学的联 系更加 紧 密 。因此 以整 体 生 物 系
观变 异 ， 至病理 改变 。而这些 代谢 紊乱 性变 化 ， 甚 往 谱 ， 现证候 的宏 观和 微观 的诊 断方 法 。 实 往会 在尿 液 和血 液 等 体 液 的 代 谢 组 得 到 表 现 。 因
此， 对尿液 和血液 等体液代 谢组 进行 检测 和分 析 ， 就 ２代 谢 组 学 方 法应 用 于 中 医证 候 研 究 现 状 有可 能对疾 病发生 和发 展过程 伴随 的生 物化 学变 化 ． 进行 了解和认 识 ， 有 可 能发 现 相 关疾 病 发 生 的早 ２ １采 用 临 床 患 者 进 行 证 的代 谢 组 学研 究 童 宁 就 宁 对慢 性 胃炎湿热 蕴脾证 患者 和正 常组 唾液进 行 期代谢 组标 志物 簇 ， 认识 相 关 的 病理 发 生 的分 子 并 机理 ， 就有可 能对疾 病在其 早期 ， 甚至 发 生之前 进 行

基于代谢组学方法的中医证候研究进展

.述评.DOI：0.11656/j.issn.1673-9043.2017.04.01基于代谢组学方法的中医证候研究进展*侯雅静，陈家旭，潘秋霞，宋明，王方方(北京中医药大学，北京100029)摘要：代谢组学方法是研究代谢组在某一时刻细胞内所有代谢物的集合并进行定性和定量分析，以寻找代谢 物与生理病理变化的对应关系。

中医证候是对机体病理状态的宏观概括，代谢组学研究内容则反映出宏观状态下 机体的微观表现。

近年来运用代谢组学方法对中医证候的研究取得了一定进展，现通过对近10年来国内外运用代 谢组学方法对中医证候研究的文献进行综述,从运用代谢组学方法对中医证候进行的研究方向、成果与不足进行 论述，并提出研究展望,为深人研究中医证候微观机制提供思路。

关键词:代谢组学；中医证候;研究进展中图分类号：R285.5 文献标志码:A文章编号：1673-9043(2017)04-0241-04代谢组学是以组群指标分析为基础，以高通量 检测和数据处理为手段，以信息建模和系统整合为 目标的系统生物学分支，它是研究代谢组在某一时 刻细胞内所有代谢物的集合并进行定性和定量分 析，以寻找代谢物与生理病理变化的对应关系。

主 要研究方法有:代谢物靶标分析，代谢轮廓(谱)分 析，代谢指纹分析，主要分析手段涉及气相色谱-质 谱联用技术、核磁共振技术、液相色谱-质谱联用技 术[1]。

代谢组学方法适用于识别代谢指标，可以为个 体化诊疗、诊断提供依据，同时新的标志物的发现可 以为疑难疾病的诊断、治疗提供新思路[2]，更好指导 临床辨治。

中医证候是对疾病所处一定阶段的病因、病 性、病位、病机的高度病理性概括。

证候是对机体病 理状态的宏观概括，代谢组学研究内容则反映出宏 观状态下机体的微观表现。

目前国内外学者根据研 究对象的不同，运用代谢组学的方法对中医证候进 行临床与实验研究，以探索中医证候实质内涵。

因代谢组学具有时相性、动态性、整体性、系统性的特 点，使其与中医的整体观，系统观相呼应，凸显出代 谢组学方法在众多中医证候研究领域及方法中的 优势[3]。

基于代谢组学的热病证候模型评价方法研究


点， 借助代谢组学平 台 ， 过对 空 白对 照组及 模型组 大 鼠尿 通 液的代谢 指纹数据及模 型组不 同时 间段尿 液的代谢 组进 行 分析 ， 探讨动物 模 型 的评 价 方法 。结 果 通 过代 谢 组学 研 究， 结果表明 ２４二硝基苯 酚诱 导的动物模型符合 中医临床 ，一 的热病证候表 征。结论
术 ； 物模型 ； 价方法 动 评
司 ） Ｋ 一 Ｂ超声波清洗 器（ 山市超 声仪器 有限公 司） 超 ； Ｑ５ ０ 昆 ；
净 工 作 台 （ 京 东联 哈 尔 仪 器 制 造 有 限 公 司 ） 北 。
１２ 药品与试剂 乙腈 为色谱级 ， 国天地公 司 ； 哈哈纯 ． 美 娃
动物模型 的研究 急需规 范化 ， 它是保证 中医药现代化 研 究结果 的可靠性 、 重现性 、 新性 、 创 先进性及科 学性的基本 前
中 的应 用 。
文 献 标 识 码 ： 文章 编 号 ：０ １—１７ （０ ９ ０ ０ ４ Ａ １０ ９ ８ ２ ０ ）４— ５ ９—０ ３
摘要 ： 目的
法。方法
建 立一 套 完善 的 中医证 候 动物 模 型的 评价 方
以 ２ ４二 硝 基 苯 酚 诱 导 的 热 病 证 候 模 型 为 切 入 ，－
代 谢组学 可用 于 中医证候 动物 模
时间质谱 （ 电喷雾离 子源 一正 、 负离子 扫描方法一ｏｋｐａ ） Ｌ ｅｓｒｙ ；
Ｍａｓｙ ｘＶ ． 工 作 站 ； 子 数 字 式 温 度 计 ＭＣ６ ２型 （ 姆 ｓＬｎ ４ １ 电 －１ 欧
龙有 限公 司 ） 电子 天 平 （ 京 赛 多 利斯 仪器 系统 有 限 公 ； 北 关键词 ： 代谢组学 ； 高效 液相色谱／ 超 高分辨 飞行时间质谱 技
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·550·
中国药理学通报 Ch inese Pha rm acolog ica l B u lletin 2009 Ap r; 25 (4)
F ig 1 The UPLC2Q2TO F /M S BP I prof ile of m etabolom e of norma l ra t ur ine
3. 3 基于代谢组学的模型评价 疾病病理过程中代谢网络 的某些环节出现紊乱 ,该过程使生物代谢网络 、使细胞产生 的内源性产物的种类 、浓度 、相对比例发生扰动 ,这种扰动体 现在小分子代谢产物集合轮廓的改变 。因此通过比较正常 组与模型组的代谢产物集合轮廓 ,可以从中得出两者内源性 产物种类 、浓度 、相对比例是否处于相同范围 ,进而推断造模 是否成功 。 对得分图 ( Fig 2)进行分析可知 ,大鼠皮下注射给予 2, 42二硝基苯酚后尿液代谢物组发生了明显的变化 ,与空白组 相比明显被分类 。给予造模剂后大鼠尿液代谢物组发生变 化且被明显分为两类 ,说明给予 2, 42二硝基苯酚后大鼠正常 生理代谢被干扰 ,从代谢物组变化的角度可证明 2, 42二硝基 苯酚诱导热病证候模型造模成功 。
中 国 图 书 分 类 号 : R2332; R 241; R 3632332; R 44113; R 446112 文献标识码 : A 文章编号 : 1001 - 1978 (2009) 04 - 0549 - 03 摘要 :目的 建立一套完善的中医证候动物模型的评价方 法 。方法 以 2, 42二硝基苯酚诱导的热病证候模型为切入 点 ,借助代谢组学平台 ,通过对空白对照组及模型组大鼠尿 液的代谢指纹数据及模型组不同时间段尿液的代谢组进行 分析 ,探讨动物模型的评价方法 。结果 通过代谢组学研 究 ,结果表明 2, 42二硝基苯酚诱导的动物模型符合中医临床 的热病证候表征 。结论 代谢组学可用于中医证候动物模 型的评价研究 。
收稿日期 : 2008 - 10 - 12,修回日期 : 2008 - 12 - 20 基金项目 :国家重点基础研究发展计划 ( 973 计划 ) 资助项目 (No
2007CB 512608 ) 作者简介 :刘树民 (1963 - ) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 :
中药临床药效物质基础及中药药性理论 , Tel/ Fax: 04512 82196181, E2mail: lsm @ hljucm. net; 王喜军 (1961 - ) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 : 中药 及 复 方 的 血 清 药 物 化 学 , 通 讯 作 者 , Tel: 04512 82193010, E2mail: wxj@ hljucm. net
2. 2. 2 质谱条件 电喷雾离子源 ( ESI) ,采用正负离子扫描 检测 ;毛细管电压正离子扫描为 3 000 V ,负离子扫描为 2 800 V;样本锥孔电压为 35 V;分离锥孔电压为 310 V;离子源温 度为 110℃;脱溶剂温度为 300℃;脱溶剂气流量正离子扫描 为 600 L ·h - 1 ,负离子扫描为 500 L · h - 1 ; 锥孔气流量为 100 L·h- 1 ;碰撞能为 3 V,碰撞气为氩气 ,微通道板电压为 2 450 V ,碰撞室压力小于 218 ×10 - 3mbar;每 011 s采集一次 谱图 ,每次采集 0148 s;准确质量校正采用亮氨酸 - 脑啡肽 ( leucine2enkephalin, [ M + H ] + 55612771; [ M - H ] - = 55412615)溶液 ,校正溶液进样速度为 100 μl·m in - 1 ,校正 频率为 5 s; 扫描方式为全扫描 ,质量扫描范围 m / z 100 ～ 900。 2. 3 数据处理 数据采集 、原始数据前处理以及数据处理 是代谢组学研究中非常重要的一部分 ,也是研究是否能顺利 进行的关键 。通过现代化学信息学和生物统计学领域的新 方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘 ,是目前代 谢组学研究中进行海量数据处理的研究方向 。本课题组采 用 M icromass M arkerLynx软件进行色谱峰识别以及峰匹配 , 并采用主成分分析法 ( PCA )对获得的多维复杂数据进行降 维处理 。通过对空白对照组及模型组大鼠尿液的代谢指纹 数据及模型组不同时间段尿液的代谢组进行分析 ,绘制出反 映组间离散程度的 Score p lot,最终得出实验结果 。 3 实验结果与讨论 3. 1 宏观体征 造模过程中观察到大鼠出现精神萎糜 、摄 食量减少 、摄水量减少 、排尿减少 、足趾色红等一般情况的变 化 ,自主活动减少 ,体温升高 ,呼吸 、心率加快等基础指标的 改变 。以上大鼠造模过程中出现的一系列变化和人类发热 过程中的症状和体征改变较相似 。通过监测大鼠热病证候 模型造模过程中体温变化 ,记录每只鼠各时间点体温值 ,以 各时间点平均最高体温差 ( △t)作 t检验 。实验结果表明 ,
中国药理学通报 Ch inese Pha rm acolog ica l B u lletin 2009 Ap r; 25 (4) : 549～51
◇实验方法学 ◇
·549·
基于代谢组学的热病证候模型评价方法研究
刘树民 1 ,卢 芳 1 ,王喜军 2 ,孙文军 2 ,董培良 1
(黑龙江中医药大学 1. 中医药研究院 、2. 药学院 ,黑龙江 哈尔滨 150040)
关键词 :代谢组学 ;超高效液相色谱 /高分辨飞行时间质谱技 术 ;动物模型 ;评价方法
动物模型的研究急需规范化 ,它是保证中医药现代化研 究结果的可靠性 、重现性 、创新性 、先进性及科学性的基本前 提 。模型评价体系是造模过程中必须有的 、应反复进行的一 个内容 。目前国内仅采用症状 、体征的定性法来衡量模型是 否成立 ,其弊端日益明显 。且证候模型的指标往往局限于从 一个或几个证候本身所表现出的现象中去选择 ,忽略了疾病 对机体整体的影响 ,这样选择的指标不能全面地反映机体疾 病的状态 。因此我们必须制定严格科学的动物模型判定标 准 ,使评定标准体系规范化 ,真正做到指标量化 、客观化 ,宏 (观 )微 (观 ) 结合 。 代谢组学从整体观出发 ,以机体代谢物组变化为载体 , 以时空动态性和全局性观点 ,试图全面的解析疾病对机体的 影响 。同时可通过对生物体液和组织中随时间改变的代谢 物进行检测 、确定 、定量和分类 ,将这些代谢信息与病理生理 过程中的生物学事件关联起来 ,以监测活细胞中的化学变 化 [1 ] 。本课题组即借助前期宏观体征及以药测证等方法初 步明确建立模型成功后 ,进一步利用代谢组学方法 ,对样品
Tab 1 The grad ien t elution program for ana lyz ing m etabolic
f ingerpr in t da ta 10 12 13 15
Flow rate /m in·m l - 1 0. 4 0. 4 0. 4 0. 4 0. 4 0. 4
收集 5次 ,尿液置于冰中保存 ,尿液样品于 4℃, 13 000 r· m in - 1离心 10 m in,取上清液过 0122μm 微孔滤膜 ,供 UPLC2 Q 2TOF /M S分析 。 2. 2 分析条件 2. 2. 1 色谱条件 色谱柱 : ACQU ITY UPLCTM BEH C18 col2 umn ( 50 mm ×211 mm id, 117 μm , W aters Corp , M ilford, USA ) ;流速 0140 m l·m in - 1 ;柱温 : 25℃;流动相 : A: 011%甲 酸 - 水溶液 ,流动相 B: 011%甲酸 - 乙腈溶液 ;梯度洗脱程 序 (见 Tab 1) 。二极管阵列检测器全波长扫描 ,紫外检测器 流出液不经分流直接导入质谱系统检测 。
A /% 98 60 98 2 98 98
B /% 2 40 2 98 2 2
大鼠体温在造模后 1 h达到最高峰 ,造模后 3 h恢复正常 。 在造模后 1 ～2 h 过 程 中 , 模 型 组 与 空 白 对 照 组 比 较 P < 0105,差异有显著性 。 3. 2 大鼠尿液分析条件的优化 本实验用色谱柱采用 117 μm 填料使得 UPLC在较高的线速度下依然可以保持良好的 分离效率 ,为节省分析时间及考虑到质谱系统对流量的耐受 性 ,故采用 0140 m l·m in - 1的流速能够满足分离要求并提高 分析通量 ,同时可不经分流将流出液直接导入质谱系统进行 检测 。对于尿液这种复杂的生物样本 ,梯度洗脱是一种较为 理想的选择 。质谱条件中脱溶剂气流量以及温度对代谢物 的离子化效率有较大影响 ,故优化检测条件时重点考察这两 个参数 。在优化后的分析条件下 ,应用此条件取得了良好的 分析效果 ( Fig 1) 。
代谢物进行快速扫描 、定性表征和分类 ,检测和量化一个生 物整体代谢随时间变化的规律 ; 建立内在和外在因素影响 下 ,代谢整体的变化轨迹 ,反映某种病理过程中所发生的一 系列生物事件 ,探讨代谢组学在中医证候动物模型评价研究 中的应用 。 1 实验仪器及材料 1. 1 仪器 美国 W aters AcquityTM UPLC液相色谱仪 (四元 梯度泵 - 在线真空脱气机 - 自动进样器 - 二极管阵列检测 器 - 柱温箱 ) ;美国 M icromass Q 2TOF m icroTM四极杆 - 飞行 时间质谱 (电喷雾离子源 - 正 、负离子扫描方法 2Locksp ray) ; M assLynx V411工作站 ;电子数字式温度计 MC2612型 (欧姆 龙有限公司 ) ; 电子天平 (北 京 赛 多 利 斯 仪 器 系 统 有限 公 司 ) ; KQ 250B超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司 ) ;超 净工作台 (北京东联哈尔仪器制造有限公司 ) 。 1. 2 药品与试剂 乙腈为色谱级 ,美国天地公司 ;娃哈哈纯 净水 ,再经本室 M illi2Q 纯水机制备 ;甲酸色谱级 ,美国霍尼 韦尔公司 ;脑啡肽 , Sigma公司 ;甲醇分析级 ;异丙醇分析级 ; 氢氧化钠分析级 ; 2, 42二硝基苯酚分析级 ,上海华东师范大 学化工厂 。 2, 42二硝基苯酚 - 氢氧化钠溶液制备 :精密称取 2, 42二 硝基苯酚 125 mg, 置于 40 m l生理盐水中 , 滴加 5 mol·L - 1 的 NaOH溶液 , 不断搅拌 , 待药液澄明变为亮黄色 , 再加入 生理盐水至 50 m l[2 ] 。 1. 3 实验动物 W istar大鼠 , ♂,清洁级 ,体重为 ( 200 ±20) g (北京维通利华实验动物技术有限公司提供 ) ,大鼠于室内 保持 12 h光照 , 12 h避光循环饲养 ,给予标准饲料和饮用 水 ,且控制室内温度为 (22 ±1) ℃、相对湿度在 40%左右 。 2 实验方法 2. 1 模型制备及样品的采集与制备 取 W istar大鼠 , ♂,适 应环境 3 d后 ,放入代谢笼中适应 5 d,以 MC2612型电子数 字式体温计测定大鼠肛温 ,每日早晚测量体温 ,连续 3 d,选 取基础肛温在 3810 ～3915℃,波动在 015℃以内者纳入实 验 ,随机分为空白组和模型组 。造模前 3 d,每日早晚测量大 鼠的肛温 ,取其平均值作为正常基础体温 ;应用 2, 42二硝基 苯酚造模 ,皮下注射 2, 42二硝基苯酚 25 mg·kg- 1大鼠体重 , 于造模后 1、2、3、4、5 h各测体温 1次 ,以给药前大鼠体温平 均值为基数 ,计算各测定时间点体温变化 ,以各时间点最高 体温差 ( △t)作 t检验 。用平均体温反应曲线和最大体温上 升高度 △T作为发热反应的指标 。 同时于造模前 3天用代谢笼收集 24 h尿液 ,每日上午 8 点收集 1次 ,连续 3 d,尿液置于冰中保存 ;于 2, 42二硝基苯 酚造模后 1、3、7、13、19 h,收集各不同时间点的尿液 1次 ,共