志贺氏菌检测
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食品中志贺氏菌的检测——样品处 理及增菌
目录页
食品营养与检测专业教学资源库
一
样品处理及增菌工具和设备
二
样品的处理及增菌
— 1—
过渡页
食品营养与检测专业教学资源库 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品营养与检测专业教学资源库 无菌吸管（微量移液器及吸头） 5 ℃±１℃，厌氧培养 16 h～20 h。 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品营养与检测专业教学资源库
食品营养与检测专业教学资源库
— 2—
样品的处理及预增菌
食品营养与检测专业教学资源库
样品类型
固体样品
液体样品
处理及预增菌方法
以无菌操作取检样 25 g，加入装有灭菌 225 mL 志 贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均 质器 以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质；或加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式 均质 器连续均质 1 min～2 min，于 41.5 ℃±１℃， 厌氧培养 16 h～20 h。
冰箱
2 ℃~5 ℃
处理及增菌
食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品营养与检测专业教学资源库 无菌均质杯（无菌均质袋） 以无菌操作取检样 25mL,加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，振荡混匀于 41. 食品营养与检测专业教学资源库
样品处理及增菌工具和设备
一
食品营养与检测专业教学资源库
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食品营养与检测专业教学资源库
样品处理及预增菌工具和设备
工具和设备
要求
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一
样品处理及增菌工具和设备
二
样品的处理及增菌
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过渡页
食品营养与检测专业教学资源库 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品营养与检测专业教学资源库 无菌吸管（微量移液器及吸头） 5 ℃±１℃，厌氧培养 16 h～20 h。 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品营养与检测专业教学资源库
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样品的处理及预增菌
食品营养与检测专业教学资源库
样品类型
固体样品
液体样品
处理及预增菌方法
以无菌操作取检样 25 g，加入装有灭菌 225 mL 志 贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均 质器 以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质；或加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式 均质 器连续均质 1 min～2 min，于 41.5 ℃±１℃， 厌氧培养 16 h～20 h。
冰箱
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处理及增菌
食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品中志贺氏菌的检测——样品处理及增菌 食品营养与检测专业教学资源库 无菌均质杯（无菌均质袋） 以无菌操作取检样 25mL,加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，振荡混匀于 41. 食品营养与检测专业教学资源库
样品处理及增菌工具和设备
一
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样品处理及预增菌工具和设备
工具和设备
要求
沙门氏菌和志贺氏菌的检测
简单的培养条件 需氧或兼性厌氧，营养要求不高
活泼的生化反应 致病菌
非致病菌
乳糖 发酵 实验
阴性
阳性
SS琼脂培养基
（含胆盐、乳糖、中性红等）
第三页
4、抗原构造复杂
鞭毛抗原（H） IgG
K或Vi抗原
菌体抗原（O） IgM
第四页
沙门菌检测
• 美国细菌学家Salmon与Smith于1885年分离出猪 霍乱沙门菌。1990年为纪念Salmon，定名这类细 菌为沙门菌属。
第二十四页
➢ 斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑色 ➢ 斜面红色、底层黄色，无黑色
➢ 斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色
除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌等也可 出现上述反应。
• 吲哚试验：阴性
第二十五页
志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生 H2S。 大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生
H-O变异：是指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异
位相变异：具有双相H抗原的沙门菌变成只有其中某一相的单相菌，称位相 变异。在沙门菌血清学分型时，如遇到单相菌，特别是只有第Ⅱ相（非特异 相）抗原时，需反复分离和诱导出第Ⅰ相（特异相）抗原方可作出鉴定。
V-W变异：是指沙门菌失去Vi抗原的变异。初次分离得到的具有 Vi抗原、O抗原不凝集的沙门菌称V型菌；Vi抗原部分丧失，与O 抗原血清发生凝集又可与Vi抗血清凝集者称VW型菌。 Vi抗原完 全丧失，与O抗原血清发生凝集又与Vi抗血清不凝集者称W型菌。 V-W变异的过程是V型菌经人工培养，逐渐丧失部分Vi抗原而成 为VW型，进而丧失全部Vi抗原而成为W型菌。
后 的 顺 序 以 O51-O67 表 示 。 引 起 人 类 沙 门 菌 病 的
志贺氏菌检测
环境中志贺氏菌的消杀
通过检测环境中志贺氏菌的分布和数量，采取有效的消杀措施，降低疾病传播的风险。
05
志贺氏菌检测的挑战与展望
检测挑战
灵敏度与特异性
志贺氏菌检测需要高灵敏 度和特异性，以避免假阳 性或假阴性的结果，给临 床诊断和治疗带来困扰。
快速检测
在感染早期快速准确地检 测志贺氏菌对于及时治疗 和防控疾病传播至关重要。
抵抗力较强
志贺氏菌对理化因素的抵 抗力较强，在粪便、土壤、 食品等外界环境中可存活 数周至数月之久。
志贺氏菌的传播途径
粪口途径传播
志贺氏菌主要通过消化道传播， 通过污染的食物、水或与感染者 的接触而感染。
直接接触感染
志贺氏菌也可通过直接接触感染 者的分泌物或接触被污染的物品 而传播。
志贺氏菌的危害
优点
操作简便、快速。
缺点
可能出现假阳性或假阴性结果，特异性不 如细菌培养法。
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
通过扩增志贺氏菌的特异性基因片段，实现 快速、灵敏的检测。
优点
灵敏度高、特异性强、检测速度快。
基因芯片技术
利用芯片上固化的探针与样本中的目标基因 进行杂交，实现高通量检测。
缺点
仪器设备和检测技术要求较高，成本也较高。
简便操作
检测方法应具有简便、易 操作的特点，以便在基层 医疗机构和现场环境中广 泛应用。
技术展望
分子生物学技术
随着分子生物学技术的发展，利 用基因芯片、高通量测序等技术 有望提高志贺氏菌检测的灵敏度
和特异性。
免疫学方法
开发特异性强、灵敏度高的免疫 学检测方法，如酶联免疫吸附试 验（ELISA）、免疫荧光技术等， 将为志贺氏菌的快速检测提供有
通过检测环境中志贺氏菌的分布和数量，采取有效的消杀措施，降低疾病传播的风险。
05
志贺氏菌检测的挑战与展望
检测挑战
灵敏度与特异性
志贺氏菌检测需要高灵敏 度和特异性，以避免假阳 性或假阴性的结果，给临 床诊断和治疗带来困扰。
快速检测
在感染早期快速准确地检 测志贺氏菌对于及时治疗 和防控疾病传播至关重要。
抵抗力较强
志贺氏菌对理化因素的抵 抗力较强，在粪便、土壤、 食品等外界环境中可存活 数周至数月之久。
志贺氏菌的传播途径
粪口途径传播
志贺氏菌主要通过消化道传播， 通过污染的食物、水或与感染者 的接触而感染。
直接接触感染
志贺氏菌也可通过直接接触感染 者的分泌物或接触被污染的物品 而传播。
志贺氏菌的危害
优点
操作简便、快速。
缺点
可能出现假阳性或假阴性结果，特异性不 如细菌培养法。
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
通过扩增志贺氏菌的特异性基因片段，实现 快速、灵敏的检测。
优点
灵敏度高、特异性强、检测速度快。
基因芯片技术
利用芯片上固化的探针与样本中的目标基因 进行杂交，实现高通量检测。
缺点
仪器设备和检测技术要求较高，成本也较高。
简便操作
检测方法应具有简便、易 操作的特点，以便在基层 医疗机构和现场环境中广 泛应用。
技术展望
分子生物学技术
随着分子生物学技术的发展，利 用基因芯片、高通量测序等技术 有望提高志贺氏菌检测的灵敏度
和特异性。
免疫学方法
开发特异性强、灵敏度高的免疫 学检测方法，如酶联免疫吸附试 验（ELISA）、免疫荧光技术等， 将为志贺氏菌的快速检测提供有
4789.5志贺菌检验
对可疑的食品，包括在使用前需用手处理的或 轻微加热的产品，且其酸度范围由PH5.5至6.5 之间。一般来说，当食品中含有大量的大肠菌 群，大肠杆菌与沙门氏菌时，同时即可疑含有 志贺氏菌。
现行GB/T 4789.5-2003标准不足处
1. 采用的GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后大肠菌
的生长速度大大超过志贺氏菌,所以检测效果较差
2. 使用的分离平板SS对志贺1型有抑制 3. 检验方法与现行的其它国家的标准存在差异
修 订 原 则
1.以原国标为基础，保持与原标准的连续性
考虑基层单位方法的可操作性，对增菌步骤、培养条件尽可能 简化；生化反应方面亦尽量沿用原标准中的方法
2.与国际接轨的原则
该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ，部分参 考采用了美国FDA、NMKL等标准
培 养 特 性
志贺氏菌属于革兰氏阴性短杆菌； 无芽孢、无荚膜、无鞭毛、不运动 需氧或兼性厌氧，营养要求不高，能在普通培 养基上生长 能利用葡萄糖与其他碳水化合物，产酸不产气。 除A群外，B 、 C 、 D群均能发酵甘露醇，除 D群外，A 、 C和D群均不发酵乳糖； D群具 有鸟氨酸脱羧酶
菌体（0）抗原 1.型特异性抗原：化学组成为多糖，是光滑型菌株所 含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常 随之消失，根据所含的型抗原不同，可将志贺菌属分 为A、B、C、D四个群及39个抗原型。 2.群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌 体抗原的一种。特异性较低，主要存在于B群。根据所 含的群抗原不同，可将一些菌型分为多种亚型。
西蒙氏柠檬酸盐实验
挑取少量琼脂培养物接种，于36±1℃培 养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌 落生长，培养基从绿色转为蓝色。
志贺氏菌检测
志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g ,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎lmin ,或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培育6〜8h。
培育时间视细菌生长状况而定，当培育液消失稍微混浊时即应中止培育。
二、分别和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36工培育18~24h e志贺氏菌在这些培育基上呈现无色透亮不发酵乳糖的菌落。
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。
一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培育18~24h ,分别观看结果。
下述培育物可以弃去：a.在三糖铁琼脂斜面上呈扩散生长的培育物；b.在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培育物;C.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培育物；d.产气的培育物；e.有动力的培育物；f.产生硫化氢的培育物。
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培育物，做玻片凝集试验。
先用4种志贺氏菌多价血清检查，假如由于K抗原的存在而不消失凝集，应将菌液煮沸后再检查；假如呈现凝集，则用Al、A2、B群多价和D群血清分别试验。
如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表10可先用群因子血清检查，再依据群因子血清消失凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。
假如鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。
四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖镀西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱竣酶pH7.2尿素KCN生长水杨昔和七叶昔的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培育物均为阴性结果。
志贺氏菌检测
志贺氏菌检测【1 】1 装备和材料除微生物实验室通例灭菌及造就装备外,其他装备和材料如下：1.1 恒温造就箱：36℃±1℃;1.2 冰箱：2℃～5℃;1.3 膜过滤体系;1.4 厌氧造就装配：℃±1℃;1.5 电子天平：感量0.1g;1.6 显微镜：10×～100×;1.7 均质器;1.8 振荡器;1.9 无菌吸管：1ml（具刻度）.10ml（具刻度）或微量移液器及吸头;1.10 无菌均质杯或无菌均质袋：容量500ml;1.11 无菌造就皿：直径90mm;1.12 pH计或pH比色管或周详pH试纸;1.13 全主动微生物生化剖断体系.2 造就基和试剂3.1 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录中1.3.2 麦康凯（MAC）琼脂：见附录中2.3.3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录中3.3.4三糖铁（TSI）琼脂：见附录中4.3.5养分琼脂斜面：见附录中5.3.6半固体琼脂：见附录中6.3.7葡萄糖铵造就基：见附录中7.3.8尿素琼脂：见附录中8.3.9β-半乳糖苷酶造就基：见附录中9.0氨基酸脱羧酶实验造就基：见附录中10.1糖发酵管：见附录中11.2西蒙氏柠檬酸盐造就基：见附录中12.3粘液酸盐造就基：见附录中13.4蛋白胨水.靛基质试剂：见附录中14.5志贺氏菌属诊断血清.6生化剖断试剂盒.4 操纵步调4.1 增菌以无菌操纵取检样25g（ml）,参加装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯,用扭转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质;或参加装有225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中,用拍击式均质器持续均质1min～2min,液体样品振荡混匀即可.于℃±１℃,厌氧造就16h～20h.4.2 分别取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色造就基平板上,于36℃±1℃造就20h～24h,不雅察各个平板上发展的菌落形态.宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌.若消失的菌落不典范或菌落较小不轻易不雅察,则持续造就至48h再进行不雅察.志贺氏菌在不合选择性琼脂平板上的菌落特点见表1.表1 志贺氏菌在不合选择性琼脂平板上的菌落特点4.3 初步生化实验4自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典范或可疑菌落,分别接种TSI.半固体和养分琼脂斜面各一管,置36℃±1℃造就20h～24h,分别不雅察成果.4凡是三糖铁琼脂中斜面产碱.底层产酸（发酵葡萄糖,不发酵乳糖,蔗糖）.不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）.不产硫化氢.半固体管中无动力的菌株,挑取其4中已造就的养分琼脂斜面上发展的菌苔,进行生化实验和血清学分型.4.4 生化实验及附加生化实验4生化实验用4中已造就的养分琼脂斜面上发展的菌苔,进行生化实验,即β-半乳糖苷酶.尿素.赖氨酸脱羧酶.鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分化实验.除宋内氏志贺氏菌.鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型,鲍氏志贺氏菌13型的β-半乳糖苷酶为阳性以外,其余生化实验志贺氏菌属的造就物均为阴性成果.别的因为福氏志贺氏菌6型的生化特点和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌类似,须要时还需加做靛基质.甘露醇.棉子糖.甘油实验,也可做革兰氏染色检讨和氧化酶实验,应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌.生化反响不相符的菌株,即使能与某种志贺氏菌分型血清产生凝聚,仍不得剖断为志贺氏菌属.志贺氏菌属生化特点见表2.表2 志贺氏菌属四个群的生化特点4附加生化实验因为某些不生动的大肠埃希氏菌（）.A-D（Alkalescens-D isparbiotypes碱性-异型）菌的部分生化特点与志贺氏菌类似,并能与某种志贺氏菌分型血清产生凝聚;是以前面生化实验相符志贺氏菌属生化特点的造就物还需另加葡萄糖胺.西蒙氏柠檬酸盐.粘液酸盐实验(36℃造就24h～48h).志贺氏菌属和不生动大肠埃希氏菌.A-D菌的生化特点差别见表3.表3 志贺氏菌属和不生动大肠埃希氏菌.A-D 菌的生化特点差别4如选择生化剖断试剂盒或全主动微生物生化剖断体系,可依据4的初步断定成果,用4中已造就的养分琼脂斜面上发展的菌苔,应用生化剖断试剂盒或全主动微生物生化剖断体系进行剖断.4.5 血清学剖断4抗原的预备志贺氏菌属没有动力,所以没有鞭毛抗原.志贺氏菌属重要有菌体（O）抗原.菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原.一般采取1.2%～1.5%琼脂造就物作为玻片凝聚实验用的抗原.注1：一些志贺氏菌假如因为K抗原的消失而不消失凝聚反响时,可挑取菌苔于1ml心理盐水做成浓菌液,100℃煮沸15min～60min去除K抗原后再检讨.注2：D群志贺氏菌既可能是滑腻型菌株也可能是光滑型菌株,与其他志贺氏菌群抗原不消失交叉反响.与肠杆菌科不合,宋内氏志贺氏菌光滑型菌株不一定会自凝.宋内氏志贺氏菌没有K抗原.4凝聚反响在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取一环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在个中一个区域下部加1滴抗血清,在另一区域下部参加1滴心理盐水,作为对比.再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液.将玻片竖直动摇混杂1min,并对着黑色布景进行不雅察,假如抗血清中消失凝聚成块的颗粒,并且心理盐水中没有产生自凝现象,那么凝聚反响为阳性.假如心理盐水中消失凝聚,视作为自凝.这时,应挑取统一造就基上的其他菌落持续进行实验.假如待测菌的生化特点相符志贺氏菌属生化特点,而其血清学实验为阴性的话,则按4注1进行实验.附录造就基和试剂1 志贺氏菌增菌汤-新生霉素（Shigella broth）1.1 志贺氏菌增菌肉汤成分蒸馏水1000mlp±1.制法将以上成分混杂加热消融,冷却至25℃阁下校订pH,分装恰当的容器,121℃灭菌15min,掏出后冷却至50℃～55℃μg/ml）,分装225ml备用.注：如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存一个月.1.2 新生霉素溶液1.成分蒸馏水1000ml制法μm过滤膜除菌,如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存一个月.1.3 临用时每225ml志贺氏菌增菌肉汤（1.1）参加5ml新生霉素溶液（1.2）,混匀.2 麦康凯（MAC）琼脂2.1 成分3号胆盐蒸馏水1000mlp±2.2 制法将以上成分混杂加热消融,冷却至25℃阁下校订pH,分装,121℃高压灭菌15min.冷却至45℃～50℃,倾泻平板.注：如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存二周.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂3.1 成分L-赖氨酸蒸馏水1000ml±3.2 制法除酚红和琼脂外,将其他成分参加400ml蒸馏水中,煮沸消融,校订pH.另将琼脂参加600ml蒸馏水中,煮沸消融.将上述两溶液混杂平均后,再参加指导剂,待冷至50℃～55℃倾泻平皿.注：本造就基不须要高压灭菌,在制备进程中不宜过火加热,防止下降其选择性,贮于室温暗处.本造就基宜于当天制备,第二天应用.应用前必须去除平板概况上的水珠,在37℃～55℃温度下,琼脂面向下.平板盖亦向下烘干.别的如设置装备摆设好的造就基不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存二周.4 三塘铁（TSI）琼脂4.1 成分硫酸亚铁铵(NH4)2Fe(SO4)·6H2蒸馏水1000ml±4.2 制法除酚红和琼脂外,将其他成分加于400ml蒸馏水中,搅拌平均,静置约10min,加热使完整熔解,冷却至25℃阁下校订pH至±.另将琼脂加于600ml蒸馏水中,静置约10min,加热使完整熔解.将两溶液混杂平均,参加5%酚红水溶液5ml,混匀,分装小号试管,每管约3ml.于121℃灭菌15min,制成高层斜面.冷却后呈桔红色.如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存一个月.5 养分琼脂斜面5.1 成分蛋白胨10.0g牛肉膏氯化钠琼脂15.0g蒸馏水1000mlpH 7.0±5.2 制法将除琼脂以外的各成分消融于蒸馏水内,参加15%氢氧化钠溶液约2ml,冷却至25℃阁下校订pH至±.参加琼脂,加热煮沸,使琼脂熔解.分装小号试管,每管约3ml.于121℃灭菌15min,制成斜面.注：如不立刻应用,在2℃～8℃前提下可储存二周.6 半固体琼脂6.1 成分～蒸馏水100ml±6.2 制法按以上成分派好,加热消融,校订pH,分装小试管,121℃灭菌15min,竖立凝固备用.7 葡萄糖胺造就基7.1 成分硫酸镁（MgSO4·蒸馏水1000ml±7.2 制法先将盐类和糖消融于水内,校订pH,再参加琼脂加热消融,然后参加指导剂.混杂平均后分装试管,121℃高压灭菌15min.制成斜面备用.8 尿素琼脂8.1 成分蛋白胨1.0g氯化钠蒸馏水1000mlpH 7.2将上述成分参加蒸馏水中,煮沸消融,调节pH,分装小试管,121℃高压灭菌15min.8.2 制法除酚红和尿素外的其他成分加热消融,冷却至25℃阁下校订pH,参加酚红指导剂,混匀,于121℃灭菌15min.冷至约55℃,参加用μm过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100ml,混匀,以无菌操纵分装灭菌试管,每管约3m l～4ml,制成斜面后放冰箱备用.8.3 实验办法挑取琼脂造就物接种,在36℃±1℃造就24h,不雅察成果.尿素酶阳性者因为产碱而使造就基变成红色.9 β-半乳糖苷酶造就基9.1 液体法（ONPG法）成分邻硝基苯β±±9.1.2制法将ONPG溶于缓冲液内,参加蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于10mm×75mm试管内,每管l,用橡皮塞塞紧.9.1.3实验办法自琼脂斜面挑取造就物一满环接种,于36℃±1℃造就1h～3h和24h不雅察成果.如β-D-半乳糖苷酶产生,则于1h～3h变黄色,如无此酶则24h不变色.9.2 平板法（X-Gal法）成分5-溴-4-氯-3-吲哚-β蒸馏水1000ml±制法将各成分加热煮沸于1L水中,冷却至25℃阁下校订pH,115℃高压灭菌10min.倾泻平板避光冷藏备用.实验办法挑取琼脂斜面造就物接种于平板,划线和点种均可,于36℃±1℃造就18h～24h不雅察成果.假如β-D-半乳糖苷酶产生,则平板上造就物色彩变蓝色,如无此酶则造就物为无色或不透明色,造就48h～72h后有部分转为淡粉红色.10 氨基酸脱羧酶实验造就基10.1 成分蛋白胨5.0g1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液L型或DL型赖氨酸和鸟氨酸/100ml或/100ml蒸馏水1000ml±10.2 制法除氨基酸以外的成分加热消融后,分装每瓶100ml,分别参加赖氨酸和鸟氨酸.L-氨基酸按0.5%参加,DL-氨基酸按1%参加,再校订pH至±.对比造就基不加氨基酸.分装于灭菌的小试管内,每管ml,上面滴加一层白腊油,115℃高压灭菌10min.10.3 实验办法从琼脂斜面上挑取造就物接种,于36℃±1℃造就18h～24h,不雅察成果.氨基酸脱羧酶阳性者因为产碱,造就基应呈紫色.阴性者无碱性产品,但因葡萄糖产酸而使造就基变成黄色.阴性对比管应为黄色,空白对比管为紫色.11 糖发酵管11.1 成分磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2蒸馏水1000ml±11.2 制法11葡萄糖发酵管按上述成分派好后,按％参加葡萄糖,25℃阁下校订pH,分装于有一个倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min.11其他各类糖发酵管可按上述成分派好后,分装每瓶100ml,121℃高压灭菌15min.另将各类糖类分别配好10％溶液,同时高压灭菌.将5ml糖溶液参加于100ml造就基内,以无菌操纵分装小试管.注：蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采取过滤法除菌.11.3 实验办法从琼脂斜面上挑取小量造就物接种,于36℃±1℃造就,一般2d～3d.迟缓反响需不雅察14d～30d.12 西蒙氏柠檬酸盐造就基12.1 成分氯化钠g硫酸镁（MgSO4·7H2O）g磷酸二氢铵g磷酸氢二钾g柠檬酸钠g琼脂20g0.2%溴麝喷鼻草酚蓝溶液ml蒸馏水1000ml±12.2 制法先将盐类消融于水内,调至pH,参加琼脂,加热熔解.然后参加指导剂,混杂平均后分装试管,121℃灭菌15 min.制成斜面备用.12.3 实验办法挑取少量琼脂造就物接种,于36℃±1℃造就4d,天天不雅察成果.阳性者斜面上有菌落发展,造就基从绿色转为蓝色.13 粘液酸盐造就基13.1 测试肉汤成分酪蛋白胨g溴麝喷鼻草酚蓝溶液g蒸馏水1000ml粘液酸g±制法慢慢参加5N氢氧化钠以消融粘液酸,混匀.其余成分加热消融,参加上述粘液酸,冷却至25℃阁下校订pH至,分装试管,每管约5ml,于121℃高压灭菌10min. 13.2 质控肉汤成分酪蛋白胨g溴麝喷鼻草酚蓝溶液g蒸馏水1000ml±制法所有成分加热消融,冷却至25℃阁下校订pH,分装试管,每管约5ml,于121℃高压灭菌10min.13.3 实验办法将待测新颖造就物接种测试肉汤和质控肉汤,于36℃±1℃造就48h不雅察成果,肉汤色彩蓝色不变则为阴性成果,黄色或稻草黄色为阳性成果.14 蛋白胨水.靛基质试剂成分蛋白胨(或胰蛋白胨) g氯化钠g蒸馏水1000mL14.2 制法按上述成分派制,分装小试管,121℃高压灭菌15 min.注：此试剂在2℃～8℃前提下可储存一个月.14.3 靛基质试剂柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛消融于75ml戊醇中.然后迟缓参加浓盐酸25ml.欧－波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛消融于95ml95%乙醇内.然后迟缓参加浓盐酸20ml.14.4 实验办法挑取少量造就物接种,在36℃±1℃造就1d～2d,须要时可造就4d～5d.参加柯凡克试剂约l,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或参加欧－波试剂约ml,沿管壁流下,笼罩于造就液概况,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色.注：蛋白胨中应含有丰硕的色氨酸.每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种剖断后方可应用,此试剂在2℃～8℃前提下可储存一个月.。
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序一、目的本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法，以规范操作程序，保证检测数据的有效性。
二、适用范围：本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。
三、生物安全要求标本及相应的致病菌操作必须在BSL-2生物安全实验室的生物安全柜中进行。
四、试剂及仪器设备4.1试剂采便盒、Cary-Blair运送培养基、亚硒酸增菌液（SF）、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂（XLD）、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基（YS）、三糖铁（TSI）、动力-吲哚-尿素培养基（MIU）、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E生化试剂条、磁珠菌种保存管4.2 仪器设备恒温培养箱、微生物鉴定仪五、采样方法5.1 标本应为新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子，最优标本是转移到Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。
肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。
5.2 粪便标本：应采集自然排出的新鲜粪便，取稀水样、粘血样、脓血样，黏液样部分。
盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器，避免混入尿液、水和其他物质。
5.3肛拭标本：若无法获得粪便（如排便困难或婴幼儿），也可以采用肛拭子，即无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内4-5cm处〈儿童约2-3cm），同一方向轻轻旋转2-3周。
以目测能见到粪便为准。
插入Cary-Blair运送培养基。
5.4 标本采集后立即送至实验室进行检测，若室温保存，不能超过1h；如不能立即送检，应放入Cary-Blair运送培养基中冷藏条件下24小时内送检。
六、检验程序七、操作步骤7.1 分别标记一个XLD平板（或YS平板、麦康凯平板）和1管9ml改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）（或SF增菌液或沙门志贺培养液）。
志贺氏菌检验
志贺氏菌检验志贺氏菌属于肠杆菌科，是一种革兰氏阴性菌，会引起肠道感染，引发肠炎，当人出现连续性腹泻、腹痛等症状的时候，就需要考虑是否感染志贺氏菌。
志贺氏菌的传播途径主要是食物和水，比如沙拉、土豆、金枪鱼、虾、奶制品等，在密闭以及不卫生的条件下志贺氏菌会迅速传播，而且经常出现在人员比较密集的地方，比如餐厅、食堂等地。
食源性志贺氏菌的传播主要是因为从事食品工作的人员感染了志贺氏菌，并且将其传播到食物上所引起的，另外，保存食物的温度不当，也可能引起志贺氏菌。
志贺氏菌检验是临床上检验肠道感染疾病的一个重要途径，在检测过程中常用的方法有以下几种。
一、生化鉴定法常规的生化鉴定方法是志贺氏菌检验过程中的常用方法，需要对细菌进行增殖培养、分离、生化试验、血清学检验等步骤来完成，步骤比较繁琐，而且耗时较长，每一次一般只能检验一个样品，但是检测的结果比较准确，检测稳定性较高，假阳性率低。
二、免疫学检验方法免疫学是检验志贺氏菌最快速、准确的方法，特异性较强，而且灵敏度很高，主要的免疫学检验方法有以下几种：第一，酶联免疫法。
这种方法的灵敏度很高，而且简单快速，检测过程比较稳定，可以进行自动化操作，是志贺氏菌检测过程中最快速的一种方法。
但是，使用酶联免疫法进行检验的时候，影响检测结果的因素较多，而且假阳性率高，所以还需要采用其他的方法进行配合检验。
第二，SPA协同凝集法。
这种方法是使用已知标准血清吸附到含Ａ蛋白的金黄色葡萄球菌表面之后，让金黄色葡萄球菌成为吸附抗体的载体，再根据吸附的结果来诊断是否感染志贺氏菌的一种方法。
三、分子生物学方法分子生物学是建立在很多其他的检测技术基础上的，敏感度高、检测快速，而且特意性高，是生物技术革命的一个重要产物，目前在志贺氏菌的检测过程中十分常见。
志贺氏菌的分子生物学检测方法有以下几种：第一，聚合酶链式反应法，比如常规PCR、多重PCR法、实时荧光PCR法和恒温荧光PCR法等。
以恒温实时荧光PCR法为例，这种方法的原理是利用环介导等温扩增反应为原理进行测量的方法，灵敏度很高，与传统的荧光测量方法相比，灵敏度高出2～5个数量级，而且测量十分迅速，荧光反应的时间较短，一般30-60分钟就可以完成荧光反应。
志贺氏菌检测标准
志贺氏菌检测标准志贺氏菌是一类常见的细菌，它造成了许多消化系统疾病。
为了确保消费者的安全，食品厂商和相关组织都需要进行志贺氏菌的检测。
本文将详细介绍有关志贺氏菌检测的标准，以确保消费者的健康和安全。
第一步骤：选择适当的样本检测开始前，需要选择适当的样本。
这可以是从环境，食品或水源中收集得到的，以确定是否存在志贺氏菌。
通常，人们从肉类，奶类以及其他易受污染的食品等选择样本进行检测。
选择适当的样本对于获得准确的结果非常重要。
第二步骤：采集样本在进行检测前，样本需要采集。
采集需采取规范化程序，以确保采集的样品实际上代表了被检测对象的状况。
采集过程需要避免污染样品，否则可能影响检测结果。
第三步骤：样本处理样品处理是保证测试数据准确性的关键，它可以消除干扰物质和旁边生物。
对于厨房和医疗设施，在处理志贺氏菌样品时应该采取严格的操作。
操作过程应精确规范，以保证样品不与其他样品的任何形式发生交叉污染。
第四步骤：实验室测试在实验室中进行测试是一种保证分析的准确性的方式。
志贺氏菌检测一般使用PCR或者培养方法进行。
不同的实验室可能采用不同的实验操作方法，因此测试数据包括实验的操作条件和环境条件等因素可能会有所不同。
第五步骤：分析测试结果在分析测试结果时，需要考虑到数据的相对稳定性和准确性问题。
分析的结果应包括相关的质量控制数据，以便能够确定测试是否正确进行。
正确的数据分析必须满足比如重复性，标准色谱的基本要求，因此必须引入知识和技术。
总之，通过以上五个步骤，我们可以实现对志贺氏菌的高效检测，并确保消费者的食品安全。
当然，我们在使用志贺氏菌检测标准时，需要时刻关注其技术竞争力和检测过程的规范化，这将为消费者提供一个安全的健康环境，成为维护人民健康的重要保障。
沙门氏菌和志贺氏菌的检测
H抗原：为不稳定的蛋白质抗原，加热或用乙 醇处理均被破坏。沙门菌H抗原有两个相,第一 相特异性较高称特异相,用小写英文字母a、b、 c表示，直至z，z以衙用z加阿拉伯数字表示， 如z1、z2、z3等，第二相抗原为沙门菌共有， 称非特异相，直接用1、2、3表示。同时有第 一相和第二相H抗原的细菌称为双相菌，仅有 一相者称单相菌。H抗原是定型的依据，其刺 激机体产生的抗体以IgG为主，与相应的抗血 清呈絮状反应。
沙门氏菌和志贺菌检测
熊长辉
概述 肠道感染细菌
肠道感染细菌是通过粪-口传播途径进行传播的一 类细菌。 主要包括 肠杆菌科细菌、霍乱弧菌、副溶血性弧
菌、幽门螺杆菌等。
肠杆菌科 中与医学有关的包括： 埃希菌属、志贺
菌属、沙门菌属、变形杆菌属等。
肠杆菌科共同特性
相似的形态染色 G 小杆菌，有鞭毛(痢疾杆菌外) 菌毛，某些有荚膜，无芽胞
斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑 色 斜面红色、底层黄色，无黑色 斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色
除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌 等也可出现上述反应。 • 吲哚试验：阴性
志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖， 不产生H2S。 大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不 产生H2S 。 沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖，大多数产生 H2S ，多数产气。 下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏 菌？
1）正常凝集价 正常人由于隐性感染或预防接种，血清中通常可含 有一定水平的凝集抗体，正常的凝集价可因不同地区而有差异 一般情况下，伤寒沙门菌O抗体的凝集价应在1∶80以上，H抗体 凝集价在1∶160以上，引起副伤寒沙门菌H抗体凝集价在1∶80以 上才有诊断意义 2）动态观察 有时单次效价不能定论，可在病程中逐周检查。若效 价逐次增加或恢复期效价比初次≥4倍者有意义
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志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6~8h。
培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
二、分离和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36℃培养18~24h。
志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。
一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18~24h，分别观察结果。
下述培养物可以弃去：a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b. 在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d. 产气的培养物；e. 有动力的培养物；f. 产生硫化氢的培养物。
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。
先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。
如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。
可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。
如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。
四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶pH7.2尿素KCN生长水杨苷和七叶苷的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。
必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。
生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。
已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵甘露醇棉子糖甘油的发酵靛基质试验志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。
但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。
五、结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。
志贺氏菌PCR检测技术进展志贺菌又称痢疾杆菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，引起人类细菌性痢疾。
按抗原结构和生化反应的不同可分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内氏志贺菌。
传统的检测方法必须经过增菌培养、分离培养和初步生化实验等步骤，操作烦琐费时。
分子杂交不但技术复杂，而且克隆培养时其大质粒极易丢失和基因突变，阳性率不高。
聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR），是一种体外DNA扩增技术，在体外利用模板DNA、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。
反复重复这一过程，模板DNA 就可得到大量扩增。
随着微生物基因组学的发展，对志贺菌的基因结构已经清楚，1987年Buysse等［1］发现志贺菌侵袭性质粒抗原H（invasive plasmid, ipaH）存在于各型志贺菌，同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不随传代而丢失。
1995年，Fasano等［2］报道两种志贺菌肠毒素SHET1、SHET2编码基因。
根据志贺氏菌特异性基因片段中的开放框架部分序列设计引物，可进行PCR检测。
现将志贺氏菌PCR检测技术研究进展综述如下。
1 常规PCR常规PCR必须知道待扩增目的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的引物。
1998年，Islam 等［3］以志贺菌ipaH基因序列为靶目标，设计一对引物（5′-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGA TAC-3′和5′-GCCGGTCAGCCACCCTA-3′），扩增产物为700 bp, 他们对临床上疑似菌痢的粪便标本进行检测，以PCR为金标准，培养法的敏感性和特异性分别为72%和100%。
他们对123株侵袭性大肠杆菌进行PCR检测，没有产生阳性结果。
常规PCR扩增后需做凝胶电泳鉴定，比较繁琐，而且扩增产物极易受到污染造成假阳性。
2 多重PCR多重PCR 是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
由于志贺菌有4个种群，具不同的抗原基因，只针对一种抗原基因的单一PCR，有时会漏检也不利于分群。
多重PCR能全方位高效率地检测志贺菌。
Thong等［4］针对志贺菌的set1A、set1B、ial、ipaH基因，设计不同的引物对，扩增序列分别为set1A（5′-TCA CGC TAC CAT CAAAGA-3′和5′-TAT CCC CCT TTG GTGGTA-3′）、set1B（5′-GTG AAC CTG CTG CCGA TA TC-3′和5′-ATT TGT GGA TAA AAATGA CG-3′）、ial(5′-CTG GAT GGT A TG GTGAGG-3′和5′-GGA GGC CAA CAA TTATTT CC-3′)、ipaH(5′-TGG AAA AAC TCA GTGCCT CT-3′和5′-CCA GTC CGT AAA TTCA TT CT-3′)在同一PCR反应体系内同时扩增set1A、set1B、ial、ipaH基因，对110株志贺菌其中福氏84株、宋内氏15株、痢疾10株、鲍特氏1株进行检测。
结果显示，重现性为100%，最低检测浓度为100 cfu/ml，并且不出现假阳性和假阴性。
与其他常规方法相比，多重PCR省时、省力、灵敏性更高，在做更多基因靶点时优势更突出，也可用于志贺菌的鉴定。
3 免疫磁珠分离PCR（IMS-PCR）免疫磁珠（immunomagnetic bead, IMB）就是将直径0.05～4 μm具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。
被检测样品在磁板背景下与IMB混合，若有相应的抗原存在，IMB就会将其捕获，利用磁性将IMB聚集，然后进行分离，用于PCR测定。
Islam 等［5］用志贺菌单克隆抗体包被环氧超顺磁珠，然后再采用IMB对标本中的志贺菌进行IMS，用于下一步的PCR检测。
他们根据志贺菌ial基因序列，设计一对引物（5′-CTGGATGGTATGGTGAGG-3′和5′-GGAGGCCAACAATTATTTCC-3′），探针（5′-CCATCTATTAGAA TACCTGTG-3′），预期的扩增产物为320 bp。
对248份粪便标本进行IMS-PCR检测，同时用基因探针平行检测。
结果57份痢疾1型和68份福氏菌全部检出，最低检出量分别为10个细菌/克。
与探针检测结果相符。
IMS-PCR技术最突出的优点是特异性强，可以明显提高准确性，快速仅用7 h就能完成检测结果。
4 免疫捕捉PCR（Immunocapture PCR）通过免疫捕捉结合PCR扩增来检测微量抗原的方法。
Peng等［6］在固相载体（聚苯乙烯）上包被志贺菌特异性抗体，捕获志贺菌后，用于下一步的PCR检测。
他们以志贺菌16 S核糖体rRND保守区域作为靶目标，设计引物（5′-AAACTCAAAGGAATTGAC-3′和5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′），预期扩增片断为500 bp，对35份样本进行检测，同时用常规PCR法和培养法平检测。
结果Immunocapture PCR 有23份阳性，培养法5份阳性，该法灵敏度高于常规PCR 4倍以上。
免疫捕捉PCR检测对象是完整的病原体,具有非常高的特异性和敏感性,在传染病的诊断、流行病学调查以及环境微生物的检测等诸多领域有着广阔的应用前景。
5 实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，染料类如SYBR Green I 则是利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。
前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高；但后者则简便易行，成本较低。
荧光探针技术是基于标记基团的荧光共振能转移原理（FRET）而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称FRET。
按其基团标记和能量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，如Taq Man TM探针、双杂交探针、分子信标、Amplisensor 和LUX TM Primers等。
5.1 Taq Man TM技术Taq Man TM技术是在一条20多bp的寡核苷酸探针的两端分别标记上荧光发射基团和淬灭基团，在PCR反应中设立标准品模板系列和阴性对照，根据FRET原理，探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，并计算出Rn值、△Rn值、Ct值和阈值。
Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数。
同时利用标准品模板系列绘制出标准曲线，结合各样品的Ct值，就可以确定样品的起初模板量。
Thiem等［7］以ipaH基因为靶目标，设计引物（5′-CCT TTT CCG CGT TCC TTG A-3′和5′-CGG AAT CCG GAG GTA TTG C-3′）和TaqMan探针(6-carboxyfluorescein-CGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCA-6-carboxytetramethylrhodamine)对肛拭标本进行实时PCR检测，同进行细菌培养，结果实时PCR与培养法符合率为93%，在培养法阴性的疑似细痢的标本中，实时PCR检出率为36%。
5.2 分子信标PCR 分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环形部分的碱基可与目标核苷酸序列互补，一般为15～30个核苷酸长；茎部是由互相配对的碱基组成，不能与目标基因相配对结合，一般5～7个核苷酸长；在3′和5′端分别接上发光基团和淬灭基团，当溶液中有特异模板时分子信标与模板杂交，从而破坏了发卡结构即实现了FRET，释放出荧光信号，荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比，从而实现了对目的基因的定量检测。