分子遗传学章基因操作技术及其应用.ppt

五、基因突变
细胞中核酸序列的改变通过基因表达有可能导致生物遗传 特征的变化。这种核酸序列的变化称为基因突变。
DNA序列中涉及单个核苷酸或碱基的变化称为点突变。点 突变通常有两种情况：一是一个碱基或核苷酸被另一种碱 基或核苷酸所替换；二是一个碱基的插入或缺失。
DNA链中某一个碱基被另一个所替换，这种替换的结果有 时可以不影响其所翻译的蛋白质的结构和功能。这种突变 称为同义突变。
二、基因的表达
• 1、转录 • 2、翻译
RNA分子是单链的，RNA在细胞核内产生，然后进入细 胞质，在蛋白质的合成中起重要作用。
RNA分子结构
RNA是核糖核酸的缩写，它与脱氧核糖核酸（DNA）的主要 差别在于： （1）RNA大多是单链分子； （2）含核糖而不是脱氧核糖； （3）4种核苷酸中，不含胸腺嘧啶（T），而是由尿嘧啶 （U）代替了胸腺嘧啶（T）。
（4） 原核和真核的mRNA一般都以AUG作为翻译起始的密 码子，GUG和UUG比较少见，但两者翻译的起始机制不同。原 核mRNA在5’端起始密码子AUG的上游有4~6个碱基的多嘌呤 序列，协助翻译过程的启动。在真核细胞中，转录完成后 mRNA被修饰加上了5’端帽子结构，该5’端帽子结构提供了
信号作用，使之能够从核内输送到细胞质，也让40S核糖体
1按 碱基互补的原则，合 成 一 条 单 链 RNA ， DNA 分子携带的遗传信息 被转移到RNA中，细胞 中的这一过程被称为 转录。转录发生在细 胞核中。
转录的开始与终止是 由启动子和终止子控 制的。
在真核生物细胞核中，DNA 链上具有不能编码蛋白质 的核苷酸片段即内含子和 编码蛋白质的核苷酸片段 即外显子。转录后新合成 的 mRNA 是 未 成 熟 的 mRNA ， 又称为前体mRNA或核内非 均一RNA，这些RNA需要经 过一定的加工过程。包括 剪 接 除 去 内 含 子 ， 5' 端 加 一个7-甲基鸟苷酸“帽子 ” 和 在 3' 端 加 上 一 个 多 聚 腺苷酸尾。

转录单位 （transcriptional unit）
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• 启动子：指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成
起始转录复合物的区域。
• 终止子：在转录过程中，提供转录终止信号的DNA序列
● 原核生物中的转录单位多为多顺反子，有操纵子结构； 真核生物中的转录单位多为单顺反子，无操纵子结构；
● 转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值
表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和T2 的DNA碱基比相似，而和细菌的碱基比 不同。由于T2感染细菌时注入的是DNA ，而在细胞里合成的是RNA 此表明什么？
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最 令 人 信 服 的 证 据 是 Hall.B.D 和 Spiegeman. S
DNA-RNA的杂交实验： 将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离
5’---ATGAGTA----3’ DNA
3’----TACTCAT----5’
链，与mRNA序列相同的那条链)
template (antisense strand，指根据碱基
互补原则指导mRNA生物合成的DNA链 )
RNA 5’----AUGAGUA----3’
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用实验证实mRNA的合成总是延着5′-3′方向进行的： E.coli 在 0C 时 需 13 秒 钟 才 能 加 上 一 个 核 苷 酸 ， 但 在 37C每秒就可加上40个核苷酸; 利用这个差别以14C来标记U,在0C培养E.coli，
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原核生物RNAPol (Core) 的结构与功能
Enzyme Movement
DNA coding strand (β’ ) Rewinding point (α)
Unwinding point (α)

Seymour Benzer引入了突变子(muton)，重组子(recon)和顺反子 (cistron) 分别定义突变、重组和功能的不可分割单位。
在噬菌体感染中，如果突变位于同一基因不同亚元件中，那么， 这只可能是基因内重组(intragenic recombination)的结果。这说明 基因可被分为更小的单位，这些单位可发生重组和突变。这样，重 组子和突变子等价于单个核苷酸对。
H3 、H4
■肽链氨基酸分布的不对称性
■H5组蛋白的特殊性：富含赖氨酸（24%）
■组蛋白的可修饰性
组蛋白的可修饰性
在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、 磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修饰作用较 普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。
所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白 所携带的正电荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变染 色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生 改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间 接影响转录活性。
C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总 量。
真核细胞基因组的最大特点是它含有大量 的重复序列，而且功能DNA序列大多被不 编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是 著名的“C值反常现象”。
（四）核小体(nucleosome)
1、定义：用于包装染色质的结构单位，是由DNA 链缠绕一个组蛋白核构成的。
●非编码区较多 多于编码序列(9:1) ● 含有大量重复序列 ■ 不重复序列/单一序列：在基因组中有一个或几个拷贝。真
核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。如：蛋清蛋 白、血红蛋白等
功能：主要是编码蛋白质。 ■ 中度重复序列：在基因组中的拷贝数为101~104。
如：rRNA、tRNA 一般是不编码蛋白质的序列，在调控基因表达中起重要作用

Hair, semen, etc. for criminal investigations.
Archived pathological specimens, for typing dead people when no
DNA has been stored, or testing tumors for genetic changes. Only
Heteroduplex analysis
Denaturing High Performance Liquid Chromatography
DNA chips
GWAS
Scanning technologies aim to find unknown mutations
in candidate or known disease genes.
核酸分子杂交
核酸分子杂交 ：
是指单链核酸分子 （DNA或RNA）在特定条件 下,与另一条互补的特异 核酸链形成稳定双链的过 程。
2021/8/27
主要依据： 碱基互补、 变性和复性
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几种分子间杂交
DNA:DNA
5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C
DNA:RNA
5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U
终止密码处产生终止密码，即所谓，会使基因表达 产生的多肽链缩短，失去或大大减弱肽链的功能。
终止密码突变（termination codon mutation）：突变
在原来终止密码处产生非终止密码，变成编码氨基 酸密码，叫做则其表达产物多肽链会延长，也会失 去或大大减弱正常多肽链的功能。
2021/8/27
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碱基缺失和插入突变

从DNA编码链上5’端到3’端方向的三联体核苷酸密码子（triplet codon）序列与蛋白质的N端到C端的氨 基酸序列相对应，这种对应关系称为遗传密码（genetic codon）。 DNA中的遗传信息是由信使RNA（messenger RNA, mRNA）介导而决定蛋白质的一级结构。 其中61个密码子编码各种氨基酸，3个密码子使蛋白质合成终止，故称终止密码子（termination codon）。 几种密码子编码同一种氨基酸，这称为密码子的简并性（degeneracy of the codon）。编码同一种氨基酸的 两种以上的密码子称为简并密码子（degenerate codon）或称同义密码子（synonym）。 密码子最后一位碱基因特异性降低的现象称为第三碱基的简并性（third-base degeneracy）。 除极少数例外，所有生物的遗传密码都是相同的，这种密码子的通用性（universality）表明生物是从共同 祖先而来的
1941年， Beadle和Tatum对粗糙脉孢菌 （Neurospora crassa）的进化突变型进行 研究时才发现了Garrod 的工作，明确提 出了“一个基因一个酶”（one gene-one enzyme）的理论。后来将“一个基因一 个酶”改为 “一个基因一种多肽”（one gene-one polypeptide）。这表明基因是通 过控制多肽的合成而影响生物遗传性状 的发育和表达（图1-4）。
1、分子遗传学的涵义 遗传学是以基因作为研究的核心，是研究基因的结构、功能、变异、传递和表达规律的学科。分 子遗传学是遗传学的一个分支学科，是在分子水平上研究基因的结构与功能以揭示生物遗传和变 异以及表达的分子机制。它研究的范畴包含基因在生命系统中的储存、组织结构、基因的复制与 传递的分子机制、基因表达与调控规律、基因表达产物的结构与功能、基因变异的分子机制、基 因在控制细胞分裂、生长和分化以及形态发生与个体发育中的作用机制 2、分子遗传学研究的任务 （1）研究遗传物质的分子结构与传递机制 遗传物质必须具备的特性是：①贮存并表达遗传信息；②.能把遗传信息传递给子代；③.物 理和化学性质稳定；④.含有遗传重组和变异的信息。 DNA；RNA；半保留复制， （2）研究遗传信息表达的分子机制 中心法则

反转录
cDNA (互补DNA）
DNA聚合酶 双链DNA
mRNA 反转录酶
cD？
依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻NA 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌 NA产物可能 是小的，不具有 多聚腺苷的模板 也被可利用限
• 第一链合成过程
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA
法除去RNA分子 3. cDNA克隆载体的制备。 4. ds- cDNA与载体DNA 相连。 5. 重组cDNA分子的导入和克隆。
一、 Total RNA——mRNA
❖ mRNA只占总RNA的1%-5%。 ❖ 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将
mRNA从总RNA中分离纯化。 ❖方法： 寡聚（dT）-纤维素柱层析法。
LacI
BL21（DE3 condonplus）
IPTG 诱导
破碎液 RoAmy1 (1.3 U/mL) RoAmy2 (0.5 U/mL) RoAmyX (0 U/mL)
BL21（DE3）
IPTG 诱导 破碎液
RoAmy1 (0.7 U/mL)
RoAmy2 (0.2 U/mL) RoAmyX (0 U/mL)
达亦不相同。相同的，尽管它们都是由单拷贝基 因转录而来的。 5. 各纯化载体DNA片段的制备。 2.双链cDNA 的合成。
1）单链cDNA 的合成：反转录法 2）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解 （RNaseH）
催化多聚核苷酸5'羟基末端磷酸化，或标记探针
在3'羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）---剪

限制性内切酶的发现，使得 DNA可以进行切割和重组，为 基因克隆和基因组分析提供了 工具。
Hale Waihona Puke 2001年人类基因组草图完成，为分子 遗传学检验技术的发展提供了
更全面的数据和信息。
分子遗传学检验技术的临床意义
诊断疾病
个体化治疗
通过对基因突变和异常表达的检测，可以 对遗传性疾病和肿瘤等进行早期诊断和预 防。
提供心理支持
对于检测结果可能导致心理压 力的患者，提供适当的心理支
持和辅导。
患者知情同意与隐私保护
提供全面的信息
向患者提供关于遗传检测的全面、准 确、易于理解的信息，包括目的、风 险、限制和可能的误用。
签署知情同意书
要求患者在完全了解相关信息后签署 知情同意书，以确保他们自愿接受检 测。
保护患者隐私
定期对仪器进行维护和校准，确保其性能和 准确性。
伦理问题的考虑与应对措施
01
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03
04
尊重患者隐私
确保患者个人信息和遗传信息 的安全，避免未经授权的泄露
。
知情同意
向患者充分解释遗传检测的目 的、风险、限制和结果的意义 ，确保患者自愿接受检测。
避免基因歧视
确保患者不会因遗传信息而受 到不公平的待遇或歧视。
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分子遗传学检验技术在临床
中的应用
遗传疾病的诊断与预测
遗传疾病的诊断
分子遗传学检验技术通过对基因突变的分析，为遗传疾病的 诊断提供有力依据。例如，对唐氏综合征、威廉姆斯综合征 等常见遗传疾病的基因检测，有助于早期确诊。
遗传疾病的预测
通过对家族遗传性疾病基因的检测，预测个体患病风险，为 制定预防措施和个性化健康管理方案提供科学依据。

1.3 基因组进化的分子基础
1. 突变 系指基因组中小段区域内核苷酸序列的改变。大多数突变是点突变，即核苷 酸序列中某一碱基取代了另一碱基，其他的突变则涉及一个或几个核苷酸的 插入或缺失。 2. 重组 系指染色体或DNA分子之间的交换与重组,涉及染色体区段或DNA序列之间的 新的连锁关系。 3. 转座 转座是基因组进化的一种重要方式，出现在几乎所有生物类型中。其结果是 一段DNA或其拷贝从基因组的一个位置转移到另一位置,并在插入位点两侧产 生一对很短的正向重复序列。
▪电泳
28s 18s
5s
（4） 核酸的凝胶电泳
➢当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测核酸 的分子量、纯度、结构变化、序列分析等
➢种类： ▪琼脂糖凝胶电泳（水平电泳） ▪聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直电泳， 分辨率可达1bp
常用于测序）
涌动率决定因素：分子大小en－coiled L：line SC：supercoiled
▪ 不同的结构域加倍或重组,产生具有创新功能的基因.真核生物 约19％的基因产生于外显子洗牌。
▪ ③可移动元件的转座和逆转座。 ▪ ④外源基因水平转移。
原核生物中DNA的水平转移是一种十分普遍的现象，可通 过接合转移、噬菌体转染、外源DNA的摄取等不同途径发生。
大多数有关动物种间基因转移主要集中在逆转录病毒及其转 座成分。 ▪ ⑤基因裂变(fission)和融合(fusion)，由一个基因分裂成两个
基因操作的主要方法和工 具
1. 分子生物学基本知识
1.1基因组（genome）：
生物所具有的携带遗传信息的遗传物质的 总和,是指生物细胞中所有的DNA，包括所有 的基因和基因间区域。
人的核基因组：30亿bp（最新资料说28.5亿） 2∼2.5万个蛋白编码基因