枯草芽孢杆菌E_20_发酵产生挥发性风味成分的GC_MS分析
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分析与检测
中国酿造
2010 年 第 9 期
总第 222 期 ·153·
枯草芽孢杆菌E20发酵产生挥发性风味成分的GC/MS分析
郭成栓1，欧阳蒲月1，谢 和2
（1.广东食品药品职业学院 中药和生物系，广东 广州 510520；2.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025）
摘 要：以枯草芽孢杆菌E20作为菌种，大豆作为培养基，在高温条件下固体发酵，用乙醚提取其挥发性成分，经GC/MS技术测定，鉴
0.98
32 17.97
n-tetradecane
正十四烷
1.60
39 20.21
α-muurolene
α-蛇麻烯
1.03
40
20.44
4-methyl-2，6-ditert- 4-甲基-2，6-二叔
butylphenol
丁基-苯酚
10.40
43 22.Biblioteka 6hexadecane正十六烷
1.47
47 23.94
2瓶大豆用500mL水进行提取，离心。将上清液放入三 角 烧 瓶 中 进 行 蒸 馏 ，馏 出 液 100mL 用 100mL 乙 醚 分 2 次 （50×50mL）进行抽提，然后将乙醚置于通风橱中蒸发至约 1mL，供GC/MS分析。 1.2.3 GC/MS气质联用仪分析条件
色 谱 柱 ：HP-5MS5 % PhenylMethyl Siloxane（30m× 0.25mm×0.25μm）弹 性 石 英 毛 细 管 柱 。柱 温 50℃（保 留 2min），以5℃/min升温至280℃，保持2min；气化室温度250℃； 载气为高纯He（99.999%）；柱前压为7.62psi，载 气流量 为1.0mL/min；进样量1μL（用乙醚将挥发油稀释的溶液）； 分流比40∶1；离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度 150℃ ；电 子 能 量 70eV；发 射 电 流 34.6Ma；倍 增 器 电 压 2047V；接口温度280℃；溶剂延迟3min；质量范围10amu~ 550amu。通过HPMSD化学工作站，结合NIST98标准质谱图 库和WILEY质谱图库，进行物质鉴定。按峰面积-归化法进 行计算求得各化学成分在挥发油中的相对含量。 2 结果与讨论 2.1 结果
通过气谱和质谱联用检测，共检出63种物质见附图。
WILEY质谱图库，进行物质鉴定，共鉴定出28种物质，大 多是酱香型白酒的挥发性酱香风味物质。鉴定出的物质 只占总物质种类的1/3，大多数物质没有鉴定出来，未检测 出的物质可能是一些不明确的新物质。
按峰面积归-化法对鉴定出的物质含量进行计算，进 而得到了各种物质各化学成分在挥发油中的相对含量见 附表。鉴定结果显示，鉴定出的酱香风味物质中含量最高 的为苯乙醛、4-甲基-2，6-二叔丁基-苯酚等。同时也检测到 了酱香型白酒中的一些特征性香味成分[9（] 如糠醛、2，3，5三甲基吡嗪、苯甲醛、4-乙烯基愈疮木酚等）。
收稿日期：2010-04-28 作者简介：郭成栓（1977-），男，河南南阳人，博士研究生，主要从事发酵工程及生物工程的相关研究工作。
ααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααα
表1 标准曲线回归方程、相关系数及检出限
Table 1. Regression equation of standard curve, correlation coefficient
组分 样品本底值/% 加标量/% 测定值/% RSD/% 回收率/%
乙醇
2.90
0.50
3.35
3.40
90.00
1.00
3.82
3.60
92.00
1.50
4.33
4.00
95.00
[1] GB/T 15038-20061. 葡萄酒、果酒通用分析方法 [S]. [2] GB/T 500948-2003. 食品卫生检验方法（理化部分）[S]. [3] 谢 文，丁慧瑛，章晓氡. 葡萄酒、果酒中乙醇含量的测定方法[J].色
heptadecane
正十七烷
1.02
53 25.56
phenanthrene
菲
1.58
54 25.73
nonadecane
正十九烷
1.07
59 29.08
eicosane
正二十烷
0.58
60 30.65
heneicosane
正二十一烷
0.61
通过HPMSD化学工作站，结合Nist98标准质谱图库和
0.1MPa灭菌30min。 1.1.3 试验器材
HP6890/HP5973 GC/MS联用仪（美国惠普公司）。 1.2 方法 1.2.1 发酵方法
将冰箱中保藏的菌种转接于斜面培养基上，置于37℃ 培养24h进行活化培养，连续活化2次。然后将活化后的菌 株接种到装有50mL培养基的250mL三角瓶中，200r/min振 荡培养24h作为种子培养基。50g发酵培养基加入250mL三 角瓶，灭菌后每瓶加入0.2mL种子液，按30℃、40℃、50℃进 行升温发酵，每一温度条件下发酵48h。 1.2.2 香味成分的提取方法
and detection limit
组分 浓度/%
回归方程式
线性系数 检出限/%
乙醇
2~4.5
y=3.614×102x-1.241
0.9999
0.01
2.4 精密度与回收率实验 对同一样品重复进行6次测定，并对该样品进行加标
实验，其回收率和相对标准偏差见表2。
2.5 葡萄酒样品分析 实验对3种葡萄酒进行分析，瓶 身 标 示 皆 为 12 % vol ，
(1. Department of Chinese Medicine and Biology，GuangDong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520, China; 2. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)
2.2 讨论 试验中检测到的物质如糠醛、2，3，5-三甲基吡嗪、苯
甲醛、4-乙烯基愈疮木酚等成分均是酱香型白酒酱香风味 的骨架成分[9]。这说明枯草芽孢杆菌在酱香型白酒茅台酒 挥发性酱香风味物质形成中发挥着重要的作用。
当然仅有骨架成分并不能酿造出优质白酒，白酒中的 一些微量成分虽然含量很低，但却发挥着重要的作用。白 酒中另外一些风味物质：如有机酸、酯等对白酒风味的形
5.13
ethylbenzene
乙基苯
1.44
3
5.30
p-xylene
对 - 二甲苯
0.49
4
6.12
methional
3- 甲硫基丙醛
0.55
5
6.57
cumene
乙丙基苯
0.49
7
7.46
benzaldhyde
苯甲醛
1.17
8
8.17
butylphenol
苯酚
1.21
9
8.49
trimethylpyrazine 2，3，5- 三甲基吡嗪 1.45
实际检测结果分别为11.6%vol、11.7%vol、11.6%vol。 3 小结
应用本方法测定葡萄酒中的乙醇浓度，其样液可直接 进样，线性范围宽，准确度及精密度令人满意，完全可适应 葡萄酒中乙醇含量的测定要求。 参考文献：
表2 方法准确度（n=6）和精密度
Table 2. Method accuracy (n=6) and precision
Abstract: Soybeans were fermented by Bacillus subtilis E20. The volatile components in product were extracted and identified by GC/MS. The main chemical components were phenyl acetaldehyde, 4-methyl-2,6-di-tert-butyl-phenol, indole, α-furan methanol, 2,3,5-trimethyl pyrazine, 2-acetyl thiazole, benzene, methanol, benzene ethanol, et al. These results indicated that Bacillus subtilis plays an important role in producing aroma compound in soy sauce production. Key words: soy sauce; Bacillus subtilis; GC/MS
定出的主要物质有苯基乙醛、4-甲基-2，6-二叔丁基-苯酚、吲哚、α-呋喃甲醇、2，3，5-三甲基吡嗪、2-乙酰基噻唑、苯甲醇、苯乙醇等酱
香型白酒的风味骨架成分，说明枯草芽孢杆菌在白酒酱香风味物质的形成中发挥着重要的作用。
关 键 词：酱香；枯草芽孢杆菌；GC/MS
中图分类号：O657.7
文献标识码：A
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株
兼性嗜热枯草芽孢 杆 菌 E20，分 离 自 贵 州 茅 台 酒 高 温大曲。 1.1.2 培养基
（1）斜面培养基：牛肉膏0.4g，蛋白胨1.0g，NaCl 0.4g， pH值7.0~7.2，121℃、0.1MPa灭菌30min。
（2）种子培养基：葡萄糖 10g，蛋白胨 5g，酵母膏5g， Na2HPO4 0.4g，KH2PO4 0.03g，CaCl2 0.02g，MgSO4·7H2O
附表 枯草芽孢杆菌E2050℃时发酵产生的挥发性风味物质检测结果
中国酿造
2010 年 第 9 期
总第 222 期 ·153·
枯草芽孢杆菌E20发酵产生挥发性风味成分的GC/MS分析
郭成栓1，欧阳蒲月1，谢 和2
（1.广东食品药品职业学院 中药和生物系，广东 广州 510520；2.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025）
摘 要：以枯草芽孢杆菌E20作为菌种，大豆作为培养基，在高温条件下固体发酵，用乙醚提取其挥发性成分，经GC/MS技术测定，鉴
0.98
32 17.97
n-tetradecane
正十四烷
1.60
39 20.21
α-muurolene
α-蛇麻烯
1.03
40
20.44
4-methyl-2，6-ditert- 4-甲基-2，6-二叔
butylphenol
丁基-苯酚
10.40
43 22.Biblioteka 6hexadecane正十六烷
1.47
47 23.94
2瓶大豆用500mL水进行提取，离心。将上清液放入三 角 烧 瓶 中 进 行 蒸 馏 ，馏 出 液 100mL 用 100mL 乙 醚 分 2 次 （50×50mL）进行抽提，然后将乙醚置于通风橱中蒸发至约 1mL，供GC/MS分析。 1.2.3 GC/MS气质联用仪分析条件
色 谱 柱 ：HP-5MS5 % PhenylMethyl Siloxane（30m× 0.25mm×0.25μm）弹 性 石 英 毛 细 管 柱 。柱 温 50℃（保 留 2min），以5℃/min升温至280℃，保持2min；气化室温度250℃； 载气为高纯He（99.999%）；柱前压为7.62psi，载 气流量 为1.0mL/min；进样量1μL（用乙醚将挥发油稀释的溶液）； 分流比40∶1；离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度 150℃ ；电 子 能 量 70eV；发 射 电 流 34.6Ma；倍 增 器 电 压 2047V；接口温度280℃；溶剂延迟3min；质量范围10amu~ 550amu。通过HPMSD化学工作站，结合NIST98标准质谱图 库和WILEY质谱图库，进行物质鉴定。按峰面积-归化法进 行计算求得各化学成分在挥发油中的相对含量。 2 结果与讨论 2.1 结果
通过气谱和质谱联用检测，共检出63种物质见附图。
WILEY质谱图库，进行物质鉴定，共鉴定出28种物质，大 多是酱香型白酒的挥发性酱香风味物质。鉴定出的物质 只占总物质种类的1/3，大多数物质没有鉴定出来，未检测 出的物质可能是一些不明确的新物质。
按峰面积归-化法对鉴定出的物质含量进行计算，进 而得到了各种物质各化学成分在挥发油中的相对含量见 附表。鉴定结果显示，鉴定出的酱香风味物质中含量最高 的为苯乙醛、4-甲基-2，6-二叔丁基-苯酚等。同时也检测到 了酱香型白酒中的一些特征性香味成分[9（] 如糠醛、2，3，5三甲基吡嗪、苯甲醛、4-乙烯基愈疮木酚等）。
收稿日期：2010-04-28 作者简介：郭成栓（1977-），男，河南南阳人，博士研究生，主要从事发酵工程及生物工程的相关研究工作。
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表1 标准曲线回归方程、相关系数及检出限
Table 1. Regression equation of standard curve, correlation coefficient
组分 样品本底值/% 加标量/% 测定值/% RSD/% 回收率/%
乙醇
2.90
0.50
3.35
3.40
90.00
1.00
3.82
3.60
92.00
1.50
4.33
4.00
95.00
[1] GB/T 15038-20061. 葡萄酒、果酒通用分析方法 [S]. [2] GB/T 500948-2003. 食品卫生检验方法（理化部分）[S]. [3] 谢 文，丁慧瑛，章晓氡. 葡萄酒、果酒中乙醇含量的测定方法[J].色
heptadecane
正十七烷
1.02
53 25.56
phenanthrene
菲
1.58
54 25.73
nonadecane
正十九烷
1.07
59 29.08
eicosane
正二十烷
0.58
60 30.65
heneicosane
正二十一烷
0.61
通过HPMSD化学工作站，结合Nist98标准质谱图库和
0.1MPa灭菌30min。 1.1.3 试验器材
HP6890/HP5973 GC/MS联用仪（美国惠普公司）。 1.2 方法 1.2.1 发酵方法
将冰箱中保藏的菌种转接于斜面培养基上，置于37℃ 培养24h进行活化培养，连续活化2次。然后将活化后的菌 株接种到装有50mL培养基的250mL三角瓶中，200r/min振 荡培养24h作为种子培养基。50g发酵培养基加入250mL三 角瓶，灭菌后每瓶加入0.2mL种子液，按30℃、40℃、50℃进 行升温发酵，每一温度条件下发酵48h。 1.2.2 香味成分的提取方法
and detection limit
组分 浓度/%
回归方程式
线性系数 检出限/%
乙醇
2~4.5
y=3.614×102x-1.241
0.9999
0.01
2.4 精密度与回收率实验 对同一样品重复进行6次测定，并对该样品进行加标
实验，其回收率和相对标准偏差见表2。
2.5 葡萄酒样品分析 实验对3种葡萄酒进行分析，瓶 身 标 示 皆 为 12 % vol ，
(1. Department of Chinese Medicine and Biology，GuangDong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520, China; 2. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)
2.2 讨论 试验中检测到的物质如糠醛、2，3，5-三甲基吡嗪、苯
甲醛、4-乙烯基愈疮木酚等成分均是酱香型白酒酱香风味 的骨架成分[9]。这说明枯草芽孢杆菌在酱香型白酒茅台酒 挥发性酱香风味物质形成中发挥着重要的作用。
当然仅有骨架成分并不能酿造出优质白酒，白酒中的 一些微量成分虽然含量很低，但却发挥着重要的作用。白 酒中另外一些风味物质：如有机酸、酯等对白酒风味的形
5.13
ethylbenzene
乙基苯
1.44
3
5.30
p-xylene
对 - 二甲苯
0.49
4
6.12
methional
3- 甲硫基丙醛
0.55
5
6.57
cumene
乙丙基苯
0.49
7
7.46
benzaldhyde
苯甲醛
1.17
8
8.17
butylphenol
苯酚
1.21
9
8.49
trimethylpyrazine 2，3，5- 三甲基吡嗪 1.45
实际检测结果分别为11.6%vol、11.7%vol、11.6%vol。 3 小结
应用本方法测定葡萄酒中的乙醇浓度，其样液可直接 进样，线性范围宽，准确度及精密度令人满意，完全可适应 葡萄酒中乙醇含量的测定要求。 参考文献：
表2 方法准确度（n=6）和精密度
Table 2. Method accuracy (n=6) and precision
Abstract: Soybeans were fermented by Bacillus subtilis E20. The volatile components in product were extracted and identified by GC/MS. The main chemical components were phenyl acetaldehyde, 4-methyl-2,6-di-tert-butyl-phenol, indole, α-furan methanol, 2,3,5-trimethyl pyrazine, 2-acetyl thiazole, benzene, methanol, benzene ethanol, et al. These results indicated that Bacillus subtilis plays an important role in producing aroma compound in soy sauce production. Key words: soy sauce; Bacillus subtilis; GC/MS
定出的主要物质有苯基乙醛、4-甲基-2，6-二叔丁基-苯酚、吲哚、α-呋喃甲醇、2，3，5-三甲基吡嗪、2-乙酰基噻唑、苯甲醇、苯乙醇等酱
香型白酒的风味骨架成分，说明枯草芽孢杆菌在白酒酱香风味物质的形成中发挥着重要的作用。
关 键 词：酱香；枯草芽孢杆菌；GC/MS
中图分类号：O657.7
文献标识码：A
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株
兼性嗜热枯草芽孢 杆 菌 E20，分 离 自 贵 州 茅 台 酒 高 温大曲。 1.1.2 培养基
（1）斜面培养基：牛肉膏0.4g，蛋白胨1.0g，NaCl 0.4g， pH值7.0~7.2，121℃、0.1MPa灭菌30min。
（2）种子培养基：葡萄糖 10g，蛋白胨 5g，酵母膏5g， Na2HPO4 0.4g，KH2PO4 0.03g，CaCl2 0.02g，MgSO4·7H2O
附表 枯草芽孢杆菌E2050℃时发酵产生的挥发性风味物质检测结果
