微生物的计数——血球计数板法
【摘要】测定微生物细胞数量的方法很多，有分光光度法、显微直接计数法和平板计数法。
分光光度法比较简便，易操作，但是会使数据严重偏大。
而平板计数法则会使实验数据严重偏小。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。
两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
本实验采用血球计数板法，主要目的是了解血球计数板法的构造和使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。
一、实验目的与要求
1、了解微生物计数常用的三种方法：分光光度法；平板计数法；血球计数板法。
2、了解血球计数板的构造和使用方法。
3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。
二、基本原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。
此法的优点是直观、快速。
将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。
由于计数室的容积是一定的（0.1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。
由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。
中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方
格数都是相同的，即16×25=400小方格。
每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数
因1ml=1cm3=1000mm3，
=50000A·B（个）
同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则
三、实验材料
1）菌种：酿酒酵母菌
2）用品：显微镜、血球计数板、酒精灯、盖玻片、接种环、番红染液、胶头滴管。
四、实验方法
1、实验流程图
2、实验步骤
1）镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。
若有污物，则需清洗后才能进行计数。
2）将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。
3)取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
然后在显微镜下找到计数室。
若计数室沾有杂质或者菌体，要用蒸馏水冲洗计数板，用滤纸吸干其上的水分。
然后再放到显微镜下找到计数室。
4)将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。
5)静置片刻，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。
由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
6)计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。
如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。
如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
本实验采用25格×16格的血球计数板。
计数时应数5个大方格。
7)计数。
每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
8)测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
9）计算结果。
可用以下公式进行计算
（1）16格×25格的血球计数板计算公式：
细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数
（2）25格×16格的血球计数板计算公式：
细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数
五、实验结果
六、结论与分析
1、误差来源
本次试验中我们组用的是2号酵母培养液，是本次试验所用的酵母培养液中浓度最高的培养液。
但是经过老师分析，实验数据仍然偏大的一点。
产生这种误差的原因大概如下：
①酵母细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。
其中由于操作人员不注意细节，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filederror）。
②由于时间的关系，实验计数的次数太少，难以得到准确均匀的实验数据。
在实验过程中，操作人员也存在一定的不严谨性，导致实验结果产生误差。
由于
没有足够多的平行数据，难以用科学的计数方法进行结果的计算，因此难以得到比较准确的实验数据。
因此，搞好酵母细胞计数的质量控制一般需采用以下措施。
1）避免技术误差，纠正仪器误差
①所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。
②严格操作，从消毒、稀释、加样到计数都应规范，尤其应注意的是样品稀释要作到充分混匀。
必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。
2）缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或，而我们所能计数的细胞分布范围是有限的，由此造成的计数误差称为计数域误差或分布误差。
缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。
2、不足之处
血球计数板在显微镜下直接进行测定。
它观察在一定的容积中的微生物的个体数目，然后推算出含菌数，简便快捷。
但是在计数时包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。
这样得出结果往往偏高，因此适用于对形态个体较大的菌体或孢子进行计数。
七、思考题
1、试述血球计数板的计数原理。
为什么用两种规格不同的计数板计数同一样品，结果是一样的？
答：每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。
计数池画有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大方格，每个大格面积为1.0mm;.容积为0.1mm，中央大方格用双线分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域，用单线划分为16个小方格。
四角的4个大方格是白细胞计数区域，用单线划分为16个中方格。
血球计数板的计数原理：通过对一定数量的小格计数，
根据相应小格所占的体积，可以推算出单位体积的溶液中微生物细胞的密度和总数。
因为不同规格用不同的计算公式计算，最后得出的都是微生物细胞的密度和总数，所以结果一样。
