蛋白质溶解度的测定

一．蛋白质的起泡性测定方法1.配制l0ml 1%蛋白分散液（pH 8. 05的0.05mo1/L Tris-HC1缓冲液），在室温的条件下，利用高速分散机均质l min，快速转移到25m1的量筒中，，每30min记录一次泡沫体积。

每个样品重复三次，取平均值。

2.采用搅打发泡测定法[29]：将蛋清蛋白溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，配成3%的蛋清蛋白溶液。

取200ml3%的蛋清蛋白溶液，在A-88组织捣碎匀浆机中，以8000r/min的转速打泡3min,测其泡沫体积，记录为V0，按下式计算起泡度（FAI）： FAI(%)=(V0-200/200) ×100静置30分钟后，测泡沫体积，记录为V1，按下式计算泡沫稳定性（FS）：FS(%)= (V1-200/200 )×1003.参照Hammershoj 等介绍的方法[36]。

首先将全蛋液稀释到5%（v/v），然后取100mL的稀释液，10000r/min速度搅拌1min。

记录均质停止时和停止后30min的泡沫体积与液体体积，起泡力与泡沫稳定性分别用OR与FS表示，计算公式如下：起泡性（OR）=Vf0 /Vli 2-3泡沫稳定性（FS）=Vf30/Vf0 2-4式2-3 与2-4中：Vf0—零时刻时泡沫的体积（mL）；Vli—初始阶段的液体体积（100mL）；Vf30—静置 30min后的泡沫体积。

Hammershoj, M., Qvist, K. B. Importance of hen age and egg storage time for egg albumen foaming [J]. Lebensmittel-Wissenschaft-Technologie, 2001, 34: 118–120.4.二．乳化性及乳化稳定性的测定方法用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）配制1%的蛋白样品，取1 mL色拉油与3 mL待测溶液于均质机中均质剪切1min，分别于0min和10min时从底部取50 μL用0.1% SDS 25 mL稀释后测OD500乳化活性指数(EA I)=(2.303 × 2 × OD500)/(C × Φ ×L)乳状液稳定指数(ES)=OD500× Δt/ΔOD500式中：EAl ——每克蛋白质的乳化面积，m2/g；Φ——油相所占的分数，在本实验中油相占1/4；C——蛋白质的浓度，1%；L——比色池光径，10mm。

蛋白质在盐溶液中的溶解度曲线
蛋白质是生物体内非常重要的有机分子，它们在细胞代谢、信号传递、免疫系统等多个生物学过程中发挥着至关重要的作用。

然而，蛋白质在盐溶液中的溶解度问题一直是制约其应用的重要因素之一。

蛋白质在盐溶液中的溶解度通常会受到多种因素的影响，其中最主要的因素之一就是盐的种类和浓度。

一些盐比如硫酸铵和硫酸钠，可以增加蛋白质的溶解度，而另一些盐比如氯化钠则会降低蛋白质的溶解度。

为了研究蛋白质在盐溶液中的溶解度变化规律，科学家们通常会制作蛋白质在不同盐浓度下的溶解度曲线。

这些曲线能够反映蛋白质在不同盐浓度下的相对溶解度，从而帮助科学家更好地理解蛋白质的化学性质和生物学特性。

通过对不同种类、不同浓度的盐对蛋白质溶解度的影响进行研究和分析，科学家们可以为蛋白质的应用和开发提供更加可靠和有效的技术支持，从而推动生物技术和医学领域的发展。

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一、实验目的1. 了解蛋白质盐析的原理和过程。

2. 掌握蛋白质盐析实验的操作步骤。

3. 通过实验观察蛋白质盐析现象，验证盐析对蛋白质溶解度的影响。

二、实验原理蛋白质盐析是指在高浓度的中性盐溶液中，由于盐离子与蛋白质争夺水分子，破坏了蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低，从而从溶液中沉淀出来的现象。

实验中常用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠等。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、硫酸铵、蒸馏水、试管、试管架、磁力搅拌器等。

2. 试剂：硫酸铵饱和溶液、蒸馏水。

四、实验步骤1. 取一个干净的试管，加入2ml鸡蛋清溶液。

2. 向试管中加入2ml蒸馏水，充分混合。

3. 向试管中加入1ml硫酸铵饱和溶液，用磁力搅拌器搅拌，观察蛋白质沉淀现象。

4. 继续加入硫酸铵饱和溶液，观察蛋白质沉淀量的变化。

5. 记录实验现象，包括沉淀的形态、颜色、溶解度等。

五、实验结果与分析1. 实验现象：随着硫酸铵饱和溶液的加入，蛋白质逐渐沉淀，形成白色絮状沉淀。

继续加入硫酸铵饱和溶液，沉淀量逐渐增多，但沉淀的形态和颜色没有明显变化。

2. 分析：蛋白质盐析现象的发生是由于硫酸铵饱和溶液中的盐离子与蛋白质争夺水分子，破坏了蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低。

实验结果验证了盐析对蛋白质溶解度的影响。

六、实验结论1. 盐析是蛋白质分离纯化的一种常用方法，通过调节盐浓度，可以使蛋白质从溶液中沉淀出来。

2. 盐析过程中，盐离子与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低。

3. 实验结果验证了盐析对蛋白质溶解度的影响，为蛋白质分离纯化提供了理论依据。

七、实验注意事项1. 实验过程中应严格控制硫酸铵饱和溶液的加入量，以免影响实验结果。

2. 实验操作要规范，避免污染。

3. 实验过程中要注意观察现象，及时记录实验数据。

八、实验拓展1. 探究不同盐离子对蛋白质盐析的影响。

2. 研究蛋白质盐析过程中，盐浓度与蛋白质沉淀量的关系。

3. 利用蛋白质盐析技术进行蛋白质分离纯化实验。

蛋白质功能性质的检测蛋白质的功能性质的一般是指能使蛋白质成为人们所需要的食品特征而具有的物理化学性质，即对食品的加工、贮藏、销售过程中发生作用的那些性质，这些性质对食品的质量和风味起着重要的作用。

蛋白质的功能性质与蛋白质在食品体系中的用途有着十分密切的关系，是开发和有效利用蛋白质资源的重要依据。

蛋白质的功能性质可以分为水化性质、表面性质、蛋白质-蛋白质相互作用的有关性质三个主要类型，主要包括有吸水性、溶解性、保水性、分散ing、粘度合粘着性、乳化性、起泡性、凝胶作用的等等。

一、实验目的通过本实验定性地了解蛋白质的主要功能性质。

二、实验材料、试剂和仪器2.1. 实验材料2.1.1 2%蛋清蛋白溶液：取2g蛋清加98ml蒸馏水稀释，过滤取清夜。

2.1.2 卵黄蛋白：鸡蛋除蛋清后剩下的蛋黄捣碎。

2.2 试剂2.2.1 硫酸铵、饱和硫酸铵溶液2.2.2 氯化钠、饱和氯化钠溶液2.2.3 花生油2.2.4 酒石酸2.3 仪器若干试管、100ml烧杯、冰箱、均质机三、操作步骤3.1蛋白质水溶性的测定在10ml试管中加入0.5ml蛋清蛋白，加入5ml水，摇匀，观察其水溶性，有无沉淀产生。

在溶液中逐滴加入饱和氯化钠溶液，摇匀，得到澄清的蛋白质的氯化钠溶液。

取上述蛋白质的氯化钠溶液3ml，加入3ml饱和硫酸铵溶液，观察球蛋白的沉淀析出，再加入粉末硫酸铵至饱和，摇匀，观察清蛋白从溶液中析出，解释蛋清蛋白质在水中及氯化钠溶液中的溶解度以及蛋白质沉淀的原因。

3.2蛋白质乳化性的测定取10g卵黄蛋白于均质机料液瓶中，加入90g 水，加入5ml花生油，均质1min后，取约10ml于试管中；另取100g水于均质机料液瓶中，加入5ml花生油，进行均质1min后，取约10ml于试管中，两试管中液面相平即可，然后将两支试管放在试管架上，每隔15min观察一次，共观察4次，观察油水是否分离。

3.3蛋白质起泡性的测定(1) 在二个100ml的烧杯中，各加入2%的蛋清蛋白溶液30ml，一份用玻璃棒不断搅打1~2min；另一份用吸管不断吹入空气泡1~2min，观察泡沫的生成、泡沫的多少及泡沫稳定时间的长短。

利用蛋白质的溶解度来分离的方法利用蛋白质的溶解度来分离的方法如下：
1、蛋白质的盐析法：中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。

2、等电点沉淀法：蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法：用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

测定蛋白质溶解度的方法
以下是 6 条关于测定蛋白质溶解度的方法：
1. 嘿，你知道吗，有一种超简单的方法，那就是盐析法呀！就好像从一堆沙子里把金子筛出来一样，把蛋白质从溶液里分离出来。

比如说，在豆浆里加点盐，就能看到一些蛋白质沉淀出来啦，这就是通过改变溶液的离子强度来测定蛋白质溶解度呢！神奇吧？
2. 哇哦，还有一种叫透析法的呢！可以把蛋白质溶液装到一个特殊的袋子里，就像把小宝贝保护起来一样。

然后放在合适的溶液中，那些杂质啊就会跑出去啦，这样不就能知道蛋白质在这个环境下的溶解度了嘛！比如做豆腐的时候，用纱布过滤不就是类似的道理嘛。

3. 嘿呀，凝胶过滤法也很不错呀！这不就像走迷宫嘛，小分子可以轻松通过，大分子蛋白质就会被留下来。

我们可以观察蛋白质在这个过程中的情况来确定它的溶解度呢。

就像拼图一样，把各个部分都搞清楚了，哈哈。

4. 不得了啦，还有超速离心法哟！让溶液在高速旋转下，蛋白质就会乖乖地分层啦！这就好像给它们来了一场刺激的比赛，谁在什么位置一清二楚，就能知道蛋白质的溶解度情况咯。

像提纯牛奶里的蛋白质不就可以用这个方法吗？
5. 嘿嘿，等电聚焦法也很厉害呀！找到蛋白质的等电点，就像给它找到一个专属的位置一样。

在这个点上，蛋白质溶解度会有特别的表现呢。

你想想，是不是很有趣呀？这不就像给它贴个标签一样准确。

6. 哇塞，荧光法也能用上呢！就好像给蛋白质装了个小灯，通过观察这个小灯的变化，就能了解溶解度啦。

比如在一些实验里，用特殊的荧光标记蛋白质，然后去观察，是不是超级酷呀！
我觉得这些方法都各有各的奇妙之处，运用不同的方法可以更准确全面地测定蛋白质溶解度呢！。

蛋白质的沉淀反应实验报告结果通过掌握蛋白质的沉淀反应，了解蛋白质的性质和结构，并掌握蛋白质的分离和纯化技术。

实验原理：蛋白质是生物体内最重要的基本物质之一，是构成细胞和组织的重要组成部分。

蛋白质的沉淀反应是利用酸、碱、盐等物质对蛋白质的特殊性质进行分离和纯化的一种方法。

蛋白质在不同的pH值下具有不同的电离状态，当pH值达到其等电点时，蛋白质处于等电点电荷中性状态，此时蛋白质的溶解度最小，易于沉淀。

沉淀反应的原理是利用酸、碱、盐等物质使蛋白质达到等电点电荷中性状态，从而使蛋白质沉淀出来。

实验过程：1.制备酸性和碱性蛋白质溶液：取鸡蛋清和牛奶各10ml，分别加入10%的盐酸和氢氧化钠，调节pH值至2和10。

2.沉淀反应：取酸性和碱性蛋白质溶液各1ml，加入等量的10%三氯醋酸，轻轻摇匀，放置1小时，观察沉淀情况。

3.沉淀物的洗涤：将沉淀物用去离子水洗涤3次，使其去除杂质。

4.沉淀物的溶解：将沉淀物加入0.1mol/L NaOH中，搅拌至溶解，调节pH值至7左右。

5.测定蛋白质浓度：采用比色法测定蛋白质浓度。

实验结果：1.酸性蛋白质溶液的沉淀反应：在酸性条件下，鸡蛋清溶液中的蛋白质与三氯醋酸反应，产生大量白色沉淀物，沉淀率高达90%以上。

2.碱性蛋白质溶液的沉淀反应：在碱性条件下，牛奶溶液中的蛋白质与三氯醋酸反应，产生少量白色沉淀物，沉淀率仅为10%左右。

3.沉淀物的洗涤：经过去离子水洗涤后，沉淀物变得干净透明，无杂质。

4.沉淀物的溶解：经过加入0.1mol/L NaOH的溶解，沉淀物完全溶解，呈现出淡黄色透明液体。

5.测定蛋白质浓度：利用比色法测定蛋白质浓度，鸡蛋清溶液中的蛋白质浓度约为0.6g/L，牛奶溶液中的蛋白质浓度约为0.1g/L。

实验结论：1.酸性条件下，鸡蛋清中的蛋白质易于沉淀，沉淀率高达90%以上；而在碱性条件下，牛奶中的蛋白质沉淀率仅为10%左右。

2.经过去离子水洗涤后，沉淀物变得干净透明，无杂质。

安阳天合成饲料有限公司化验室
蛋白质溶解度的测定
蛋白质溶解度的测定
一、试剂
1 .氢氧化钾溶液：0.2% 相当于0.042mol/L,PH12.5：称取
2.360gKOH 于容量瓶中，加水溶解并稀释至1000ml 。

注意补充KOH 试剂的纯度。

（KOH 纯度为82%时应称取量为2.878g ）
2. 其它试剂为凯氏定氮所需的标准试剂。

二、测定步骤：
1 .称取1.5g （精确至0.0001g ）过60目筛的样品，置于250ml 烧
杯中，加入75ml0.2%的KOH 溶液，在磁力搅拌器上搅拌20分钟；
2. 之后，移入50ml 溶液于离心管中，以2700转/分的速度离心
10分钟；
3 .取15ml 上清液进行凯氏定氮 ，方法同粗蛋白质的测定；
4 .同时测定原样中粗蛋白质的含量。

五、测定结果的计算与分析：
1. 计 算： 0.3g 样品中粗蛋白质的含量
PS= *100
原样中粗蛋白质的含量
2、分析：
PS>85%, 过生； PS<70% ,过熟。

1 蛋白质与水的相互作用：蛋白质的水溶性
蛋白质与水之间的作用力主要是蛋白质中的肽键（偶极-偶极相互作用或氢键），或氨基酸的侧链（解离的、极性甚至非极性基团）同水分子之间发生了相互作用。

影响蛋白质水溶性的应素很多：
（1）pH>pI 时，蛋白质带负电荷，pH=pI 时，蛋白质不带电荷，pH<pI 时，蛋白质带正电荷。

溶液的pH 低于或高于蛋白质的pI 都有利于蛋白质水溶性的增加，一方面是加强了蛋白质与水分子的相互作用，另一方面蛋白质链之间的相互排斥作用。

等电沉淀。

（2）离子强度：μ=0.5∑CiZi2，Ci 表示离子强度，Zi 表示离子价数。

盐溶：当溶液中的中性盐浓度在0.5mol/L 时，可增加蛋白质的溶解性，盐作用减弱蛋白质分子之间的相互作用。

对于nacl，质量浓度为3g/100ml
KOH为2.8g/100ml
盐析：当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L 时，蛋白质会沉淀析出，这是盐与蛋白质竞争水分的结果。

不同盐类对蛋白质的盐析作用强弱不同。

将这种强弱顺序称为感胶离子序：
（3）非水溶剂：有些有机溶剂可引起蛋白质变性沉淀，主要是有机溶剂降低了水的介电常数，蛋白质之间的静电斥力降低。

（4）温度：温度低于40-50℃时，随温度的增大水溶性增大，当温度大于50℃，随温度的增大，水溶性降低。

根据蛋白质的溶解性对蛋白质分类：
（1）清蛋白：可溶于pH6.6 的水中，血清清蛋白，卵清蛋白，α-乳清蛋白；
（2）球蛋白：能溶于pH7 的稀碱溶液，β-乳球蛋白；
（3）醇溶蛋白：能溶于70%的乙醇，玉米醇溶蛋白；（4）谷蛋白：在上述溶剂中都不溶解，但可溶于酸（pH2）或碱（pH12）。

B 46DB13DB13/T 812—2006前 言本标准由河北省畜牧兽医局提出。

本标准起草单位：河北农业大学、河北省饲料工业办公室、河北省饲料产品质量监督检验站。

本标准主要起草人：赵国先、王铃、师校军、米振杰、武英利、黄仁录、李艳琴。

大豆及其制品蛋白质溶解度的测定1 范围本标准规定了大豆及其制品中蛋白质溶解度测定的原理、试剂、仪器设备和测定方法。

本标准适用于饲料检测单位、饲料企业、养殖场（户）、大中专院校对大豆及其制品加工质量的检测和监控。

2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 601—2002化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T 6432—1994饲料粗蛋白测定方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

蛋白质溶解度在一定的氢氧化钾溶液中溶解的蛋白质质量占试样中总蛋白质量的百分数。

通常采用氮溶解指数（NSI）和蛋白质分散指数（PDI）来表示。

4 原理用一定浓度的氢氧化钾溶液提取试样中的可溶性蛋白质，在催化剂作用下用浓硫酸将提取液中可溶性蛋白质的氮转化为硫酸铵。

加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用盐酸滴定测出试样中可溶性蛋白质含量；同时，测定原始试样中粗蛋白质含量，计算出试样的蛋白溶解度。

5 试剂a） 氢氧化钾（分析纯），无水硫酸钾、五水硫酸铜、氢氧化钠、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、硫酸铵；b）浓硫酸、盐酸（分析纯）、95%乙醇、蒸馏水。

6 仪器和设备a) 感量为0.0001 g分析天平；b) 磁力搅拌器；c) 离心机；d) 样品粉碎机；e) 60目分析筛；f) 电炉；g) 100 ml或250 ml凯氏烧瓶；h) 凯氏蒸馏装置；i) 250 ml锥形瓶；j) 1 000 ml容量瓶；k) 微量滴定管。

实验七 饲料蛋白质溶解度测定【学习目标】掌握饲料饲料蛋白质溶解度测定方法，并能测定饲料蛋白质溶解度。

一、原理本方法适用于大豆饼、粕的加热处理程度的品质检验。

抗胰蛋白酶活性方法可用来测定加热过度的大豆饼、粕，但因其费时，昂贵而未被广泛使用。

故现在多采用尿素酶活性这一化学指标，但尿素酶活性只能作为加热至适合程度的评价指标，而对加热过渡的饼、粕却没有任何意义。

尿素酶值不能反映受严重热处理的大豆饼、粕的质量。

Rinehart 发现了采用0.2%KOH 溶液测定蛋白质溶解度的方法来评价大豆饼粕的质量，可克服上述尿素酶活性评价工作上的不足。

北美一些饲料公司已将蛋白质溶解度(PS)列入质量控制指标之一。

生豆饼、粕的PS 可达到100%，但随热处理时间的延长，PS 值降低，即使严重的过热处理，PS 值也未接近零。

试验表明，蛋白溶解度更加密切的反映了过熟处理的大豆饼、粕与畜禽生产性能的关系。

并进一步提出当PS>85%时，为过生；PS<70%时，则为过熟。

尿素酶活性检测和蛋白质溶解度已成为评定豆饼、豆粕加工质量的两个重要指标。

二、操作方法（一）试剂配制1.0.2% 氢氧化钾（KOH ），相当于0.042 mol/L ，pH 12.5，称取氢氧化钾约0.2g 加水溶解，并稀释至100.0ml 。

2.其它试剂同凯氏定氮所需的试剂一致。

（1）浓硫酸 分析纯,含量为98.0%，无氮；（2）混合催化剂 CuSO 4:无水Na 2SO 4=1:10，分析纯；（3）甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 0.1%甲基红酒精溶液与0.5%溴甲酚绿酒精溶液等体积混合，保存期不超过三个月。

此混合指示剂在碱性溶液中呈蓝色，中性溶液中呈灰色，强酸性溶液中呈红色。

在硼酸吸收液中呈暗紫色，在吸收氨的硼酸溶液中呈蓝色。

（4）2.0%硼酸吸收液 溶解2.0g 分析纯硼酸于100.0ml 容量瓶中，加蒸馏水至100.0ml ，摇匀备用。

（5）40.0%饱和NaOH 溶液 溶解40.0g 分析纯氢氧化钠于100.0ml 容量瓶中，加蒸馏水至100.0ml ，摇匀备用。

蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤一、注意事项：1. 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH 值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。

2. 盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。

3. 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。

4. 盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。

3.5为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。

5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50 处理。

6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。

二、实验步骤：蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大(20度时饱和溶液为754克/升;0度时饱和溶解度为706克/升)，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。

硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

表1 几种盐在不同温度下的溶解度(克/100毫升水)0℃20℃80℃100 ℃(NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101饱和硫酸铵法：1. 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml 饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

2. 4℃，3h以上，使其充分沉淀离心(3000rpm),20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

3. 置4℃3h以上，[此时，(NH4)2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。