薄层色谱

实验四（）薄层⾊谱实验四（1）薄层⾊谱⼀、实验⽬的1、学习学习薄层⾊谱法的原理，了解其意义和应⽤。

2、掌握薄层板的制作及薄层⾊谱的操作⽅法。

⼆、实验原理薄层⾊谱法是以薄层板作为载体，让样品溶液在薄层板上展开⽽达到分离的⽬的，故也称为薄层层析。

它是快速分离和定性分析少量物质的⼀种⼴泛使⽤的实验技术，可⽤于精制样品、化合物鉴定、跟踪反应进程和柱⾊谱的先导（即为柱⾊谱摸索最佳条件）等⽅⾯。

1、薄层⾊谱常⽤的吸附剂硅胶和氧化铝是薄层层析常⽤的固相吸附剂。

化合物极性越⼤，它在硅胶和氧化铝上的吸附⼒越强，所以吸附剂均制成活性精细粉末。

活化通常是加热粉末以脱去⽔分。

硅胶是酸性的，⽤来分离酸性或中性的化合物。

氧化铝有酸性、中性和碱性的，可⽤于分离极性或⾮极性的化合物。

商⽤的硅胶和氧化铝薄层板可以买到，这些薄板常⽤玻璃或塑料制成。

溶剂在薄层板上爬升的距离越长，化合物的分离效果越好。

宽的薄层板也可⽤于量较⼤的样品，具有1~2mm厚的⼤板可⽤于50~1000 mg样品的分离制备。

2、样品的制备与点样样品必须溶解在挥发性的有机溶剂中，浓度最好是1~2%。

溶剂应具有⾼的挥发性以便于⽴即蒸发。

丙酮、⼆氯甲烷和氯仿等是常⽤的有机溶剂。

分析固体样品时，可将20~40mg样品溶到2mL 的溶剂中。

在距薄层板底端约1cm处，⽤铅笔划⼀条线，作为起点线。

⽤⽑细管（内径⼩于1mm）吸取样品溶液，垂直地轻轻接触到薄层板的起点线上。

样品量不能太多，否则易造成斑点过⼤，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离效果。

3、展开将选择好的展开剂放在层析缸中，使层析缸内空⽓饱和，再将点好样品的薄层板放⼊层析缸中进⾏展开。

使⽤⾜够的展开剂以使薄层板底部浸⼊溶剂3~5mm，但溶剂不能太多，否则样点在液⾯以下，溶解到溶剂中，不能进⾏层析。

当展开剂上升到薄层板的前沿（离顶端5~10mm处）或各组分已明显分开时，取出薄层板放平晾⼲，⽤铅笔划出前沿的位置后即可显⾊。

薄层色谱和柱层析一、薄层色谱（TLC）1.原理：薄层色谱是一种基于分子在固体表面和流动相之间相互作用的分离技术。

它使用薄层固定在玻璃或铝板上的吸附剂（例如硅胶或氧化铝）来分离混合物中的化合物。

在色谱板上涂覆样品后，通过液态或气态的流动相让混合物成分在吸附剂上移动，不同化合物的移动速度不同，从而实现分离。

2.应用：薄层色谱被广泛应用于药物化学、食品科学、环境科学和生命科学等领域。

它通常用于混合物的分析，确定混合物中是否存在特定化合物。

此外，它也可用于纯化样品中的化合物，通过可视化或其他检测方法来定位目标化合物位置。

3.操作步骤：薄层色谱的操作步骤主要包括：（1）准备色谱板：将吸附剂均匀涂覆在固定的玻璃或铝板上，使其成为薄层。

（2）样品的涂覆：将待分离的混合物溶解在适当的溶剂中，并用微量移液管将样品均匀地涂覆在色谱板上。

（3）开展分离：将涂覆了样品的色谱板悬挂在色谱槽中，加入合适的溶剂溶液，使之满足色谱板的一端。

（4）显色：在色谱板完全干燥后，通过目视或化学法将化合物可视化。

常用的显色剂包括碘、紫外线灯或化学染色剂。

二、柱层析（CC）1.原理：柱层析是一种基于分子在固定填料（固相）和流动相之间相互作用的分离技术。

根据样品的特性选择不同的固相材料，并将其装填在柱中。

当样品通过柱时，不同化合物与固相发生不同程度的相互作用，从而分离。

2.应用：柱层析广泛应用于化学和生物化学领域，用于分离和纯化化合物。

它可用于药物合成中的纯度检查、食品中毒素的分离、蛋白质的纯化等。

柱层析的分离效果通常较好，纯度高。

3.操作步骤：柱层析的操作步骤主要包括：（1）准备填料和柱子：根据需要选择适当的固相材料，并将其装填在柱子中。

（2）样品的预处理：将待分离的样品预处理，如溶解在适当的溶剂中，并清除杂质。

（3）样品注入：将样品注入柱中，注意控制样品体积和注入速度。

（4）洗脱：通过加入不同组成的洗脱液（流动相），使样品中不同化合物以不同速率从柱中洗脱。

薄层色谱薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。

是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。

它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。

因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。

此外，在进行化学反应时，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。

一、基本原理色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。

薄层色谱是一种微量、快速和简便的色谱方法。

由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）。

化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。

在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物，薄层色谱可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达500mg样品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。

特别适用于那些挥发性小的化合物，以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。

二、实验基本流程铺板点样展开显色计算Rf值铺板取7.5x2.5cm左右的载玻片5片，洗净晾干。

在50mL烧杯中，放置3g硅胶G，逐渐加入0.5﹪羧甲基纤维素钠水溶液(CMC)8mL，调成均匀的糊状，涂于上述洁净的载玻片上，用手将带浆的玻片在水平的桌面上做上下轻微的颠动，制成薄厚均匀、表面光洁平整的薄层板，涂好的硅胶G的薄层板置于水平的玻璃板上，在室温放置0.5h后，放入烘箱中，缓慢升温至110℃，恒温0.5h 后取出，稍冷后置于干燥器中备用。

第二部分色谱分析第一章薄层色谱法（TLC）一薄层色谱法概述薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。

与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。

被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。

被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。

薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。

二薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开（一）薄层板TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。

可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。

此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其色谱行为产生影响。

（1）载体对TLC载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。

（2）固定相TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。

硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。

（3）粘合剂在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。

常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。

（4）荧光指示剂荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。

加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。

（二）薄层板的涂铺涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。

TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。

薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。

薄层色谱薄层色谱，或称薄层层析（Thin-Layer Chromatography），是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术，是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。

薄层色谱法是一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。

一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品，因此又可用来精制样品。

因此，薄层色谱法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。

此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。

在我国新推出的2010版药典中，降低了薄层色谱分析所占的比例，这似乎表明着薄层色谱分析方法将会逐渐被替代，但是在实际的工作中，薄层色谱法以其快速、简便的优势一直活跃在分析检测的一线，加上电动点样机和薄层扫描仪的出现，加快了点样和检测的速度和质量，使得这一技术在生产分析中起到了重要作用。

一、薄层色谱的分类1、常规薄层色谱TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。

常规薄层色谱的固定相为未改性的硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素和聚酰胺等，平均颗粒度20μm，点样量1~5μL，展开时间30~200min，检测限1~5ng。

以正相色谱占主导地位，设备简单，所需资金投入少；不足之处是分离所需时间长，有明显的扩散效应。

2 高效薄层色谱高效薄层色谱（HPTLC）采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性。

C2、C8和C18化学键合硅胶板为常见反相薄层板。

高效板厚平均100~250μm、点样量0. 1~0. 2μL，展距3~6cm，展开时间3~20min，最小检测量0. 1~0. 5μg，较常规TLC可改善分离度，提高灵敏度和34重现性，适用于定量测定。