流式细胞凋亡分析PPT课件

7
细胞凋亡的特征
形态学特征：
电镜下，细胞核内可见高电子密度区， 这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体 后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩 块。染色质聚集区以外的低电子密度区为 透明区，是由于核孔变大导致其通透性增 加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒 体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋 亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架 变得致密、紊乱。
流式细胞凋亡分析
1
概念
细胞凋亡（apoptosis）是指有核细胞 在一定条件下通过启动其内部自身机制， 主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发 生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控 制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体 中一种普遍存在的现象。
2
概念
细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功 能活动所必需的，是多细胞生物生命活动 过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存 活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。
目前已发现15个caspase家族成员，分 别命名为caspase-1～15，并根据其功能 特点分成两类，即启动caspase(caspase2、8、9、10）和效应caspase(caspase3、 6、7）。
16
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
启动caspase作用于凋亡信号触发后上 游的不可逆位点。效应caspase由启动胱冬 肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解 细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这 两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行 凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行位 点的进程。
8
细胞凋亡的特征
形态学特征：
9
细胞凋亡的特征
形态学特征：
10
细胞凋亡的特征
形态学特征： 共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和
线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞 膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝 氨酸（phosphatidylserine,ps)和凝血酶 敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞 的清除有关。
并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的
19
生化特征。
细胞凋亡的特征
生化特征： 2 核酸内切酶的激活：
20
细胞凋亡的特征
生化特征： 3 线粒体的变化：
线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱 导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型通 道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线 粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜 电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。
caspase可能在凋亡细胞的形态变化中 起了主导作用。Caspase通常是以酶原形 式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转 化为有活性的酶，活化的caspase进一步激 活其他的caspase前体，形成了级联放大切 割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋 亡。
15
细胞凋亡的特征
生化特征： 1 caspase蛋白酶：
5
细胞凋亡的特征
形态学特征： 光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征
是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱 缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为 突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞 核双链DNA发生裂解所致。
6
细胞凋亡的特征
形态学特征：
DNA降解后，形成长度主要为180200bp的DNA片断，随后细胞裂解成许多 有膜包被的小体，称为凋亡小体 （apoptotic bodies),最后被巨噬细胞吞 噬，但不会引起周围组织的炎症反应。凋 亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显 微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞 发生了凋亡。
制细胞凋亡。
22
细胞凋亡的特征
生化特征： 4 胞质Ca2+和pH的变化：
细胞内Ca2+和H+浓度的稳定对维持生命 活动至关重要。胞内Ca2+库的释放，胞质 Ca2+与细胞凋亡关系密切。胞外Ca2+内流 促使胞质Ca2+持续升高，作为凋亡信号启 动凋亡发生。
23
细胞凋亡的特征
17
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为 17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活 化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其 他caspase、相关的胞质靶位点（细胞因子 18，CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3 切割CK18是凋亡过程中caspase切割发生 的早期指示因子。
3
概念
细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）是细 胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。 后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量 细胞毒药物作用后发生的被动分解过程， 并可导致周围组织的炎症反应。
4
概念
细胞凋亡的作用主要包括以下几方面： 清除无功能的细胞； 控制细胞数量； 清除病态的或有害的细胞； 清除多余的细胞；
21
细胞凋亡的特征
生化特征：
3 线粒体的变化：
线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的
早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质
子和其他离子分布不对称造成的。线粒体
参与cl-2家族分布在细胞内膜系统，其中
线粒体外膜上分布最多，bcl-2具有抑制线
粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑
13
细胞凋亡的特征
生化特征： 1 caspase蛋白酶：
其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要 作用。它具有一段携带活化位点的保守氨 基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨 酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有 相同的结构和功能特性而被称为caspase。
14
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
18
细胞凋亡的特征
生化特征：
2 核酸内切酶的激活：
细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，
将核小体间连接DNA降解，形成长度主要
为180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组
蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也
不改变。在DNA凝胶电泳分析中呈现出特
征性“梯状”条带，而细胞坏死时，DNA
片断大小不一，无“梯状”条带出现。但
11
细胞凋亡的特征
形态学特征： 凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提
取，DNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图 谱，可见清晰的DNA〝梯子〞(ladder)。
12
细胞凋亡的特征
生化特征： 1 caspase蛋白酶：
细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水 解酶级联切割的过程，它将大分子结构的 物质如DNA、细胞骨架水解变性成小分子 碎片，致使细胞发生凋亡。