人脑啡肽酶 ELISA试剂盒
- 格式:pdf
- 大小:513.26 KB
- 文档页数:12
Catalog Number EK1M02-48EK1M02-96定量检测血清、血浆和细胞培养上清中的人基质金属蛋白酶2(MMP-2)浓度。
本产品仅用于科学研究,非诊断试剂,不能用于临床诊断。
1.背景介绍基质金属蛋白酶2(MMP-2),又名72kDa 的IV 型胶原酶和明胶酶A ,在人类中由MMP2基因编码。
激活MMP-2需要蛋白水解加工。
MMP-2在子宫内膜破裂、调节血管形成和炎症应答中起作用。
MMP-2参与许多事件,如癌症进程、癌细胞浸润、细胞信号转导、新血管形成和淋巴管生成。
MMP2基因突变与Torg-Winchester 综合征、多发性骨溶解、关节炎综合征有关,可能与瘢痕疙瘩有关。
非囊性纤维化支气管扩张中,相比于呼吸道感染铜绿假单胞菌的患者,感染流感嗜血杆菌患者的MMP-2浓度是升高的。
2.检测原理本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。
特异性抗人MMP-2抗体预包被在高亲和力的酶标板上。
酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体,经过孵育,样本中存在的MMP-2与固相抗体和检测抗体结合。
洗涤去除未结合的物质后,加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。
洗涤后,加入显色底物TMB ,避光显色。
颜色反应的深浅与样本中MMP-2的浓度成正比。
加入终止液终止反应,在450nm 波长(参考波长570-630nm)测定吸光度值。
3.试剂盒检测的局限1)请在本试剂盒标示的有效期内使用。
2)试剂盒的试剂不能与其他批号的试剂或其他来源的试剂混合使用。
3)任何标准品稀释、操作人员、移液技术、洗涤技术、孵育温度、试剂盒保存时间的改变,都将影响结合反应。
4)本试剂盒在设计上去除或降低了生物学样本中的一些内源性干扰因素,并非所有可能的影响因素都已经去除。
Human MMP-2ELISA Kit 检测试剂盒(酶联免疫吸附法)EK1M02-01二、基本信息1.2.未提供的材料设备1)能够检测450nm吸光度的酶标仪,参考波长570nm或630nm2)移液器及枪头、加样槽3)准备试剂用的试管、离心管、量筒等4)蒸馏水或去离子水5)涡旋振荡器、微孔板振荡器3.贮存试剂盒保存于2-8℃,有效期标注于标签上。
人腺苷脱氨酶(ADA)elisa试剂盒使用说明书Elisa kit规格:48孔配置/96孔配置标准品稀释液:1.5ml×1瓶酶标试剂:3 ml×1瓶(48)/6 ml×1瓶(96)【人腺苷脱氨酶(ADA)elisa试剂盒】本试剂仅供研究使用计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
试剂盒组成:封板膜:2片(48)/2片(96)说明书:1份密封袋:1个标准品:2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液:(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人腺苷脱氨酶(ADA)水平。
用纯化的人腺苷脱氨酶(ADA)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入腺苷脱氨酶(ADA),再与HRP标记的腺苷脱氨酶(ADA)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的腺苷脱氨酶(ADA)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人腺苷脱氨酶(ADA)浓度。
人β2-内啡肽(β2-EP)试剂盒操作方法检测范围:96T80 ng/L -2000 ng/L使用目的:本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中β2-内啡肽(β2-EP)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人β2-内啡肽(β2-EP)水平。
用纯化的人β2-内啡肽(β2-EP)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入β2-内啡肽(β2-EP),再与HRP标记的β2-内啡肽(β2-EP)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的β2-内啡肽(β2-EP)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人β2-内啡肽(β2-EP)浓度。
1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品(4000ng/L)×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个标本要求1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融2.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤1.标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2000 ng/L 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液1000 ng/L 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液500 ng/L 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液250 ng/L 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液125 ng/L 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。
人转化生长因子β2(TGFβ2)ELISA试剂盒试验步骤中文别名:人转化生长因子Β2(TGFΒ2)ELISA试剂盒英文名称:Human transforming growth factors β2, TGFβ2 Elisa Kit特异性:可检测样本中的人转化生长因子β2,且与其仿佛物无明显交叉反应。
种属:人保管温度:28℃样本类型:血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清和其他生物液体背景:转化生长因子β2(TGFβ2)前体蛋白由19个氨基酸的信号肽、283个氨基酸的前区和112个氨基酸的成熟区构成。
人TGFβ2成熟区与人TGFβ1和TGFβ3的同源性分别为71%和80%,与小鼠TGFβ2的同源性为97%。
它可由各类细胞表达,包含破骨细胞、胸腺上皮细胞、角蛋白细胞、肝细胞、胃的主细胞和卫星细胞等。
TGFβ2具有显著的种属交叉生物活性,如人TGFβ2对小鼠细胞具有活性,而猪TGFβ2对兔细胞具有活性等。
TGFβ2具有4种基本活性:是大部分类型细胞的生长抑制因子;可加强细胞外基质的沉积;具有免疫抑制作用,抑制抗原递呈细胞表达IL12和CD40L,上调IL10分泌;在胚胎发育期表达于离散区域,如上皮、心肌、手足的软骨和骨骼、神经系统,提示其具有特异性的功能。
工作原理:本试剂盒采用的是双抗体夹心法酶联免疫吸附检测技术(ELISA)。
测定样品中人转化生长因子β2水平。
向预先包被了抗人转化生长因子β2抗体的酶标孔中,加入标准品和样本,温育后,加入生wu素标记的抗转化生长因子β2抗体。
再与HRP标记的链霉亲和素结合,形成免疫复合物,再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入显色底物TMB,产生蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
最终,在450 nm处测定反应孔样品吸光度(OD)值,样本中的人转化生长因子β2浓度与OD值成正比,通过绘制标准曲线计算出样本中人转化生长因子β2的浓度。
产品描述试剂名称数量试剂名称数量96孔板(预包被) 1 96孔板覆膜 2标准品 2 稀释液1×45mL检测溶液A 1×120μL 检测溶液B 1×120μLTMB底物1×9mL 停止液1×6mL浓洗涤液(30×)1×20mL 使用说明书 1需自备的设备及试剂45010nm滤光片的酶标仪(建议仪器使用前提前预热)单道或多道微量加液器及吸头稀释样品的EP管蒸馏水或去离子水吸水纸盛放洗液的容器试剂盒的储存及有效期未开封的试剂盒:全部试剂均按试剂瓶标签上所示保管。
7项肿瘤标志物检测试剂盒A【产品名称】通用名称:7项肿瘤标志物检测试剂盒(微阵列化学发光免疫分析法)英文名称:Seven Tumor Markers Test Kit ( Microarray Chemiluminescent Immunoassay)【包装规格】100人份/盒【预期用途】本产品用于体外定量检测人血清样本中的糖链抗原19-9(CA19-9)、糖链抗原125(CA125)、糖链抗原724(CA724)、神经元烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、胃泌素释放肽前体(Pro-GRP)7种肿瘤标志物的浓度。
【检验原理】本产品由蛋白芯片、酶标二抗反应液、检测液及其他试剂配套组成。
应用双抗体夹心法原理定量检测人血清中的7种肿瘤标志物的浓度。
第一步反应:待测血清与芯片反应,芯片表面的7种肿瘤标志物的单克隆抗体与样品中潜在的相应抗原结合,反应结束芯片经洗涤后进行第二步反应。
第二步反应:将芯片转入预加了酶标二抗反应液的反应杯中,进一步反应形成抗体-抗原-抗体的双抗夹心结构,反应结束芯片经洗涤后检测反应信号。
信号检测:将芯片转移入预加了发光底物的反应杯中,利用致冷CCD对芯片反应区进行成像,读取点阵灰度值。
报告结果:以不同浓度的校准品作为样本进行检测,作出灰度——浓度定量标准曲线,通过该标准曲线计算血清样本中不同指标的相应浓度,报告检测结果。
【适用仪器】江苏三联生物工程有限公司全自动生物芯片阅读仪SLXP-001、SLXP-002。
【储存条件及有效期】2~8 ℃保存,有效期6个月。
【医疗器械注册证编号】国械注准201534002307项肿瘤标志物检测试剂盒B【产品名称】通用名称:7项肿瘤标志物检测试剂盒(微阵列化学发光免疫分析法)英文名称:Seven Tumor Markers Test Kit ( Microarray Chemiluminescent Immunoassay)【包装规格】100人份/盒【预期用途】本产品用于体外定量检测人血清中的糖链抗原19-9(CA19-9)、糖链抗原125(CA125)、糖链抗原724(CA724)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、胃蛋白酶原I(PG I)以及胃蛋白酶原II(PG II)7种肿瘤标志物的浓度。
本试剂盒只能用于科学研究,不得用于医学诊断。
人P21蛋白(P21)定量检测试剂盒(ELISA)使用说明书【试剂盒名称】人P21蛋白(P21)定量检测试剂盒(ELISA)【试剂盒用途】定量检测人血清、血浆及相关液体样本中P21蛋白(P21)的含量。
【检测原理】本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。
将标准品、待测样本加入到预先包被人P21蛋白(P21)单克隆抗体透明酶标包被板中,温育足够时间后,洗涤除去未结合的成分,再加入酶标工作液,温育足够时间后,洗涤除去未结合的成分。
依次加入底物A、B,底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物,在酸的作用下变成黄色,颜色的深浅与样品中人P21蛋白(P21)浓度呈正相关,450nm波长下测定OD值,根据标准品和样品的OD值,计算样本中人P21蛋白(P21)含量。
【试剂盒组成】1酶标包被板12孔×8条7显色剂A液6mL2标准品0.3mL×6管8显色剂B液6mL320倍浓缩洗涤液25mL9终止液6mL4样本稀释液6mL10说明书1份5特殊稀释液6mL11封板膜2张6酶标试剂6mL12密封袋1个备注:标准品(1号→6号)浓度依次为:48、24、12、6、3、1.5ng/L【需要而未提供的试剂和器材】1、37℃恒温箱2、标准规格酶标仪3、精密移液器及一次性吸头4、蒸馏水5、一次性试管6、吸水纸【操作步骤】1、准备:从冰箱取出试剂盒,室温复温平衡30分钟。
2、配液:用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3、加标准品和待测样本:取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品50μL;待测样本孔中先加入待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍);空白对照孔不加。
4、温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
仅供科研使用,不得用于临床检验。
人促红细胞生成素(EPO )酶联免疫试剂盒(ELISA试剂盒)说明书黄石市艾恩斯生物科技有限公司【产品名称】通用名称:人促红细胞生成素(EPO )酶联免疫试剂盒(ELISA试剂盒)英文名称:Human Erythropoietin(EPO )ELISA KIT【包装规格】48人份/盒,96人份/盒【预期用途】仅供科研使用,定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中人促红细胞生成素(EPO )的浓度。
【检验原理】本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)。
在预包被抗人促红细胞生成素(EPO )抗体(固相抗体)的微孔酶标板中,加入人促红细胞生成素(EPO )校准品和待测样本,再加入另一株HRP标记的抗人促红细胞生成素(EPO )抗体(酶标抗体),经过温育与充分洗涤,去除未结合的组分,在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。
加底物A和B,底物在HRP催化下,产生蓝色产物,在终止液(2M 硫酸)作用下,最终转化为黄色,在酶标仪上测定吸光度(OD值),吸光度(OD值)与待测样品中人促红细胞生成素(EPO )的浓度正相关。
拟合校准品曲线,可以计算出样本中人促红细胞生成素(EPO )的浓度。
【主要组成成分】主要成分校准品检测范围:47-3000pg/ml。
校准品已经通过测试,结果表明HBs抗原阴性,HIV1、HIV2和HCV抗体阴性,由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质,本品必须按照具有潜在的感染性进行处理,处理过程应当遵循通用的安全措施。
需要但未提供的材料及耗材1、酶标仪2、精密移液器及一次性吸头3、蒸馏水4、洗瓶或者自动洗板机5、37℃水浴锅或恒温箱6、500ml量筒7、无粉一次性乳胶手套【储存条件及有效期】1、2-8℃保存,切勿冷冻,有效期6个月。
2、开封使用后,包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中,密闭自封袋,并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线:400-168-3301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询:*****************碧云天网站微信公众号网址:Human Angiogenin ELISA Kit产品编号产品名称包装PA023 Human Angiogenin ELISA Kit 96次产品简介:碧云天的Human Angiogenin ELISA Kit (Human Angiogenin Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit),即人血管生成素酶联免疫吸附检测试剂盒,是一种用于特异性地高灵敏地定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的Angiogenin的ELISA试剂盒。
本产品检测灵敏度高,特异性强,重复性好。
多次重复检测结果表明,最小检出量为4.75pg/ml,与EGF、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、TGF-α、TGF-β1,小鼠 EGF、GM-CSF、MIP-1α等均没有交叉反应,板内、板间变异系数均小于10%。
人血管生成素(Angiogenin, ANG)是一种分子量为14kDa的单链非糖基化蛋白,属于核糖核酸酶中RISBASE家族。
该家族成员不仅具有核糖核酸酶活性,还具有一些特殊的生物学功能。
ANG氨基酸长度为123,包括3个链内二硫键。
人ANG与小鼠ANG具有75%的氨基酸同源性,且具有一定的种间交叉反应。
能够表达ANG的细胞主要有血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、结肠柱状上皮细胞、淋巴细胞和部分肿瘤细胞。
ANG主要参与血管的形成过程。
基底膜的降解是血管新生过程中内皮细胞发生迁移的先决条件。
ANG首先与肌动蛋白结合,随后肌动蛋白-ANG复合物发生裂解,激活组织血纤维蛋白溶酶原。
这一过程产生的血纤维蛋白溶酶会降解基底膜中的层粘连蛋白和纤连蛋白。
硫酸皮肤素差向异构酶(DSE)ELISA试剂盒说明书本试剂仅供研究使用标本:体液硫酸皮肤素差向异构酶(DSE)ELISA试剂盒说明书试验原理:BFGF试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知BFGF浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将BFGF和生物素标记的抗体同时温育。
人碱性成纤维细胞生长因子ELISA 检测试剂盒洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中BFGF的浓度呈比例关系。
硫酸皮肤素差向异构酶(DSE)ELISA试剂盒说明书自备材料1.蒸馏水。
2.加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3.振荡器及磁力搅拌器等。
安全性1.避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。
2.实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3.不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
硫酸皮肤素差向异构酶(DSE)ELISA试剂盒说明书操作注意事项1.试剂应按标签储存,使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
2.实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
3.不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
4.使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。
5.使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6.洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7.底物A应挥发,避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。
避免用手接触,有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
8.加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9.按照中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
硫酸皮肤素差向异构酶(DSE)ELISA试剂盒说明书样品收集、处理及保存方法1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。
产品信息和操作指南Human IL-1β预包被 ELISA kit Cat# : DKW12-1012-048 / DKW12-1012-096本试剂盒专用于科研,而非用于诊断Human IL-1βDKW12-1012目录产品简介 (1)知识背景 (1)试剂盒提供的试剂 (2)需要实验者自行准备的试剂与仪器 (2)注意事项 (3)试剂的配制 (5)操作过程 (7)结果分析 (9)试剂盒的保存 (9)操作步骤一览表 (10)参考文献 (11)ELISA测定中可能会出现的问题及解决方法 (12)预包被ELISA 试剂盒系列产品 (15)1、产品简介:达优®人IL-1β ELISA试剂盒是通过酶联免疫吸附技术,体外定量检测人血清、血浆、缓冲液或细胞培养液中的IL-1β,可同时检测天然的和重组的IL-1β。
本试剂盒为预包被板,“夹心一步”完成,整个过程孵育时间不超过4小时,洗涤6次,操作时间大大减少。
本试剂盒专用于科研,而非用于诊断。
使用前请仔细阅读说明书并检查试剂盒组分,若有任何疑问请与达科为生物工程有限公司联系,E-mail:*************.检测范围:500-15.6 pg/mL灵敏度:5 pg/mL重复性:板内、板间变异系数均<10%。
2、知识背景:白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)家族蛋白包括IL-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗物。
除了皮肤角质化细胞、一些上皮细胞和中枢神经系统的一些细胞之外,IL-1并不在健康个体的未经刺激的细胞中分泌。
生理条件下IL-1的浓度仅在10-12-10-14M之间。
然而,为了应对刺激(如炎症物质、感染、细菌性内毒素),巨噬细胞和各种其它类型的细胞的IL-1分泌量将大大增加(1-4)。
3、试剂盒提供的试剂:试剂规格配制Cytokine standard 2/1瓶* 干粉状,按瓶上说明操作Biotinylated antibody 2/1瓶* 1:50用Dilution buffer R(1×)稀释Streptavidin-HRP 2/1瓶* 1:100用Dilution buffer R(1×)稀释Dilution buffer R(1×) 3/2瓶* 即用型Washing buffer(50×)1瓶 150∶用蒸馏水稀释TMB 1瓶即用型Stop solution 1瓶即用型Precoated ELISA plate 8×12或8×6*即用型封板膜 2/1张* 即用型说明书1份*:96/48 Tests4、需要实验者自行准备的试剂与仪器:1.酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热)2.微量加液器及吸头:P10,P50,P100,P200,P1000 3.蒸馏水或去离子水4.全新滤纸5.旋涡振荡器和磁力搅拌器5、注意事项:1.试剂应按瓶上标签说明储存,使用前室温平衡20-30分钟。
人脑啡肽酶ELISA试剂盒产品编号:SEKH0264适用于人血清、血浆或细胞培养上清液等样本仅供研究,不用于临床诊断目录背景介绍 (01)检测原理 (01)注意事项 (02)安全提示 (02)试剂盒组成及储存 (03)自备实验器材 (03)样品收集及储存 (03)试剂准备 (04)检测步骤 (06)结果判断 (06)参数表征 (07)参考文献 (09)常见问题分析及解决办法 (10)背景介绍:脑啡肽酶(Neprilysin/CD10)又称NEP或中性内肽酶24.11,是一种表达于多种细胞表面表达的锌金属肽酶。
该酶既具有类似热释酶的特异性,又具有二肽酰羧肽酶的功能。
NEP与哺乳动物脑内脑啡肽的降解和循环心钠素的失活有关。
NEP也被认为是常见的急性淋巴细胞白血病抗原(Calla),在某些疾病状态下在淋巴细胞表面表达。
NEP也作为止痛药和抗高血压药物的靶点。
NEP也是脑中淀粉样β肽(Aβ)的主要降解酶,表明衰老可能引起的NEP活性的下调可能通过促进Aβ的积累而促进阿尔茨海默病的发展。
检测原理:本ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。
将抗人Neprilysin单克隆抗体包被在酶标板上;分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本,标准品和样本中的人Neprilysin会与酶标板上的包被抗体充分结合;洗板后加入生物素化抗人Neprilysin抗体,该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的人Neprilysin发生特异性结合;洗板后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素,生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合;洗板后加入显色剂底物TMB,若反应孔中样品存在不同浓度的人Neprilysin,则HRP会使无色TMB变成不同深浅(正相关)的蓝色物质,加入终止液后反应孔会变成黄色;最后,在λmax=450nm(OD=450nm)处测定反应孔样品吸光度(OD),样本中的人Neprilysin浓度与OD 成正比,通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中人Neprilysin的浓度。
原理图:注意事项:1.试剂盒应在有效期内使用,请不要使用过期的试剂。
2.试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱,已复溶但未用完的标准品,请丢弃。
3.试剂盒使用前请在室温恢复30min,且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
4.在试验中标准品和样本建议作复孔检测,且加入试剂的顺序应保持一致。
5.为避免交叉污染,请在试验中使用1次性试管,枪头,封板膜(※)及洁净塑料容器。
.6.浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少,在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶盖上,使用前请离心处理(5-10S即可),使管壁上的液体集中在管底部,取用时,请用移液器小心吹打几次。
7.除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外,请不要使用其他来源试剂盒内含的试剂代替本试剂盒中的某单个组分。
8.为保证结果准确,每次检测均需做标准曲线。
安全提示:试剂盒中的终止液为酸性溶液,操作人员在使用时请带上手套并注意防护;在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛,如果不慎接触,请用大量清水清洗;检测血液样本及其它体液样本时,请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。
试剂盒组成及储存:试剂盒组成规格(96T)规格(48T)保存条件抗体预包被酶标板8*128*62-8℃标准品2支1支-20℃SR1标准品/样本稀释液16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩生物素化抗体120ul(100X)60ul(100X)2-8℃SR2生物素化抗体稀释液16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩酶结合物(避光)120ul(100X)60ul(100X)2-8℃SR3酶结合物稀释液16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩洗涤液(20×)30ml/瓶15ml/瓶2-8℃显色底物(避光)12ml/瓶6ml/瓶2-8℃终止液12ml/瓶6ml/瓶2-8℃封板胶纸4张2张说明书1份1份自备实验器材(不提供,可代购)1.酶标仪(主波长450nm,参考波长630nm)2.高精度移液器及一次性吸头:0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl3.洗板机或洗瓶4.37℃孵育箱5.双蒸水,去离子水,量筒等样本收集及储存:1.细胞培养上清:将细胞培养基移至无菌离心管,在4℃条件下1000×g离心10min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),避免反复冻融。
2.血清样本:室温血液自然凝固20min后,在4℃条件下1000×g离心10min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),保存过程中如有沉淀,请再次离心,避免反复冻融。
3.血浆样本:将全血收集到含抗血凝剂的管中,根据标本的实际要求选择EDTA,柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合20min,在4℃条件下1000×g离心10min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),避免反复冻融。
※注意:血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本,以免影响检测结果;如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的最高值,请将样品做适当倍数稀释后检测,建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。
试剂准备:1.试剂回温:首先在实验前30min将试剂盒,待测样本放置于室温下,浓缩洗涤液如出现结晶,请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。
2.配制洗涤液:预先计算好稀释后的洗涤液使用体积,然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液,未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。
3.标准品梯度稀释:加入标准品/样本稀释液(SR1)1ml至冻干标准品中,静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为8000pg/ml),然后按照以下浓度进行2倍稀释:4000、2000、1000、500、250、125、0pg/ml 进行稀释,8000pg/ml为标准曲线最高点浓度,标准品/样本稀释液(SR1)作为标准曲线的零点(0pg/ml)。
复溶过的标准品原液(8000pg/ml)未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装,并将其贮存在-20~-80℃冰箱,具体如下图。
4.生物素化抗体工作液:预先计算好试验所需用量,用检测稀释液(SR2)将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液(稀释前充分混匀),请在30分钟内加入到反应孔中。
生物素化抗体工作液具体稀释方法如下:板条浓缩生物素化抗体(1:100):μL检测稀释液(SR2):μL220198044039606605940880792010100990012120118805.酶结合物工作液:按每次试验所需用量配制,用酶结合物稀释液(SR3)将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液(稀释前离心),请在30分钟内使用。
酶结合物工作液具体稀释方法如下:板条浓缩酶结合物(1:100):μL检测稀释液(SR3):μL220198044039606605940880792010100990012120118806.洗涤方法:●自动洗板:甩尽酶标板孔中液体,在厚迭吸水纸上拍干,注入洗涤液为300ul/孔,注与吸出间隔为30秒,洗板5次。
●手工洗板:甩尽酶标板孔中液体,在厚迭吸水纸上拍干,用洗瓶加入洗涤液300ul/孔,静止30秒后甩净酶标板孔中液体,在厚迭的吸水纸上拍干,洗板5次。
检测步骤拍板&洗板4次拍板&洗板4次拍板&洗板5次结果判断:1.用酶标仪450nm 波长测定OD 值。
选择双波长检测,参考波长为630nm 。
如不能进行双波长检测,请用450nm 的OD 测定值减去630nm 的OD 测定值。
2.计算标准品、样品的平均OD 值:每个标准品和标本的OD 值应减去零孔的OD 值。
30min,拿出试剂盒,恢复至室温,加入标准品/样本前,请洗板3次并甩干100μl 标准品及检测样本至反应孔中,封板后于37℃孵箱孵育90min 100μl 生物素化抗体工作液至反应孔中,封板后于室温37℃孵箱孵育60min50μl 终止液,即刻用酶标仪450nm 波长下测量OD 值(5分钟内)100μl 显色底物至反应孔中,封板后于37℃避光显色15min 100μl 酶结合物工作液至反应孔中,封板后于37℃孵箱孵育30min3.以标准品浓度为横坐标,吸光度OD值为纵坐标,用软件绘制标准曲线,样品中Neprilysin含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限,应做适当稀释后重新检测,计算浓度时再乘以稀释倍数。
参数表征:1.数据及标准曲线标准品浓度(pg/ml)OD值1OD值2平均值矫正值00.0180.0240.021--1250.2060.1980.2020.1812500.2380.2280.2330.2125000.3540.3400.3470.32610000.5620.5400.5510.53020000.9130.8760.8950.8744000 1.487 1.427 1.457 1.4368000 2.978 2.971 2.975 2.953本图仅供参考,应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算人Neprilysin的样本含量。
2.灵敏度:最低可检测人Neprilysin浓度达60pg/ml,20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差,计算相应的可检测浓度。
3.特异性:不与人ECE-1、ECE-2、Neprilysin-2,小鼠Kell等反应。
4.重复性:板内,板间变异系数<10%。
5.回收率:在选取的健康人血浆、细胞培养上清中加入3个不同浓度水平的人Neprilysin,计算回收率。
样本类型平均回收率(%)范围(%)血浆9888-107细胞培养上清10290-1186.线性稀释:分别在选取的4份健康人血浆和细胞培养上清中加入高浓度人Neprilysin,在标准曲线动力学范围内进行稀释,评估线性。
稀释比例回收率(%)血浆细胞培养上清1:2平均回收率(%)98102范围(%)90-10688-1141:4平均回收率(%)97103范围(%)92-10389-115参考文献:1.Malfroy,B.et al.(1978)Nature276:523.2.Kenny,A.J.and Stephenson,S.L.(1988)FEBS Lett.232:1.3.LeTarte,M.et al.(1988)J.Exp.Med.168:1247.4.Shipp,M.A.et al.(1988)A85:4819.5.Itwata,N.et al.(2001)Science292:1550.常见问题及解决方法:问题可能原因解决方法高背景或阴性对照值偏高洗板不充分将洗涤液注入反应孔充分洗涤,彻底拍干孔中液体酶结合物过量检查酶稀释度,按说明书标识的稀释度稀释底物污染加底物前检查底物是否为透明无色,请勿用变蓝的底物,重新用新的底物试验阴性对照孔被阳性对照污染注意洗涤时不要把洗液溢出孔外,不使阴阳对照孔液体涟接一起不同批次试剂混用检查试剂批号,请勿用不同批次试剂显色信号弱试剂过期检查试剂盒有效期,请勿用过期试剂孵育时间过短按说明书中规定的时间孵育试剂污染检查试剂是否污染,请勿用污染的试剂酶标仪滤光片不匹配检查酶标仪设置及滤光片是否匹配试剂盒平衡不充分确保试剂盒试验前平衡至室温显色时间不够增加底物显色时间无显色信号检测抗体、酶、或显色剂漏加检查试验操作流程,重复试验酶被叠氮钠污染请使用重新配制的试剂试剂添加顺序有误检查复核试验添加顺序、流程,重复试验标曲佳但样品孔无信号样品中靶标物含量低或样品中无靶标物设置阳性对照,重复实验样品基质效应影响检测重新稀释样品后复测标曲佳但样品信号偏高样品中待检物含量超过标准曲线范围重新稀释样品后复测边缘效应孵育温度不均衡孵育时每步均使用新的封板胶纸,避免在环境温度变化大的地方孵育,勿叠放反应板。