硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告
引言：
硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：
1. 实验材料：
- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）
- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液
- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液
- 1% 硫胺素溶液
- 10% 硝酸盐还原酶提取液
- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂
- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液
- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液
- 0.1 mol/L 醋酸溶液
- 蒸馏水
2. 实验仪器：
- 分光光度计
- 定量移液器 - 离心机
- 恒温水浴槽
- 试管架
- 显微镜
实验步骤：
1. 提取硝酸盐还原酶：
a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：
a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
植物硝酸还原酶（NR）活力测定（活体法）
一、原理
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：
生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g-1·h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好
二、仪器与用具
分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。
三、试剂
1. 亚硝酸钠标准液 称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO2 5μg（亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。
2. 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO4 19.24g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。
3. 1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取10.0g加入250ml浓HCl中，用蒸馏水定容至1000ml。
4. 0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取2.0gα-萘胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至1000ml。
5. 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
6. KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称10.10g KNO3溶于1000ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加10ml异丙醇混匀。 四、方法
1. 标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。
华南农业大学
综合实验报告
实验项目名称：食品发酵工业中常用系列酶活力测定
实验项目性质：综合性实验
计 划 学 时 ：6
所属课程名称：食品与发酵工业分析
班 级：09生物工程2班
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学 号：************
实验课指导老师：沈玉栋
摘 要
测定食品发酵工业中常用酶活力，对于选择酶种类，工艺条件的制定等有重要意义。本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶，淀粉酶，蛋白酶进行了酶活力测定。其中，测定糖化酶采用直接滴定法，测定淀粉酶采用目测比色法，测定蛋白酶采用福林酚法。
关键词：酶活力 糖化酶 淀粉酶 蛋白酶 直接滴定法 目测比色法 福林酚法
1 前言
酶，从早期的酿造、发酵食品开始，至今已广泛应用到各种食品上。随着生物科技进展，不断研究、开发出新的酶制剂，已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。目前已有几十种酶成功地用于食品工业。例如，葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。应用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。
酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质，生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。作为生物体内的催化剂，催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
植物缺素培养及其硝酸还原酶活力和根系活力测定
1 实验名称 植物缺素培养及其硝酸还原酶活性和根系活力测定
实验目的
掌握植物溶液培养的基本方法，并通过植物的缺素培养，观察并认识N、P和K等矿质元素的转移缺素症状及各元素的生理功能。硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法以及测定根系活力的方法。
实验方案
【试验原理】
矿质元素是维持植物生长的重要的营养物质。植物在含有全部营养物质的完全按培养液中，可以正常发育。若植物在缺素培养液中，则会出现单一的缺素症，从而可以确定植物在生长发育中的生理功能。
硝酸还原酶活性一般采用活体法或离体法测定。离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO 进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO 并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO 的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲臢（TTF），TPF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。
