硝酸还原酶活性的测定
一、原理
硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2
NO3-+NADH+H→NO2- +NAD+H2O
产生的NO2- 可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2- 的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2- 含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品
721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）
0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：
1、 将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并
用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1） 1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml
（2） 0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告
引言：
硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：
1. 实验材料：
- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）
- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液
- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液
- 1% 硫胺素溶液
- 10% 硝酸盐还原酶提取液
- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂
- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液
- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液
- 0.1 mol/L 醋酸溶液
- 蒸馏水
2. 实验仪器：
- 分光光度计
- 定量移液器 - 离心机
- 恒温水浴槽
- 试管架
- 显微镜
实验步骤：
1. 提取硝酸盐还原酶：
a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：
a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
实验报告
课程名称：
植物生理学及实验
实验类型：探索、综合或验证
实验项目名称： 植物NR活力测定——体内法（活体法）
一、实验目的和要求
掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。
二、 实验内容和原理
实验原理：
硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，与作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根：
NO3-+NADH++H+ NO2-+NAD++H2O
测定原理：
根产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加。磺胺先与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。
三、主要仪器设备
1. 材料：在20℃蒸馏水培养一周小麦苗，实验前一天分两组，一组加KNO3，一组加0.5 mM CaCl2，在白天置光照下处理。
2. 试剂：磺胺试剂、萘基乙烯二胺溶液，酶促反应液（PBs+KNO3）
3. 器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱
四、操作方法与实验步骤 NR 1. 事先制作好NO2-标准曲线。
2. 在20℃蒸馏水培养一周小麦苗，实验前一天分两组，一组加KNO3，一组加0.5 mM CaCl2，在白天置光照下处理。
3. 取各组苗地上部约0.5 g左右,切成合适长度(1cm左右)，放入50mL注射器中。
4. 加酶促反应液10ml,抽气直到材料完全下沉（一只手戴上手套，用戴手套的食指封住注射器头，另一只手反复推拉抽气减压，将叶片中的空气赶尽，直到材料完全下沉）。
5. 置恒温箱30℃ 20min，取出后将反应液注射入烧杯中。
6. 取4ml反应过的液体，加磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml,室温放置5min后测540 nm OD。
五、实验数据记录和处理
1. NO2-标准曲线
2.
六、实验结果与分析
NO2-标准曲线为： y = 0.0062x + 0.0283 (R2 =0.9962)
硝酸还原酶的测定
一、实验目的和要求
掌握体内法测定植物组织中硝酸还原酶的原理和方法，阐明诱导酶的含义。2、 实验内容与原则
硝酸还原酶（nr）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐
还原为亚硝酸盐：
--
产生的NO2可以从组织渗透到外部溶液中，并在溶液中累积。NO2含量的增加表明酶的活性增加。
装no2含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对c氨基苯磺酸（或对c氨基苯磺酰
-
订线
（胺）反应生成重氮，然后与αC萘胺（或萘基乙二胺）反应生成紫红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长处有最大吸收峰，可通过分光光度法测定。溶液中NO2-的含量可用标准曲线测定。3、 主要仪器设备
1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。2、实验试剂0.1mol/lph7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液
3.两组大麦幼苗在15-25℃的蒸馏水中培养一周。一组用硝酸钾治疗，另一组用氯化铵治疗。
四、操作方法和实验步骤
1.切两组新鲜叶片。一组为0.51g处理苗，另一组为0.50g对照苗。将叶片分别切成0.5~1cm的碎片并压实。
2、两组中各加入15ml的酶促反应液。
3.真空提取10min，充分交换细胞内外液。4.盖上盖子，在30℃的培养箱中保存20分钟。 5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的od值。
7.空白管：4ml H2O+2ml磺酰胺溶液+2ml萘乙二胺溶液？在室温下放置15分钟后，在540nm处用分光光度法测定亚硝酸的OD值。
五、实验数据记录和处理
