电转细胞实验转染细胞方法

细胞电转染电转的简介 (1)电穿孔转染的基本原理及过程 (1)电穿孔转染条件的选择 (1)1 电参数 (1)2脉冲时程 (2)3 脉冲次数 (2)4 细胞因素 (3)5 质粒因素 (3)6 温度 (4)7．缓冲液以及培养液的成 (4)仪器常用键区介绍 (5)Neon TM电转染一般流程 (7)电转的简介电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于20世纪80年代中。

这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。

它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。

尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。

电穿孔转染的基本原理及过程电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。

其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。

再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。

一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可自动重新闭合。

电穿孔转染条件的选择1 电参数电场强度E与电压V有以下关系：V=E×d，在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。

对于动物细胞来说，电场强度通常选择1～1000V／cm，并遵循低电场长时程的原则。

电场强度的大小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec (Ec=Uc／1．5R)以下无R)以下无DNA摄入；适中的场强下DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大；高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小无关。

电场强度的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0。

lonza和伯乐电转方法Lonza和伯乐电转方法是两种与细胞工程和基因编辑相关的技术。

本文将分别介绍这两种方法的原理和应用。

我们来了解一下Lonza电转法。

Lonza电转法是一种常用的细胞转染技术，用于将外源DNA导入到目标细胞中。

其原理是利用高压电脉冲破坏细胞膜，从而使DNA能够穿透细胞膜进入细胞质，并在细胞内表达。

这种方法通常适用于多种细胞类型，包括哺乳动物细胞和真核生物细胞。

Lonza电转法的操作相对简单，一般分为三个步骤：细胞培养、DNA转染和筛选。

首先，需要将目标细胞培养至适当的密度和状态。

然后，将外源DNA与转染试剂混合，形成复合物。

接下来，将复合物加入目标细胞中，并施加高压电脉冲。

这些电脉冲会破坏细胞膜，使得DNA能够进入细胞质。

最后，通过选择性培养基或标记基因等方式筛选出成功转染的细胞。

Lonza电转法在生物医学研究和生物制药领域有广泛应用。

例如，科学家们可以利用这种方法将外源基因导入到细胞中，从而研究该基因在细胞功能和疾病发生机制中的作用。

此外，这种方法还可以用于生产重组蛋白、病毒载体等生物制品。

接下来，我们来了解一下伯乐电转方法。

伯乐电转方法是一种基因编辑技术，用于改变细胞中的基因组。

其原理是利用CRISPR-Cas9系统，通过设计特定的引导RNA和Cas9核酸酶，精确地切割目标DNA，从而导致基因组的改变。

伯乐电转方法的操作相对复杂，主要包括设计引导RNA、合成引导RNA和Cas9核酸酶、转染和筛选等步骤。

首先，需要设计合适的引导RNA，使其能够与目标DNA序列特异性结合，并指导Cas9核酸酶切割该DNA序列。

然后，将合成的引导RNA和Cas9核酸酶转染到目标细胞中。

在细胞内，Cas9核酸酶会与引导RNA结合，形成CRISPR-Cas9复合物，进而识别和切割目标DNA。

最后，通过PCR、测序等方法筛选出成功编辑的细胞。

伯乐电转方法在基因编辑研究和基因治疗等领域有着广泛的应用。

各种转染方法比较不同的实验室转染方法选择会依赖于多个相关因素，如目标细胞类型、转染效率、细胞毒性、需求的表达时间、实验的规模和预算等。

以下是一些常见的转染方法的比较：1. 离子交换法（Calcium phosphate transfection）离子交换法是最早开发和使用的转染方法之一、它使用磷酸钙和DNA或RNA的复合物在细胞表面形成凝析沉淀物。

该方法简单、经济且较为普遍，适用于许多细胞类型。

然而，它的转染效率较低，存在较多的细胞毒性。

2. 迷走转染法（Lipofection）迷走转染法是当前最常用的转染技术之一，通过磷脂体（例如Lipofectamine）与质粒DNA形成复合物。

该方法转染效率高，而且适用于许多类型的细胞，包括哺乳动物和非哺乳动物。

然而，迷走转染法存在一些限制，如细胞毒性、稳定性较差，和细胞特异性。

3. 电穿孔法（Electroporation）电穿孔法是通过应用电场使细胞膜暂时性孔化来实现转染效果。

它可以用于转染各种类型的细胞，包括哺乳动物、鸟类和植物。

电穿孔法的转染效率高，但存在一定的细胞毒性和细胞损伤风险。

此外，电穿孔设备的成本较高，需要专门训练的技术人员来操作。

4. 病毒载体转染法（Viral vector transfection）病毒载体转染法使用经修饰的病毒作为转染载体，可实现高效的基因传递和表达。

常用的病毒载体包括腺病毒、衣壳病毒和逆转录病毒。

这些病毒对于不同类型的细胞具有不同的亲和力和转染效率。

然而，病毒载体转染法的主要限制是细胞对病毒的感染能力，以及在临床应用中可能引发的安全性问题。

5. 直接注射法（Direct microinjection）直接注射法是一种机械刺伤细胞膜直接将DNA注入细胞的方法。

这种方法对于特定的细胞类型具有高效转染的能力，如哺乳动物受精卵和干细胞。

它可以实现精确控制和单细胞水平的转染，但需要昂贵的设备和专业技能。

总结起来，转染方法的选择应根据实验的具体需求来进行。

细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。

二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。

三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。

附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。

电穿孔法转染细胞原理
电穿孔法转染细胞是一种常用的基因转染技术，它利用高压电脉冲破坏细胞膜，使外源DNA进入细胞内。

其原理如下：
1. 电场诱导细胞膜孔洞形成
电穿孔法转染细胞的第一步是利用高压电脉冲产生强电场，电场的作用下，细胞膜内部的离子和分子会发生移动，形成孔洞。

这些孔洞的大小和数量取决于电场的强度和持续时间。

2. DNA进入细胞内
一旦细胞膜形成了孔洞，外源DNA便可以通过孔洞进入细胞内。

这些DNA分子可以是裸露的质粒DNA，也可以是DNA与载体复合物。

3. 细胞修复孔洞
在电穿孔的过程中，细胞膜受到了破坏，但细胞会尽快修复这些孔洞。

细胞膜修复的过程中，外源DNA可能会被稳定地整合到细胞基因组中，从而实现基因转染。

总的来说，电穿孔法转染细胞利用高压电脉冲破坏细胞膜，使外源DNA进入细胞内，然后通过细胞修复孔洞的过程，使外源DNA整合到细胞基因组中。

这种技术可以用于基因敲除、基因表达、基因编辑等多种研究应用。

细胞电转实验基本原理及步骤转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术，是我们完成项目的最基本方法。

转染大致可分为3种途径：物理介导（电穿孔法、显微注射、基因枪）、化学介导、生物介导（病毒介导）。

细胞电转染一、实验原理：细胞电转染（电转），也叫细胞电穿孔，是用短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会让电流可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促，从而使外源大分子物质DNA、RNA、蛋白质、一些小分子等进入细胞膜内部。

二、影响因素1. 细胞状态为保证电转后细胞的存活率，最好选取处于对数生长期的细胞。

因为处于对数生长期的细胞分裂更为旺盛，细胞膜表面结构的致密性与稳定期的细胞相比较差，因此在电转后，细胞膜的恢复能力更强，从而提高电转后的细胞存活率。

同时，处于有丝分裂期的细胞会更容易接受外源物质，有利于提高细胞的转染效率。

2.电转参数选择合适的电转参数对于电转实验非常重要，电转参数包括电压（500v-1900v）、脉冲（10 ms-45 ms）、次数（1-5），一般都分布在这一区间内。

参数过低，不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔，外援物质无法进入细胞内达到转染的目的；参数过高，细胞膜发生不可逆破碎，细胞死亡率增加，转染失败，因此在电转染实验中合适的电转参数尤为重要。

不同细胞的形态、特性及耐受度等都不同，实验前需要我们先通过电转预实验来摸索出最合适的电转参数，而后再进行正式试验。

3.其他电击会对细胞造成一定程度的伤害，而具有细胞膜修复成分的电转缓冲液可以将电击对细胞的损伤降到最低，从而降低转染后细胞的死亡率，提高转染效率。

三、电转预实验实验目的：在开展正式实验前摸索出最合适的电转参数。

实验流程1.实验前准备：电转杯、电转枪、电转Tip头（无菌）；处于对数生长期的细胞（细胞状态良好，至少维持合适密度生长2代，未发生过汇合）；2.设置若干个实验组，贴壁细胞建议1×105个/组、悬浮细胞建议2×105个/组；以贴壁细胞为例：弃去培养上清，用PBS轻柔冲洗细胞，抽净PBS，加胰酶消化细胞，待细胞脱落后加完全培养基终止消化，轻柔的吹打细胞悬液，尽量形成单细胞悬液，计数，取细胞与1.5 EP管内，离心，PBS清洗一遍。

各种转染方法比较转染是将外源DNA或RNA导入体细胞的一种常用技术，用于研究基因功能、疾病机制、基因治疗等领域。

常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体介导转染和生物矢量直接注射法等。

下面将对这些转染方法进行详细比较。

1.化学法：化学法是最简单、最常用的转染方法之一，主要通过化学试剂与DNA或RNA形成复合物，进而被细胞摄取。

常用的化学试剂有钙磷酸盐、聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、高分子聚合物等。

化学法的优势在于易操作、适用于不同细胞类型，且无需特殊设备。

但其转染效率相对较低，引起细胞毒性的风险较高。

2.电穿孔法：电穿孔法又称为电转染法，通过利用电场作用使细胞膜发生瞬时通透性，使外源DNA或RNA进入细胞。

这种方法可使用电脉冲仪或特殊转染设备进行操作，适用于多种细胞类型。

相比于化学法，电穿孔法的转染效率更高，但对细胞的毒性稍高。

3.病毒载体介导转染：病毒载体介导转染是一种高效的转染方法，常用的病毒载体有腺病毒（Adenovirus）、腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）、逆转录病毒（Retrovirus）和慢病毒（Lentivirus）等。

这些病毒载体不仅能将外源DNA或RNA导入细胞，还能使其在细胞内稳定表达。

病毒载体介导转染的优势在于高转染效率、稳定表达，适用于许多细胞类型。

然而，为了避免潜在的致病性和免疫反应，需要选择无毒性、无致病性的病毒载体。

4.生物矢量直接注射法：生物矢量直接注射法是将外源DNA或RNA直接注射到体内，让其进入目标细胞。

这种方法适用于许多动物模型研究，如小鼠、斑马鱼等。

生物矢量直接注射法的优势在于转染效率高、实验操作简单，但对于人体病理研究等实验要求较高的场景，其应用范围较窄。

根据以上比较，选择适合自己研究需求和细胞类型的转染方法非常重要。

需要考虑的因素包括转染效率、细胞毒性、操作难度、成本等。

在实际应用中，有时也可结合多种方法，例如将化学法与电穿孔法相结合，能够提高转染效率。

siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。

磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。

沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。

在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。

2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。

将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。

电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。

一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。

3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。

通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。

两种试剂都已成功用于转染。

DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。

4.机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particl e）。

显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。

基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。

5.阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。

这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。

因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。

使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。

几种转染方法的比较
目前，基因转染技术已经发展为分子生物学、生物工程和基因治疗等
领域的重要实用工具，它可以极大地提高研究的效率和准确度，是许多重
要的基础实验的重要手段。

基因转染，就是把DNA片段植入受体细胞，使
其形成完整的外源基因，从而使其编码的蛋白质可以表达出来。

其中，质
粒转染（经典CaCl2转染）、电穿孔转染、膜融合转染、磁珠转染、膜膜
转染、管状细胞转染（cylinder-mediated gene transfer）、病毒转染
和小肠转染等转染方法，是目前比较常用的基因转染方法。

一、质粒转染
质粒转染是将外源DNA片段载体在质粒上，用极低的浓度CaCl2诱导
细胞膜的瞬时通透性，使外源基因可以通过通透的细胞膜进入细胞，这是
质粒转染的原理，也是最常用的一种质粒转染方法。

质粒转染的优点：
（1）操作简单，易于大批量高效率的实验。

（2）操作条件宽松，不受受体细胞类型的限制，可以适应多种宿主
细胞。

（3）转染效率高，可以达到百分之九十以上。

（4）可以通过有效的筛选系统，有效控制外源DNA的插入和表达量。

质粒转染的缺点：
（1）转染过程对细胞毒性较大，转染效率有限。

转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。

分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。

病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。

但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。

其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。

影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。

二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）(1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。

(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。

(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。

(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。

B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。