酶联免疫吸附法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的优势

酶联免疫吸附法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的优势
【摘要】测定玉米中黄曲霉毒素B1的检测方法,薄层色谱法是较早使用的,试样中黄曲霉毒素B1经提取浓缩、薄层分离后,在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。

而酶联免疫吸附法是较新、较先进的测定法,试样中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后、与定量特异性抗体反应,多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合,加入酶标记物和底物后显色,与标准比较测定含量。

本文通过采用两种测定方法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的多次试验,通过全面对比、分析、总结,阐明酶联免疫吸附法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的优势。

【关键词】酶联免疫吸附法薄层色谱法玉米黄曲霉毒素B1
黄曲霉毒素是最危险的致癌物,早在1993年黄曲霉毒素已被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物,是一种毒性极强的剧毒物质。

黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时可导致肝癌,还可诱发骨癌、肾癌、直肠癌等,甚至死亡。

其中以黄曲霉毒素B1最为多见,其毒性和致癌性也最强,其在霉变的粮食及其制品中普遍存在,如玉米,大米、小麦、花生、豆类等。

为了预防黄曲霉毒素B1中毒事件的发生,维护人类健康,世界上已有70多个国家和地区对黄曲霉毒素B1含量作了限量要求。

我国粮食中黄曲霉毒素B1允许量标准(GB2761-81)规定,玉米、花生仁、花生油中不得超过20μg/kg,玉米及花生仁制品(按原料折算)中不得超过20μg/kg,大米、其他食用油中不得超过10μg/kg,其他粮食、豆类、发酵食品中不得超过5μg/kg,婴儿代乳食品中不得检出,其他食品可参照以上标准执行。

下面是本人测定黄曲霉毒素B1的多次实验总结。

1 酶联免疫吸附法测定玉米样品中黄曲霉毒素B1
1.1 主要仪器与试剂
DNM-9602A型酶标分析仪,恒温培养箱,振荡器;黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒,甲醇。

1.2 仪器工作条件
环境温度:21℃;相对湿度:70％;电源条件:220V,50HZ;输入功率:90V A。

1.3 实验准备
1.3.1 样品预处理
称取5.0g已粉碎的玉米样品1、样品2、样品3、样品4、样品5,用称样纸
卷筒小心放入100ml具塞三角瓶1、2、3、4、5中,用25.0ml移液管准确加入甲醇水(1+1)溶液,依次加入相当于0.5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg 黄曲霉毒素B1标准使用液,振摇15min,过滤,弃去1/4除滤液,收集式样滤液,此样为样品提取液1、2、3、4、5。

0.1ml样液提取液1、2、3、4、5+0.3mlA试剂,D=4,总稀释倍数v/m*D=20,即为待测液1、2、3、4、5。

1.3.2 试剂的配制
(1)每瓶C试剂(酶标抗原)中准确加入1.5mlD试剂(酶标抗原稀释液),充分溶解,配成试验用酶标抗原液,2～8℃保存。

(2)取3mlE试剂(浓缩洗涤液),用57ml蒸馏水,混匀后制成实验用洗涤液。

1.4 实验步骤
(1)实际平衡:将测试盒与室温中放置15min以上,直至平衡值室温。

(2)小孔编号:取12个小孔放置反应板架上。

设定1号孔位仪器调零孔,2-7号孔位AFB1标准对应孔,8-12号孔为样品待测液1、2、3、4、5孔。

(3)洗涤:加入250μl左右洗涤液,洗涤液不得溢出,放置1min后,甩掉洗液,在吸水纸上拍干,重复洗版一次。

(4)反应组成:按下列步骤所示(见表1),依次加入配制好的溶液剂待测样液。

第一步:1号孔加入50μlA试剂(样品稀释液),2-7孔分别加入系列的B试剂(AFB1标准溶液:0,0.1,0.25,0.5,1,2ng/ml)50μl,8-12孔加入待测液1,2,3,4,5。

第二步:1号孔加入50μlD试剂(酶标抗原稀释液),其余孔均加入50μlC试剂(酶标抗原稀释液)。

第三步:轻轻地振摇,使各孔中的反应物混匀。

(5)反应:将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30min。

(6)洗涤:取出反应板,用力甩掉反应液,拍杆。

每孔加入250μl左右洗涤液,洗涤液不得溢出,在吸水纸上拍干,重复洗涤4次。

(7)显色:每孔分别加入F 试剂(显色底物液a)和G试剂(显色底液b)各50μl,摇匀,将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15min。

(8)终止与仪器测定:每孔分别加入H试剂(终止液)50μl,摇匀后用酶标测定仪在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。

2 采用薄层色谱法测定样品
采用薄层色谱法测定样品1、样品2、样品3、样品4、样品5中黄曲霉毒素B1,经提取浓缩、薄层分离后,在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。

表1反应物组成
表2 采用酶联免疫吸附法和薄层色谱法测定的结果对比表单位:μg/kg
方法测定结果汇总(见表2)
4 结论
4.1 测定结果对比
由于我采用的是加标试验,通过计算得出结论是:酶联免疫吸附法测定结果回收率99％～101％,检出限接近0.01μg/kg。

而薄层色谱法测定测定的结果回收率92％～105％,检出限接近5μg/kg。

4.2 实验时间对比
薄层色谱法中薄层板的制备就需2个多小时,一次实验要3个多小时。

而酶联免疫吸附法只需1小时即可。

4.3 实验安全对比
薄层色谱法用到的化学试剂主要有:石油醚、三氯甲烷、甲醇、苯、乙腈、三氟乙酸等。

用量大,有的做一份样品就要用100ml,易挥发,易燃易爆,有毒,有的可致周围神经炎,有的对中枢神经系统有麻醉作用;有的对视神经和视网膜有特殊选择作用,引起病变;还有的可致癌。

对环境有危害大,对实验人员身心健康危害大。

而酶联免疫吸附法用化学试剂主要有:甲醇水(1+1)溶液。

用量小,做一份样品最多的只要用50ml,化学试剂用量减少50％,显而易见对环境和实验人员身心健康危害都要减少很多。

通过实验和各项指标对比、分析、总结,得出结论:薄层色谱法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的劣势:操作繁琐、使用化学试剂量大、对实验人员健康危害大、定量差、耗时长等缺点。

而酶联免疫吸附法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的优势:是目前国际测定黄曲霉毒素B1的先进方法,此法操作简单、灵敏度高,干扰少,测定步骤简便、快速、使用实验试剂量小、对实验人员健康危害小、定量分析准确。

所以本人建议推广使用酶联免疫吸附法测定粮食及其制品中黄曲霉毒素B1含量。

参考文献:
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