免疫印迹常用试剂(除一抗外)

实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。

不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。

该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。

该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。

目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。

免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。

蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。

本试验采用湿法转移。

免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。

大多数应用前者。

本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。

转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。

目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。

本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。

2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。

免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。

本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。

二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。

首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。

然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。

接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。

最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。

检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。

三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。

离心收集上清液，即为蛋白样品。

2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。

将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。

上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。

3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。

按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。

在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。

4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。

免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。

下面将详细介绍WB实验的具体步骤。

1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。

使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。

再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。

2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。

3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。

电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。

电泳结束后，将凝胶转移到膜上。

4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。

5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。

常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。

6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。

一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。

7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。

8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。

10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。

最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。

11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。

需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。

同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。

常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。

由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。

IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。

本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。

常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。

这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。

常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。

原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。

这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。

常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。

细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。

这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。

常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。

细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。

常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。

同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。

常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。

情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。

免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。

免疫印迹（Western blot）法标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事免疫印迹实验的实验技术人员和研究生。

二、操作规程
1、所需试剂：30%的储备胶溶液，1M Tris-HCl pH8.0，1.5M Tris-HCl PH6.8，10%SDS 溶液，TEMED，10% APS溶液，10X电泳缓冲液，2X SDS电泳上样缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，转膜缓冲液（TBS），0.01M PBS，丽春红染液，封闭液（5%的脱脂奶粉TBS），相应的一抗、二抗等。

2、规程：
1）SDS-PAGE电泳规程见SDS-PAGE SOP
2）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，3次×5min。

3）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中，10min。

4）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极（+）碳板、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、阴极（—）碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，装入电泳转移槽中，接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr或18V过夜，转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。

3）封闭：将膜转入一容器中加入封闭液，于摇床上室温振荡2H；
4）加入一抗：弃去封闭液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次，按合适稀释比例加入一抗，液体必须覆盖膜的全部，4℃过夜。

5）洗膜：取出NC膜，用PBS洗膜，3次×5min；
6）加入二抗：加入适当比例二抗，于摇床上室温振荡2h；
7）曝光、显影：用PBS洗膜，3次×5min，配制显色液（按说明书要求），将膜浸入其中片刻后压片，通过曝光时间的长短调节蛋白条带的亮度和背景的强弱。

免疫电泳法所用试剂
免疫电泳法所用的试剂主要包括以下几种：
1. 蛋白质样品：免疫电泳法主要用于分离和检测蛋白质，所以需要有待检样品。

2. 蛋白质分离胶：免疫电泳通常使用聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel）作为分离基质。

这需要一些成槽胶液和凝胶片，例如SDS-PAGE凝胶和非变性凝胶。

3. 输运缓冲液：用于运输蛋白质样品和抗体的缓冲液。

常用的有Tris缓冲液、磷酸缓冲液等。

4. 蛋白质标记物：用于标记待检蛋白质或抗体的标记物，常用的有酶标记物、荧光标记物等。

5. 蛋白质染色剂：用于染色展示分离蛋白质的染色剂，常用的有银染剂和考马斯亮蓝染剂等。

6. 抗体：免疫电泳需要使用特异性抗体与待检蛋白质结合，常用的包括一抗和二抗。

7. 标准蛋白：用于建立标准曲线，确定待检蛋白质的相对分子质量。

以上只是免疫电泳法所用试剂的一些常见例子，具体实验根据需要可能有所不同。

蛋白免疫印迹（WesternBlot）1.4.9 细胞裂解液50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。

1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。

1.4.12转膜缓冲液Tris碱3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。

4℃避光保存。

1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。

1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。

1.4.15 10%SDSSDS 10g，ddH2O定容100ml。

1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）丙烯酰胺29g，N，N’-Y亚甲双丙烯酰胺1g，温热去离子水分别溶解上述后,再补去离子水至100ml.滤纸过滤,储于棕色试剂瓶中,4℃保存一月。

1.4.17 10×TBST缓冲液浓度为100mmol/L Tris-HCl pH 8.0；1500 mmol/L NaCl；0.2%Tween-20，补水至1000ml. 高压灭菌，4℃保存，使用前再做10 倍稀释。

1.4.18 封闭液（5%脱脂奶粉）脱脂奶粉 5g，1×TBST 80ml,充分溶解后补1×TBST 至100ml。

1.4.19 10%过硫酸胺APS（4℃避光保存）APS 10g，ddH2O定容100ml。

免疫印迹免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。

它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。

由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。

而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。

而Western blot却没有这些缺点。

因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。

也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。

一、原理是SDS-PAGE电泳与免疫检测相结合的一种蛋白质检测方法。

强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

然后将蛋白质转移到膜上，继而用抗体进行检测。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

二、实验材料诱导与未诱导的带有口蹄疫病毒保护性抗原VP1与LTB融合蛋白基因的工程菌。

三、仪器、耗材与试剂（一）仪器、耗材DYY－6C电泳仪、DYCZ－24D垂直板电泳槽、封口机、DYCP－40C半干式转移电泳槽、5ml、1ml、200μl、50μl、10μl移液器及相应的Tip、50ml烧杯。

新华滤纸、PVDF 膜。

免疫印迹（Western Blot）操作规程实验目的：免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达15.14g Tris 10 ml 10% SDS 溶解后调节 pH 到6.8 需要注意的是要在低温调节pH电极缓冲液：1L 6g Tris 28.8g Gly 溶解后加10ml 10% SDS 定容到1L样品处理液：须配制20*buffer 200mM Tris 20mM EDTA pH 8.05*loading buffer(see Takara)组分：250mM Tris-HCL(PH6.8) 10%SDS 0.5%BPB 50%甘油 5%β-巯基乙醇（2-ME）1M Tris-HCL(PH6.8) 1.25mlSDS 0.5gBPB 25mg甘油 2.5ml去离子水溶解后定容到5ml小份（500ul/份）分装后，于室温保存。

使用前将25ul的2-ME加到每小份中，加入2-ME的Loading buffer可在室温下保存一个月左右。

实验操作程序：样品处理由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。

提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM(sigma)及NaF25mM(sigma)）。

注意SDS终浓度勿超过10%。

对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。

蛋白裂解液：PBS+1%Triton+1%SDS+1*Protease inhibitor cockerIII (蛋白酶抑制剂，MEK:59134-1set)+Na3VO4 0.1mM(sigma)及NaF 25mM(sigma)）。

或者Phosphatase Inhibitor Cocktail III (磷酸酶抑制剂，biovision：K276-1EA) 培养的细胞（定性）：1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

免疫印迹吴克非（21100211）刘彩奇（21100210）萧艳（21100229）陈柏合（21100230）实验原理:免疫印迹（Western blot）又称蛋白印迹，是凝胶电泳与固相免疫测定技术结合起来的一种免疫生化技术，借助特异性抗体鉴定抗原。

在电场作用下将电泳分离的蛋白质由凝胶转移至固相载体，用识别此多肽的抗体进行检测。

免疫印迹的灵敏度可达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需对靶蛋白进行放射性标记，此方法可检测出1~5ng中等大小的待检蛋白。

实验目的：掌握实验原理和相关技术如SDS-PAGE等；掌握各项操作中的注意事项及应用范围；了解设置内参的目的和原理及集中常用的内参蛋白。

实验器材及试剂：SDS-PAGE电泳槽，转膜电泳槽，海绵垫，滤纸，镊子，EP手套，去离子水，Tris HCL/SDS （Ph6.8），Tris HCL/SDS（Ph8.8），10%过硫酸铵（APS）,四甲基乙二胺（TEMED）,30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺，电泳缓冲液，转移缓冲液，5%脱脂奶粉，硝酸纤维素膜（NC膜），洗液，特异性抗原（一抗），DAB,经过还原剂处理的小鼠血清，未经过还原剂处理过的血清实验步骤：1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：（1）将玻璃板洗净擦干，装好玻璃板，加入双蒸水检查密封性；（2）按下表配置10%的分离胶，充分混匀后沿隔板条边缘缓缓加入，距短板2.5cm左右时停止，先后沿两侧隔条加入少许去离子水覆盖胶面，室温聚合30~60min（37℃水浴箱15~20min）；（3）（4）按下表制备浓缩胶，混匀后用胶头滴管加入，插入梳子；室温聚合30~60min左右（（5）（6）样品的处理：30µl小鼠血清（小鼠IgG）+30µl2×SDS样品缓冲液，混匀后100℃煮沸3~5min，小心拔出梳子后用移液器将经还原剂处理过的样品及未经处理的样品液加入到孔中，约15µl/孔。

免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究领域。

本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白的表达情况，并探究其在细胞信号转导中的作用。

实验材料和方法：材料：1. 细胞培养基和培养器具2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳胶和电泳仪4. 蛋白转印膜和转印仪5. 抗体：一抗和二抗6. ECL检测试剂盒方法：1. 培养细胞并进行处理，如添加特定药物或刺激剂。

2. 收集细胞并用细胞裂解液裂解蛋白。

3. 通过SDS-PAGE电泳将蛋白质分离。

4. 将分离的蛋白转移到蛋白转印膜上。

5. 进行膜上抗原的非特异性结合位点的阻断。

6. 使用一抗与目标蛋白特异性结合。

7. 清洗膜，并使用二抗与一抗结合。

8. 再次清洗膜，并使用ECL检测试剂盒进行显色。

9. 使用图像分析软件分析结果。

结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白的表达情况。

在实验中，我们选择了细胞中一个重要的信号转导蛋白作为目标蛋白，以探究其在细胞内的作用和调控机制。

首先，我们培养了细胞并进行了不同处理。

通过细胞裂解液裂解蛋白，我们成功地提取了目标蛋白。

接下来，我们使用SDS-PAGE电泳将蛋白质分离，并将其转移到蛋白转印膜上。

通过这一步骤，我们可以将蛋白在膜上固定，并便于后续的抗体结合。

在进行免疫印迹之前，我们需要对膜进行阻断，以防止非特异性结合。

通过使用牛血清白蛋白或非脂性奶粉等物质，我们可以有效地阻断膜上的非特异性结合位点。

在阻断后，我们使用一抗与目标蛋白特异性结合。

一抗的选择对于实验结果的准确性至关重要，因此我们在实验前进行了充分的文献调研和试验优化。

在与一抗结合后，我们进行了膜的清洗，以去除未结合的抗体。

接下来，我们使用二抗与一抗结合，并再次清洗膜。

二抗通常被标记有荧光素或酶，以便于后续的信号检测。

最后，我们使用ECL检测试剂盒进行显色。

ECL技术利用酶的催化作用产生荧光或发光信号，从而检测目标蛋白的表达情况。

蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。

包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。

6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。

【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。

平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行。

immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）是一种常用的蛋白质检测方法，它通过使用特异性抗体来检测目标蛋白质在复杂的混合物中的存在和量。

免疫印迹法的原理是将蛋白质样品分离后转移到固定膜上，然后用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过检测抗体标记物的信号来确定目标蛋白质的存在与数量。

免疫印迹法的步骤如下：1.蛋白质分离：首先，将待测样品进行电泳分离。

通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，根据蛋白质的分子量大小将其分离成不同的带状条带。

2.转印：将蛋白质从凝胶转移到固定膜上。

这个步骤通常使用西方半湿法或湿法转印，将凝胶和膜夹在一起，通过电流使蛋白质从凝胶逐渐转移到膜上。

3.阻断：为了减少非特异性结合，需要用饱和蛋白或其他蛋白质进行膜的阻断。

常见的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）或非脂干奶粉。

4.抗体结合：将特异性的一抗加入到含有阻断剂的缓冲液中，将膜与抗体溶液一同孵育，使抗体与目标蛋白质结合。

5.清洗：将膜用洗涤缓冲液洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的成分。

6.检测：将抗体标记物（如荧光素、辣根过氧化物酶等）加入到膜上，使其与结合的抗体发生特异性反应。

通过荧光素的化学反应或辣根过氧化物酶底物的显色反应来产生可见的信号。

这些信号可以通过数字成像系统进行记录和分析。

免疫印迹法的优点包括：能够检测特定蛋白质的存在和量；需要样品量比较小，一般几微克；灵敏度高，可检测到非常低浓度的目标蛋白质；可以同时检测多个蛋白质。

然而，免疫印迹法也存在一些局限性，如需要已知的特异性抗体来进行检测，如果没有可用的抗体，就无法检测目标蛋白质；对于高分子量的蛋白质，由于电泳分离的限制，可能无法很好地分离和转移；部分抗体可能存在交叉反应或非特异性结合问题；荧光或显色信号必须进行定量分析才能获得准确的结果。

总体来说，免疫印迹法是一种常用且可靠的蛋白质检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。

一个完整的WB实验需要哪些试剂呢？蛋白质免疫印迹(Western Blot, WB )是很常规的生物学实验，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如PVDF膜）上，以非共价键形式吸附蛋白质。

固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显影，检测特异性目的蛋白的表达。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

众所周知，市场上与WB相关的品牌繁多，其下各类产品更是乱花眼球，如何于三千弱水中找到一个可靠稳定的供应商，一个完整的WB实验又需要哪些试剂呢？【1】蛋白质提取与定量：良好的样品制备与准确的蛋白定量，是WB实验成功的第一步。

如ExKine™ T otal Protein Extraction Kit ExKine™总蛋白提取试剂盒KTP3006。

【2】彩色预染蛋白质Marker (15-130 kDa)：要想条带跑的好，预染Marker少不了: 监测WB电泳进程；评估转膜效率；判读分子量，如彩色预染蛋白质Marker (15-130 kDa)BMM3002【3】内参抗体，标签抗体，皇冠一抗：种属多，应用全，各类偶联产品齐全；抗体尽在Abbkine【4】酶标二抗 & 奥德赛（Odyssey）专用二抗 A21010Nature文章认可的高稳定性二抗，适用于WB与IHC【5】ECL显影与PAGE胶染色K22020高灵敏、低背景、持续时间长的ECL显影液；高效、快捷、无毒的PAGE胶快染试剂盒，让结果更快，更好，更强。

免疫印迹实验步骤及问题解决一、实验步骤试剂和缓冲液1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% SDS，1% Triton X-100 或NP40. 1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，2.7 mM Na2HPO4，2.7 mM KH2PO4，pH 7.4 BCA或Bradford蛋白分析试剂盒1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到8.81.0 M Tris缓冲液（pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到6.810% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。

用前准备10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。

1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris，230 mM 甘氨酸（pH 8.3），0.1% SDS。

3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8），6% SDS，30% 甘油，30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl，0.05% Tween-20，0.001% 硫柳汞1x 转移缓冲液: 3 g Tris，14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L样品准备细胞培养样品贴壁细胞去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。

在冰上孵育5-10 min。

完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。

（可选）充分混匀或超声处理。

4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清总蛋白用前需储存在-20°C。