乳酸菌冷冻保护剂配方设计

细菌冻干保护剂配方
细菌冻干是一种常见的保存细菌的方法，但在冻干过程中，细菌容易受到氧化、脱水等因素的影响，从而导致细菌数量减少或丧失活性。

为了提高细菌冻干的保护效果，可以添加一些保护剂来保护细菌。

下面是一种常用的细菌冻干保护剂配方：
成分：
1. 磷酸二氢钾 0.1mol/L
2. 葡萄糖 5% (w/v)
3. 甘油 10% (v/v)
4. 酪蛋白酸钠 0.5% (w/v)
5. 硫酸镁 0.01mol/L
6. NaCl 0.9% (w/v)
制作方法：
1. 在一烧杯中加入适量的去离子水，加热至85℃左右。

2. 待水温降至60℃左右时，加入磷酸二氢钾和葡萄糖，充分溶解。

3. 加入甘油和酪蛋白酸钠，充分混合。

4. 最后加入硫酸镁和NaCl，搅拌均匀。

5. 调节pH值至7.0左右，再过滤灭菌即可。

使用方法：
将细菌培养至对数生长期，加入预先配制好的保护剂，混匀后放入冻干机中进行冻干处理。

细菌冻干保护剂配方中的甘油和葡萄糖可以提供必要的营养物质和保护剂，酪蛋白酸钠可以保持细菌的活性，硫酸镁和NaCl则可以调节渗透压和维持细胞的完整性，从而提高细菌的存活率和保护效果。

分析与检测发酵乳杆菌是乳酸菌的一种，广泛存在于发酵食品中，由于其对胃肠道环境具有较好的适应能力、对胆固醇具有较强的降解能力以及具有免疫调节等促进人体健康的作用。

本研究以发酵乳杆菌为研究对象，对其冻干保护剂种类及添加量进行筛选，利用单因素和正交实验确定其冻干保护剂的最佳配方。

1　材料1.1　菌株发酵乳杆菌（H0801），由汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司提供。

1.2　MRS培养基蛋白胨1%、牛肉粉0.5%、酵母粉0.4%、葡萄糖2%、吐温-800.1%、磷酸二氢钾0.2%、乙酸钠0.5%、柠檬酸0.2%、硫酸镁0.02%、硫酸猛0.005%以及琼脂粉1.5%，按比例配制1 L，pH为6.80。

1.3　菌泥制备5%接种量、温度37 ℃、培养24 h，12 000 r/min离心10 min，菌泥备用。

2　方法2.1　单一保护剂添加量的确定5种保护剂原料及其添加量为脱脂乳粉（4%、6%、8%、10%与12%）、海藻糖（1%、3%、5%、10%与15%）、麦芽糊精（0.5%、1%、3%、5%与7%）、VC钠（0.02%、0.04%、0.08%、0.1%与0.15%）及甘油（0.1%、0.5%、1%、1.5%与2%）。

分别用5种不同浓度保护剂与菌泥混合，菌泥与保护剂比例为1∶2，混合均匀后，分装到冻干机托盘中，进行冻干，测定冻干前后的活菌数，并计算冻干存活率。

2.2　不同组合保护剂添加量的确定根据单一保护剂实验结果，制定4个不同添加量的组合保护剂配方，分别配置冻干保护剂，在相同的冷冻干燥条件下冻干，并测定每个方案冻干前后的活菌数，计算存活率。

①海藻糖15%、脱脂乳粉12%、VC钠0.15%、甘油0.1%与麦芽糊精1%；②海藻糖5%、脱脂乳粉6%、VC钠0.08%、甘油0.5%与麦芽糊精3%；③海藻糖10%、脱脂乳粉8%、VC钠0.1%、甘油1%与麦芽糊精5%；④海藻糖3%、脱脂乳粉10%、VC钠0.04%、甘油1.5%与麦芽糊精7%。

瑞士乳杆菌冻干保护剂的选择吴玲;潘道东;刘海燕【摘要】研究几种高、低分子化合物对冻干瑞士乳杆菌的保护作用.以冻干后的活菌存活率和凝乳时间为考察指标,先进行单因素试验筛选出保护效果最好的4种物质甘油、葡萄糖、组氨酸和牛血清白蛋白,用这4种物质复配,进行复合保护剂正交试验.结果表明:将增菌培养基发酵液(含10%脱脂乳)与冻干保护剂溶液混合冻干,最佳保护剂配方为0.5%甘油+15.0%葡萄糖+150 mg/L组氨酸+1.5%牛血清白蛋白.加入冻干保护剂后,瑞士乳杆菌冻干后存活率可达89%.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2010(026)001【总页数】4页(P157-159,163)【关键词】瑞士乳杆菌;冷冻干燥;保护剂【作者】吴玲;潘道东;刘海燕【作者单位】常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系,江苏,常州,213164;南京师范大学国家乳品加工技术研发分中心,江苏,南京,210097;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波315211;山西大同大学农学院,山西,大同,037009【正文语种】中文瑞士乳杆菌是一种具有保健功效的新型酸奶生产菌种，蛋白酶活力较高，其在水解乳蛋白过程中产生的活性肽可以抑制血管紧张素转化酶Ⅰ（ACE）的活性，从而产生降血压的功效［1］。

目前，瑞士乳杆菌制品主要是通过冻干的形式生产的，冷冻干燥过程会对菌体细胞造成一定的伤害甚至使菌体死亡，主要有冷冻伤害和冻干伤害，降低了菌种的存活率，对生产十分不利。

在实际生产中通常采用各种保护剂来降低冻干过程对乳酸菌的伤害。

一些亲水且能透过细胞膜的小分子保护剂能渗入细胞内抑制冰晶生成、减缓冰晶生长，冷冻时可减少对细胞的损伤；而不能穿透细胞膜的大分子保护剂有很强的亲水特性和氢键形成能力。

保护剂利用它们的氢键和亲水基形成稳定的水分子层阻碍膜内结合水向外转移，保护了细胞结构［2］。

中国关于瑞士乳杆菌冻干保护剂的研究较少，且常用保护剂都比较单一，保护效果有限。

酸奶菌种冷冻干燥保护剂的筛选研究黄丽金，陆兆新＊，袁勇军（南京农业大学食品科技学院，江苏　南京 ２１００９５）摘 要：本研究采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计法，对蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇、可溶性淀粉、明胶、抗坏血酸、谷氨酸钠、Ｌ－半胱氨酸盐酸盐以及脱脂奶粉等１４种材料对德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种冷冻干燥的保护效果进行评价。

结果表明：对德氏乳杆菌保加利亚亚种在冷冻干燥中有显著保护作用的是蔗糖、甘油、山梨醇以及脱脂奶粉；而唾液链球菌嗜热亚种有效的冷冻干燥保护剂为甘油、谷氨酸钠和脱脂奶粉。

关键词：德氏乳杆菌保加利亚亚种；唾液链球菌嗜热亚种；Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计法；冷冻干燥；保护剂Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ ｔｈｅ　Ｐｒｏｐｅｒ　Ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｙｏｇｈｕｒｔ　ＳｔａｒｔｅｒＨＵＡＮＧ　Ｌｉ－ｊｉｎ，ＬＵ　Ｚｈａｏ－ｘｉｎ＊，ＹＵＡＮ　Ｙｏｎｇ－ｊｕｎ（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｕｃｒｏｓｅ，　ｍａｌｔｏｓｅ，　ｌａｃｔｏｓｅ，　ｆｒｕｃｔｏｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ，　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　ｍａｎｍｔｏｌ，　ｓｏｒｂｉｔｏｌ，　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｓｔａｒｃｈ，　ｇｅｌａｔｉｎ，　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ，　ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ，　Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｓｋｉｍｍｉｌｋ　ｆｏｒ　ｙｏｇｈｕｒｔ　ｓｔａｒｔｅｒ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｕｃｒｏｓｅ，　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　ｓｏｒｂｉｔｏｌ　ａｎｄ　ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓｆｏｒ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ，　ｗｈｉｌｅ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　ｓｏｄｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ａｎｄ　ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｔｉｖａｒｉｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｔｉｖａｒｉｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ； Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ；ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ；ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００５）１２－０１０３－０４收稿日期：２００４－１０－１０ ＊通讯作者作者简介：黄丽金（１９８０－），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物及其生物技术。

培养基配方如下"改良MRS培养基蛋白陈10g牛肉膏10g酵母提取物5g葡萄糖20个吐温80 1 g琼脂粉15g乙酸钠5g柠檬酸二铰2gK2HPO4 2g MgSO4.7H2O0 0.58g MnSO4.4HZO 0.25g碳酸钙20g蒸馏水1000 mL pH6.2 121 C x l0 min灭菌MRS培养基蛋白陈109牛肉膏109酵母提取物5g葡萄糖209吐温8019琼脂粉159乙酸钠5g柠檬酸二按2gKZHPO429MgSO4#7HzO0.589MnSO4#4HZO0.259蒸馏水1000mLpH6.212loCxlsmin灭菌明胶基础培养基蛋白陈lg酵母提取物lg葡萄糖0.19明胶129盐溶液4mL蒸馏水100mLpH值7.0115oCxlsmin灭菌蛋白陈水培养基蛋白陈109NaC巧g蒸馏水IO00mLpH值7.012loCX15mill灭菌冻干保护剂脱脂乳粉1209蒸馏水gsomL115oCxlsmin灭菌2.3.1.1酸菜中乳杆菌的分离与纯化取酸菜汁lmL,用无菌PBs缓冲液梯度稀释到10-,,分别从10一!10石!10一,三个稀释度的试管中各取0.2mL涂布于改良MRS琼脂培养基上,于37e!80%氮气!10%氢气和10%二氧化碳的厌氧环境下培养2小48小时后,挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落,进行革兰氏染色!镜检"凡是革兰氏阳性的菌株,继续在MRS培养基上纯化培养,直至镜检为纯菌"2.3.1.3过氧化氢酶试验挑取固体培养基上培养24小时后的单个菌落,置于洁净玻片上,滴加3%过氧化氢溶液数滴(新鲜配制),在305内有大量气泡产生者为阳性(+),不产生气泡者为阴性(一)"其中过氧化氢酶试验阴性的杆菌初步确定为乳杆菌(敖敦格日勒等,2002)"将这些菌株编号后接种到MRS斜面培养基上,培养24小时后置4e冰箱中保存备用"2.3.1.4菌种保存将己经分纯的乳杆菌接入10mL液体MRS培养基中37e培养20小时后,离心(6000甲m离心10min)收集菌体,然后加入3mL冻干保护剂,对菌体进行悬浮,混匀后取分装至安瓶瓶中(600林F瓶),然后放入一20e的冰箱中预冻12小时"预冻结束后,立即放入冻干机中进行冷冻干燥,搁板温度均为一40干燥压力均为10Pa,干燥温度均为202.3.2.5部分分离株的糖发酵试验将分离自酸菜样品的分离株Ll一L10和分离自猪肠道样品的分离株L10一L20在MRS固体培养基上划线,37e恒温培养24h后,挑取单个菌落接入发酵管内,放入灭菌试管中,37e培养一周后观察试验结果,并记录,阳性用(十)表示,阴性用(一)表示"通过菌种对单糖!二糖!多糖以及糖普和糖醇类等碳水化合物的利用情况加以鉴定它们的种"其反应结果仅局限于保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌生产的普通酸奶, ,嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵乳糖产生乳酸、醋酸、细菌素等健康促进成分,但是它们对酸及胆汁盐非常敏感，难以通过胃肠环境而在肠道中定植。

乳酸杆菌培养基配方乳酸菌是一类革兰氏阳性的杆状细菌，能够产生乳酸作为代谢产物。

乳酸菌在食品工艺中起到很重要的作用，如发酵食品的制作，以及调味品等的生产。

为了培养乳酸菌，需要使用适合它们生长的培养基。

下面是一种常用的乳酸菌培养基配方:-葡萄糖：10g-蛋白胨：5g-酵母浸没液：5g-磷酸氢二钾：2g-氯化钙：0.02g-硫酸亚铁：0.01g-青霉素：0.05g-pH调节至7.0以上配方中，葡萄糖是乳酸菌的主要碳源，提供能量和生长所需的碳源。

蛋白胨和酵母浸没液提供氮源和其他必需的营养物质。

磷酸氢二钾提供磷酸盐，维持细胞内的酸碱平衡。

氯化钙和硫酸亚铁提供必要的矿物质。

青霉素使用抗生素可以抑制其他微生物的生长。

-酪蛋白胨：10g-氯化钠：5g-乳糖：10g-葡萄糖：10g-磷酸二氢铵：3g-氯化钾：1g-氯化镁：0.02g-pH调节至7.0酪蛋白胨是酪蛋白的水解产物，提供氮源和其他必需的营养物质。

氯化钠提供必需的无机盐。

乳糖提供碳源。

葡萄糖提供能量。

磷酸二氢铵提供磷酸盐。

氯化钾和氯化镁提供必需的矿物质。

-葡萄糖：20g-麦芽浸淀粉：10g-蛋白胨：10g-酵母浸没液：10g-三氯化钠：5g-磷酸二氢钠：2g-醋酸亚铁：0.5g-硫酸锰：0.025g-青霉素：0.005g-pH调节至7.0MRS培养基是一种常用的乳酸菌培养基，适用于乳酸菌的生长。

除了葡萄糖、蛋白胨和酵母浸没液提供碳源、氮源和其他必需的营养物质外，这个配方中还含有麦芽浸淀粉，可提供额外的碳源。

三氯化钠提供必需的无机盐。

磷酸二氢钠提供磷酸盐。

醋酸亚铁和硫酸锰提供必需的微量元素。

青霉素用于抑制其他微生物的生长。

以上是乳酸菌培养基的三个常用配方，不同的乳酸菌可能对不同的配方有不同的需求。

为了获得最佳的生长条件，还需要通过试验和调整培养基的成分和配比，以满足特定菌株的需求。

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专利名称：用于冷冻干燥乳酸菌的冷冻保护剂
专利类型：发明专利
发明人：S·科维雷恩,P·德哈瑟,S·奈恩克,L·斯泰德勒申请号：CN201080018717.9
申请日：20100428
公开号：CN102414310A
公开日：
20120411
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种有效的冷冻保护剂组合物的发现和开发，其不包含脱脂乳或任何其他的动物源性化合物，实现了冷冻干燥的乳酸菌(LAB)在不同温度下的长期稳定性，由此冷冻干燥的乳酸菌(LAB)在贮存6个月、优选贮存9个月及更优选贮存12个月后保留的存活力超过50％。

本发明所涉及的领域是生产冻干细菌，特别是乳酸菌。

更具体地，本发明涉及冷冻保护剂的新型组合的用途，其用于增加经冷冻干燥后的细菌的存活力、改善冻干的块的质感以易于研磨，以及改善冷冻干燥的细菌在不同温度条件下的长期稳定性。

本发明还涉及此类冷冻干燥的细菌，其用于食品工业或用于人类或动物的健康应用。

更具体地，本发明涉及重组细菌的提高的存活力和长期贮存能力，所述重组细菌能表达异源蛋白或肽，并以治疗或疫苗接种的目的向人类或动物施用。

申请人：阿克图杰尼斯公司
地址：比利时兹韦纳尔德
国籍：BE
代理机构：中国国际贸易促进委员会专利商标事务所
代理人：罗菊华
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专利名称：一种冻干保护剂及其在制备乳酸菌冻干粉中应用专利类型：发明专利
发明人：李斌,邓紫玙,梁宏闪,李晶,宋蓉
申请号：CN201910615446.8
申请日：20190709
公开号：CN110373351A
公开日：
20191025
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂含有羧甲基茯苓多糖。

本发明还公开了所述的冻干保护剂在制备乳酸菌冻干粉中的应用以及一种乳酸菌冻干粉的制备方法。

使用羧甲基茯苓多糖作为冻干保护剂，与单一使用海藻糖、脱脂乳粉、乳清分离蛋白等常规冻干保护剂相比，乳酸菌的存活率均大幅提高。

因此，羧甲基茯苓多糖是一种新型且高效的乳酸菌冻干保护剂。

申请人：华中农业大学
地址：430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
国籍：CN
代理机构：武汉开元知识产权代理有限公司
代理人：徐绍新
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细菌冻干保护剂配方
1 细菌冻干保护剂作用
细菌冻干保护剂是现代分子生物学实验中常用的一种特殊的抗菌剂。

定期对细菌进行冻干，能让它们处于长期的休眠状态，并保护它
们的蛋白质、核酸、糖类等物质的结构，确保实验过程中细菌的质量
不变。

2 配方介绍
细菌冻干保护剂常见配方主要是由葡萄糖、甘油和盐三大成分组成，其中葡萄糖具有保水性，起到稳定剂的作用；甘油则起到脂质/表
面活性剂，能防止细菌过多结合在一起；盐则可以降低冻干过程中水
份的活性。

而上述3种成分与水的比例应该以十分近似静态条件的动
力学平衡为理想状态，即每种物质的摩尔质量比为100：100：85：15。

3 制备步骤
1. 将细菌悬浮液或血清储存液分别加入200mM的葡萄糖溶液和
75mM的甘油溶液中，以确保细菌在保护剂中的存活率，并保护它们的
功能机制。

2. 将葡萄糖溶液和甘油溶液混合，再加入15mM的盐溶液，搅拌
均匀。

3.细菌冻干保护剂配制好后，将细菌加入其中，用搅拌器搅拌均匀，完全混匀。

4. 将其放置于4℃下进行冷藏至少 24 小时。

冻干后细菌可保存于-80℃下稳定存放。

4 注意事项
细菌冻干保护剂配制时一定要注意，葡萄糖和盐的浓度一定要符合上述比例，以确保细菌的安全稳定性，否则可能对细菌的质量产生影响。

另外，细菌冻干保护剂一旦配制完成，也要注意其存放条件，避免有污染，以保证后期使用时实验数据准确性及鉴定结果的可靠性。