第五章 微生物生长的影响因素

第五章 微生物的生长及影响因素

先介绍如何在实验室或生产实践中使微生物生长，即如何培养微生物；然后介绍微生物生长的规律（包括个体和群体）；以及环境条件对微生物生长的影响；最后讨论控制微生物生长特别是有害微生物生长的方法。

生长：微生物个体重量的增加和体积增大的现象。

繁殖：微生物数量增多的现象。

第一节 微生物生长

一、微生物的培养方法

（一）微生物的纯培养及获得方法

1.纯培养：微生物学将从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代叫作纯培养。

2.获得方法（分离方法）：只有分离到微生物的纯菌种，才能研究和利用微生物，目前常用的分离方法有：

①释倒平板法：按不同的稀释度将待分离的材料进行稀释（10倍稀释法），然后分别倒平板，培养得到单一菌落，挑取，分离，纯化即得。

②平皿划线法：在培养基表面用接种环平行或连续划线，培养可得单菌落，分离纯化得纯培养。

平行 扇形 连续

③单细胞挑取法：用单细胞挑取仪（显微镜挑取器）在显微镜下直接挑取单个细胞（菌体）进行培养，而获得纯培养的方法。

④选择培养基分离法：用只适于一种微生物生长的培养基培养，结果只有一种微生物生长，挑取即得。

⑤涂抹培养皿分离法：平板上滴0.2ml菌悬液，用玻璃刮棒涂抹，培养后挑取菌落，纯化即得。

另外，有煮沸法分离芽孢杆菌；利用致死温度的不同分离噬菌体。

（二）微生物的培养方法

1.好氧培养法： a.实验室：试管斜面，平板。

b.工业：半固体物料（浅盘法，转桶法，厚层培养法）

c.食用菌：袋栽法，床栽法。

2.固体培养法：

a.实验室：摇瓶培养法，试管液体培养法，三角瓶浅层培养法，小型台式发酵罐等。

b.工业：发酵罐（通用型搅拌发酵罐，气泡塔型发酵罐，其他形式的发酵罐）。

3.厌氧培养法：

a.验室：厌氧培养皿，厌氧试管，厌氧罐。

b.工业：液体静置培养法。

二、微生物的同步生长及同步培养方法

1.同步培养法：能使培养物中所有的微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法成为同步培养法。

2.同步生长：培养物中的所有微生物细胞都处于同一生长阶段，并都能同时分裂的生长方式。

3.同步培养方法：

（一）诱导法：

就是采用物理化学因子使微生物细胞进行到某个生长阶段而停下来，然后再去除该因子，以达到诱导微生物细胞同步生长的目的。

如培养大肠杆菌胸腺嘧啶缺陷型菌株，当停止供给胸腺嘧啶时，DNA合成立即停止，但RNA和蛋白质合成速率不受影响，30分钟后加入胸腺嘧啶，DNA合成立即恢复，结果几乎所有细胞在经过35-40分钟的延滞后都进行分裂。

再如鼠伤寒沙门氏菌25℃只生长不分裂，在此温度下培养一定时间后，再放到37℃培养，所有细菌都分裂。

（二）选择法：

由于处于不同生长阶段的细胞体积和重量大小不等，处于同一生长阶段的细胞体积和重量大小相等；故可通过滤膜、密度梯度离心等方法获得同步生长的细胞。 三、细菌的个体生长

刚分裂的细菌较小，原生质会逐渐增加，细胞逐渐增大，细胞膜和细胞壁也必然要进行扩增，长到一定程度后染色体复制，细菌才能分裂。

1.细菌DNA的复制:

细菌的DNA为环状,复制时环状DNA附于间体上,从一个起始点向两个相反方向进行复制,即半保留双向复制,复制完成后两个DNA环随新细胞壁和膜物质的增生而被分开,这样就有一个DNA环形成了两个DNA环.

2.细菌细胞壁的扩增:

细菌由小到大,细胞壁也必然相应地增生,应用荧光抗体技术研究发现:G+菌新生壁从赤道壁带向两边扩充生长. G--菌新生壁分散地插入老细胞壁物质之间.

3.细胞分裂和细胞分裂的控制:

① 细胞分裂: DNA复制后,两个DNA环随着新细胞壁和膜物质的增生而被分开,隔处形成横壁,最后一个DNA进入一个细胞,这样一个细胞就分裂形成了两个细胞.

细胞分裂的控制(DNA复制和细胞分裂的协调): 大肠杆菌的DNA复制和细胞分裂的协调模型

┌起动分裂蛋白合成--------→分裂蛋白合成终止┐

起动物质(Mi)----│ │----细胞分裂

└起动DNA复制→DNA复制终止→终止蛋白合成终止┚

细菌细胞含有起动物质,能同时起动分裂蛋白的合成和DNA的复制,当DNA复制结束后才开始合成终止蛋白,终止蛋白和分裂蛋白的共同作用才能引起细胞分裂.

由于细胞膜是运输物质的通道,营养物质的吸收和代谢物的排出都必须通过细胞膜,所以,从外观上说细胞分裂和细胞膜表面积/细胞体积有关,当体积很大时,其比值一定很小,这时膜不能完成运输物质的功能,所以要进行分裂.

4.(附)真核生物的细胞生长

①霉菌:顶端生长(孢囊假说)

②酵母菌:酵母菌的细胞周期分为4个时期:G1,S,G2,M. 四、测定群体生长的方法

1.测定数量

① 显微镜直接计数法: 用细菌计数器在显微镜下直接计数.是全菌计数法,快速,但结果偏高。

② 平板菌落计数法：将样品作一系列稀释，区一定量的稀释液用涂布或倒平板法在固体培养基上培养，数出菌落数，即可算出活菌数。活菌计数法，时间较长，结果偏低。（因为总有些不能形成菌落，或量三个菌体形成一个菌落）。

浊法：用光电比色计或分光光度计，可以测出菌体的数量（微生物生长引起培养液浑浊）测出的是总菌数，此法简便，迅速，但颜色太深的细菌或菌悬液中有其他物质时不能用此法测定，且不同大小的菌体光密度值不同，所以有误差。

膜过滤计数法：用微孔薄膜（硝化纤维素薄膜）进行过滤的方法，主要用来测定空气和水体从的菌类含量较少的样品，将水活空气过滤，收集滤膜上的细菌进行培养，数菌落数，即可得到含菌量。活菌计数法，结果偏低，需时较长。

2.测定细菌的重量

① 称重法：对菌体浓度高的样品，可通过直接称细菌干重或湿重的方法来判断生长情况，

② 含氮量测定法：一般细菌含氮量为原生质干重的16%，用凯氏微量定氮法测定总含氮量（乘以6.25），即可知道原生质的含量。

③ DNA含量测定法：细菌细胞中DNA含量比较恒定，不易受菌龄和外界条件影响，所以测定DNA含量比较准确，每个细菌平均含8.4×10-14克的DNA.据此可得出细菌数量。

④ 代谢产物测定法：与生长有准量关系的代谢产物，如呼吸中的氧耗量和CO2产生量（瓦氏呼吸计）发酵过程中产酸的量等。

3.（附）丝状真菌生长量的测定：一般用测量菌丝长度和菌丝重量的方法进行。

第二节 微生物的生长规律

一.细菌的生长曲线

将细菌接种在一定体积的新鲜液体培养基中（分批培养），隔一定时间取样，计算细菌数，以细菌数目的对数为纵坐标，以生长时间为横坐标绘制出的一条反映细菌生长规律的曲线称为细菌的生长曲线。

据生长繁殖速率不同，可将生长曲线分为：延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。

下面从概念、特点和应用三个方面给大家介绍。

1.迟缓期（延迟期、停滞期）

① 概念：细菌从接种（到新鲜培养基后）到开始增殖之间的时期。

② 特点：细胞质均匀，代谢活力很强，蛋白质和RNA含量增加，菌体体积显著增大，末期对热、化学物质的抵抗力减低。分裂迟缓，生长速率近于零。（当少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即分裂，要合成一些酶、辅酶或中间代谢产物）。

应用：不利于生产，尽量缩短。可通过增加接种量、采用对数期的菌种、选用繁殖速率快的菌种及尽量保持接种前后培养基成份和培养条件抑制等方法来缩短或消除迟缓期。

2.对数期（指数期）：

概念：迟缓期后菌体数目以几何指数增加（最快）的时期。

特点：细胞分裂速度最快，代时最短，代谢活性最强，原生质总量增加最快，酶活力最高，对环境变化敏感。

3. 代时：细菌分裂一次所需的时间，用G表示。如细菌分裂次数用n表示，设x0、x1是时间为t0、t1时的细菌数，则代时：

4. 应用：此期个体形态、化学组成和生理特性均较一致，代谢旺盛，生长迅速，代谢稳定，所以是研究的良好材料也是接种的最好时期。

3.稳定期（平衡期，恒定期）：

概念：对数期后群体细胞总数不变，趋于稳定的时期。

特点：分裂增加的细菌数与死亡的细菌数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡状态，数量达到最大，分裂速度开始变慢，代时延长，数量不变，代谢产物的积累达到高峰，开始积累贮藏物质，芽孢开始形成。

应用：要获得大量菌体（如生产疫苗，细菌杀虫剂）就要培养到此期收获。如为了得到代谢产物适当延长此期则产物增加（味精、抗生素生产等）。

4.死亡期（衰亡期）：

概念：稳定期后，继续培养，群体数目逐渐减少的时期。

特点：由于生活环境的继续恶化，细菌死亡速率逐渐增加，群体细胞数目急剧下降，细胞内颗粒状物质增多，出现液泡，有的菌体产生畸形，发生自溶，及革兰氏阳性菌染色反应发生变化。

应用：应尽量防止或推迟此期的出现。 为了克服菌体生长慢——快——慢的缺点，可采用连续培养，一方面不断加入新培养基，另一方面又以相同的速度流出培养物（代谢产物，菌体）。

第三节 环境因素对微生物生长的影响

先介绍几个术语：

①抑菌（防腐）：（利用某些理化因子）能够防止或抑制微生物生长，但不能杀死微生物群体的方法。如：盐渍抑菌，腊肉、咸菜（仍有微生物但不繁殖），糖水蜜桔、马蹄、水蜜桃

②消毒：杀灭物体上病原微生物的方法（能够杀死、消除或降低材料或物体上的病原微生物，使之不致引起疾病的方法称为消毒）。如煮沸注射器具，来苏尔浸泡手等。

③杀菌：能够杀死或消除材料或物体上全部微生物的方法。如常规灭菌：15磅/英寸2,20—30分钟。

④化疗：是指利用某些具有选择毒性的化学药物（磺胺类）或抗生素对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，对宿主没有或基本上没有损害。如利用复方新若明治疗上呼吸道感染。

⑤死亡：微生物不可逆地丧失了生长繁殖的能力，叫死亡。

⑥溶菌：微生物死亡不解体的现象。

环境中生活着各种各样的微生物，微生物离不开环境，当环境条件适合时微生物生长旺盛，环境不利则生长缓慢，甚至引起死亡。我们学习本节的目的，就是为了给有益微生物创造好的环境条件，时其大量繁殖，应用不利条件控制或消灭无用甚至有害微生物的生长，达到造福人类的目的。

一、物理因素：

（一）温度：

温度对微生物生长的影响：

温度是影响微生物生长极重要的因素，由于微生物的生长繁殖是极复杂的生物学过程，各种反应需要在一定温度范围内进行，所以温度的变化对微生物生长影响很大，微生物总体看范围很大，—12～100℃之间均有微生物的生长，对某种微生物来说，适于微生物生长的温度范围又很窄。

温度对微生物生长的影响主要表现在：低温抑菌；高温杀菌；适温长菌。

1）生物生长繁殖的温度三基点：