LBM2eHBc+融合基因植物表达载体构建及对番茄的转化研究

番茄农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄LeJA2基因的功能研究目前,杀虫剂和除草剂的大剂量应用对环境造成了很大的破坏,对人类的身体和生活质量也造成了不好的影响。

高等植物在长期的进化过程中形成了复杂而精细的抗性反应机制以抵抗昆虫的侵害。

深入认识植物对昆虫抗性的的分子机理将会为利用植物自身的抗性建立环境友好的控制农业害虫的策略提供理论依据。

目前所鉴定的信号分子主要包括多肽信号分子系统素(Systemin)以及来源于不饱和脂肪酸的植物激素茉莉酸(JA),从分子水平对二者所介导的抗性反应过程进行遗传学解析,鉴定其中的重要组分(功能基因)并对其功能进行深入研究。

本研究优化了番茄遗传转化体系;同时利用反向遗传学原理,构建了LeJA2(Lycopersicon es-culentum jasmonic acid 2)的过量表达载体和RNAi 表达载体,通过农杆菌介导的转基因技术,获得两种类型的转基因苗,通过对两种类型的转基因苗的性状鉴定和PPO活性的测定,对LeJA2的功能进行了初步的预测。

主要研究的结果如下:1.建立了农杆菌介导的番茄遗传转化体系对农杆菌介导的番茄转化LeJA2基因系统进行了优化,研究了农杆菌侵染时间、侵染温度和侵染浓度三个因素对番茄愈伤组织形成的影响,寻求影响基因转化的主要因素,获得了较好的番茄农杆菌侵染体系。

2.获得了转基因番茄植株以子叶为转化受体,使用高效农杆菌介导遗传转化体系将LeJA2基因和LeJA2-RANi基因导入番茄,获得了20株LeJA2过量表达的番茄抗性植株和35株LeJA2基因沉默抗性植株,PCR检测结果表明卡那抗性株均能扩增出1050和517bp的目的条带,证明基因已经整合到番茄基因组中。

3.功能验证对转基因番茄植株PPO活性进行了初步检测。

通过PPO活性测定结果得出:植株机械损伤处理前,过量表达LeJA2基因的转基因植株PPO染色后呈现深褐色,而对照和转LeJA2-RNAi基因植株PPO染色后仍然呈现正常的汁液的绿色。

番茄SlGAMYBL2基因启动子的克隆及表达载体的构建李姗姗;赖馥茜;蓝春莲;王小敏;莫昭展【摘要】采用5'端系列缺失分析法,利用PCR方法对SlGAMYBL2基因上游序列进行特异性扩增,分别克隆1368bp、1127bp、990bp和730bp的启动子片段并构建到pLPlp100载体,经鉴定,构建了4个含SlGAMYBL2启动子不同区段融合GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌转化烟草愈伤组织,转化植株经PCR和GUS染色法鉴定,表明构建的表达载体已经转化进烟草植株,为确定SlGAMYBL2基因上游片段中的顺式作用元件响应非生物胁迫诱导中的作用机理以及后期研究该启动子的组织特异性及诱导表达模式奠定基础.【期刊名称】《玉林师范学院学报》【年(卷),期】2017(038)002【总页数】5页(P70-74)【关键词】番茄;启动子;载体构建;顺式作用元件【作者】李姗姗;赖馥茜;蓝春莲;王小敏;莫昭展【作者单位】广西大学林学院,广西南宁 530004;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000【正文语种】中文【中图分类】Q945.78番茄营养丰富，风味香郁，适应性广，产量高，生长期短，在世界各地被广泛种植，番茄的遗传转化一直受到各国科研工作者的关注，从1986年Mc-Cormick[1]等人首次报道获得番茄转基因完整植株以来，番茄遗传转化得到了不断发展.非生物胁迫是制约作物生长并导致农业减产的一个重要因素，利用基因工程技术提高作物的抗非生物胁迫性已成为植物分子生物学领域的一项重要研究课题.植物为了生存，在遭遇非生物胁迫时，必须通过形态及生理生化代谢等方面的调整，以适应环境的胁迫. 近年来的研究表明，许多植物基因的表达，都受逆境胁迫的诱导，抗逆基因的表达又是依靠其上游启动子的调控来实现的[2].启动子是起始基因转录的一段DNA序列，是基因表达调控的关键点，也是生物学上的一个研究热点.Mariani 等将烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29和核酸酶Barnase、Rnase T1 基因融合后转化到植物中，核酸酶基因在花药中特异性表达，破坏绒毛层，获得雄性不育的烟草和油菜[3，4]，该技术创造的不育系至今已经在烟草[5]、油菜[6]、水稻[7]、拟南芥[8]等植物中取得成功.与非生物胁迫相关的启动子为诱导型启动子，而目前研究最广的非生物胁迫的条件是干旱.低温和盐碱等.如拟南芥rd29A基因启动子[9]可被脱水诱导，苋属植物的CMO基因[10]、辽宁碱蓬BADH基因启动子[11]及盐芥的TsVPI基因启动子[12]等作为盐诱导启动子.而大豆的GmDREB3启动子[13]有低温响应序列.在前期研究中，我们克隆了番茄GAMYB基因SlGAMYBL2并获得了该基因在外源激素和非生物胁迫中的表达调控特征.本研究旨在SlGAMYBL2启动子的分离，找到影响SlGAMYBL2启动子功能发挥的基因片段，并构建含有该目的片段的重组截短载体.分析启动子的组织特异性及在胁迫中的诱导模式，阐明启动子诱导与基因表达的关系，为今后研究逆境诱导启动子提高植物的抗逆性提供材料和奠定基础.1.1 材料RNA提取试剂盒、快速凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；pEasy-Blunt载体、 TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶，限制性内切酶Kpn I、Xho I购自 TakaRa公司；Easy Pfu聚合酶、PCR Mix、大肠杆菌，pEasy-Blant载体购自北京生物全式金生物公司E. Coli DH5a为本室保存菌种；目的片段测序由南京金斯瑞测序完成.1.2 方法1.2.1 引物的设计根据GenBank序列，利用软件 PrimerPremier5.0设计4对不同的引物，为了方便后续载体的构建，在上下游引物5'端分别引入XbaⅠ和KpnⅠ限制性内切酶的识别序列.每对引物的下游引物均为：R: 5'GGGGTACCGAGTAATAAGGCATCACATCCAAGA3'，（下划线为Kpn I酶切位点）.4条上游引物分别为：F1：5'GCTCTAGATGAGGCATTTTCACGCAATAGAC3'，F2：5'GC TCTAGATGGGGAGAATCCGAAAGCACG3'，F3：5'GCTCTAGAGGTGCACGAGGTTCCCTTATGT3'，F4：5'GCTCTAGACTTGAATCCTCTGCTCGCCGT3'（下划线为Xba I酶切位点）.由上海生工生物有限公司合成.启动子序列顺式作用元件分析采用PlantCARE分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）.1.2.2 番茄DNA的提取与PCR扩增将番茄成熟种子用70%的酒精消毒30S，用无菌水洗涤3次，再3%次氯酸钠消毒5min，用无菌水洗涤3次，放置于MS培养基上发芽，培养温度为25℃.取适量的番茄幼苗，按照北京康为世纪生物技术有限公司的通用型柱式基因组提取试剂盒的说明书对番茄进行DNA的提取.以DNA为模板进行PCR扩增，反应的体系为：F引物（5μM）4μL，R引物（5μM）4μL，Buffer 5μL，dNTP 5μL，DNA聚合酶1μL，DNA 2μL；反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 4min，扩增30个循环，最后72℃充分延伸10min.1.2.3 PCR产物凝胶电泳及目的片段的回收PCR产物，用1%的琼脂糖电泳鉴定后，按照北京康为世纪生物技术有限公司的胶回收试剂盒回收说明书进行PCR扩增产物的回收.1.2.4 中间载体pEasy-SlGAMYBL2QF1的构建PCR回收产物作为目的基因与pEasy-Blunt载体连接，连接体系：PCR产物2μL；pEasy-Blunt cloing Vector 1μL，室温反应5min后将离心管置于冰上.连接产物转化大肠杆菌E.Coli Trans-T1感受态细胞中，涂板在含卡那霉素的平板进行选择培养，挑选白色饱满的单菌落，于LB液体培养基过夜培养后按照北京康为世纪生物技术有限公司的质粒提取试剂盒说明书进行小质粒的提取，经酶切验证和南京金斯瑞测序验证，命名为pEasy-SlGAMYBL2QF1.1.2.5 截短基因的PCR扩增与回收以中间载体为模板，进行截短基因的PCR扩增.反应的体系为：F引物（5μM）4μL，R引物（5μM）4μL，Buffer 5μL，dNTP 5μL，DNA聚合酶1μL，DNA2μL；反应条件为：94℃变性5min；94℃ 30s，55℃30s，72℃ 4min，扩增30个循环；最后72℃充分延伸10min.PCR产物，用1%的琼脂糖电泳鉴定后，按照北京康为世纪生物技术有限公司的胶回收试剂盒回收说明书进行PCR扩增产物的回收.1.2.6 表达载体的构建将四条不同长度的目的基因与pLP100质粒用XbaⅠ和KpnⅠ分别进行酶切，电泳，然后回收目的片段及pLP100载体片段.按照pLP100载体片段4μL，目标片段DNA 4μL，Buffer 1μL，T4DNA Ligase 1μL的连接体系4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.Coli Trans-T1感受态细胞中，涂板选择培养，挑选白色饱满的单菌落，LB液体培养基培养后按照北京康为世纪生物技术有限公司的质粒提取试剂盒说明书进行质粒的提取，进行酶切鉴定出含目的片段的阳性克隆，分别命名为pLP-SlGAMYBL2QF1、pLPSlGAMYBL2QF2、pLP-SlGAMYBL2QF3、pLP-SlGAMYBL2QF4.1.2.7 转基因植株的获得及GUS组织染色获得的表达载体经冻融法转化农杆菌菌株C58，按照Wang[14]等方法进行转化，转化植株利用GUS组织染色法进行染色鉴定.2.1 启动子顺式作用元件分析通过PlantCARE程序分析了该序列的一些顺式作用元件.在这些顺式作用元件中，有2个作用预测的响应水杨酸胁迫的TCA-elements（cis-acting element in volved in salicylic acid responsiveness）顺式作用元件，分别定位在-500/-509和-1956/-1965位置；有一个预测的响应干旱胁迫的MBS（MYB binding site in volved in drought-inducibility）顺式作用元件定位在-601/-606位置（图1）.说明SlGAMYBL2启动子有可能响应非生物胁迫.2.2 SlGAMYBL2启动子目的基因的扩增以番茄DNA为模板，进行PCR扩增，所产生的条带与预期的：L2QF1:1368bp；L2QF2:1127bp；L2QF3:990bp；L2QF4:730bp目的基因片段大小接近（图2），表明我们设计的引物是合理的，扩增所得条带经上海生工测序验证后，对其进行回收，用于后面的实验.2.3 表达载体的酶切验证与分析以我们实验室保存的pLP100质粒为载体，以截短型L2QF1、L2QF2、L2QF3、L2QF4的PCR扩增产物为目标片段，以经过XbaⅠ和KpnⅠ酶切回收后进行连接转化，涂板培养后挑选单菌落于LB液体培养基培养，提取质粒用酶切验证目的片段是否已经构建到该载体上，结果如图3所示，酶切出来的片段的大小：L2QF1:1368bp；L2QF2:1127bp；L2QF3:990bp；L2QF4:730bp与预期的完全相同，表明pLP-SlGAMYBL2QF1、pLP-SlGAMYBL2QF2、pLP-SlGAMYBL2QF3、pLP-SlGAMYBL2QF4表达载体构建成功.2.4 转基因烟草植株的获得及GUS活性检测将4个缺失片段重组质粒分别导入农杆菌C58中，通过叶盘转化法转化烟草叶片，经抗性筛选，并对所获得的转基因烟草植株叶片进行GUS活性检测.结果显示，转化的4启动子片段均能驱动GUS基因表达，烟草叶片组织染色呈现蓝色（图4）. 我们利用Prime5.0设计了特异性的引物，构建SlGAMYBL2 5'端系列缺片段经回收、纯化、酶切回收后，分别连接到pLP100载体上，最后成功构建了pLP-SlGAMYBL2QF1、pLP-SlGAMYBL2QF2、pLPSlGAMYBL2QF3、pLP-SlGAMYBL2QF4 4个驱动GUS基因表达的载体，并转化烟草植株获得了转基因植株并检测到GUS表达，说明即使是730bp的片段也含有了启动子所必须的基本原件，尽管在检测的转基因植株中都有GUS基因表达，然而，对于启动子上的顺式作用元件的作用仍需通过对GUS活性的定量检测才能进一步的确定.本实验结果为下一步确定SlGAMYBL2启动子的组织诱导模式和非生物胁迫响应模式奠定基础.【相关文献】[1]McCormick S, Niedermeyer J, Fry J, et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. [J]. Plant Cell Rep, 1986, (5):81-84. [2]郑晓瑜，郭晋艳，张毅，李秋莉，植物非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件的研究方法[J].植物生理学报2011，47(2)：129-135.[3]Mariani C, De Beuckeleer M, Truettner J, et al. Induction of male-sterility in plants by a chimeric ribonuclease gene [J].Nature, 1990, 347: 737-741.[4]Mariani C, Cossele V, De Beuckeleer M, et al. A chimaeric ribonuclease-inhibitor gene restores fertility to male-sterile plant[J]. Nature, 1992, 357-384.[5]李胜国，刘玉乐，朱峰，等。

番茄果实SPS反义表达载体的构建及遗传转化的研究的开题报告一、选题背景番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，其果实具有丰富的营养价值和经济价值。

番茄果实的成熟过程受到乙烯的调控，其中SPS（soluble acid invertase）是乙烯生物合成途径中的一个关键酶。

SPS反义基因（SPS-AS）可以抑制SPS的表达，从而影响番茄果实的成熟过程。

因此，构建SPS-AS反义表达载体并进行遗传转化，对于研究番茄果实成熟的分子机制具有重要意义。

二、研究目的本研究旨在构建SPS-AS反义表达载体，并利用农杆菌介导法将其转化到番茄中，观察其对番茄果实成熟的影响，探究SPS在乙烯途径中的作用及其对番茄果实成熟的调控机制。

三、研究内容本研究将从以下几个方面进行探究：1.利用基因克隆技术构建SPS-AS反义表达载体。

2.利用农杆菌介导法将SPS-AS反义表达载体转化到番茄中。

3.观察转基因番茄的形态特征、生长状况和果实成熟过程。

4.通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测转基因番茄中SPS基因的表达量，分析SPS在乙烯途径中的作用及其对番茄果实成熟的调控机制。

四、研究意义本研究将有助于深入理解SPS在乙烯途径中的作用及其对番茄果实成熟的调控机制，为番茄果实的优化栽培和生产提供理论基础和技术支持。

此外，本研究可为其他作物的生长发育及品质改良提供借鉴。

五、研究方法本研究主要采用基因克隆技术构建SPS-AS反义表达载体，利用农杆菌介导法将其转化到番茄中，观察转基因番茄的形态特征、生长状况和果实成熟过程，并通过qRT-PCR检测SPS基因的表达量，分析其在乙烯途径中的作用及其对番茄果实成熟的调控机制。

六、研究进度安排本研究的时间进度安排如下：第一年：完成SPS-AS反义表达载体的构建及鉴定。

第二年：完成SPS-AS反义表达载体在番茄中的遗传转化，观察转基因番茄的形态特征、生长状况和果实成熟过程。

第三年：通过qRT-PCR检测转基因番茄中SPS基因的表达量，分析其在乙烯途径中的作用及其对番茄果实成熟的调控机制。

番茄叶片胞壁转化酶cDNA克隆及反义沉默表达分析吴正景;程智慧;孟焕文【摘要】Total RNA was isolated from tomato (cv. 'Zhongshu No. 4') leaves using the specific primers designed according to the sequence of cell wall invertase gene in GenBank. A fragment about 416bp was amplified by reverse transcription and polymerase chain reaction. Sequence analysis showed the amplified fragment was the LIN6 cDNA fragment of the cell wall invertase gene. The fragment was inserted into plant expression vector pBinAR between CaMV 35S promoter and OCS terminator to form an antisense plant expression vector pBinAR-aLIN6. Five transgenic tomato plants (cv. MicroTom) , identified by PCR and Southern hybrids detection, were obtained through transferring of EHA105/pBinAR-aLIN6. The activity of cell-wall invertase in the leaves of those five antisense plants was found decreasing by 67. 9%, 13. 4%, 73. 5%,85. 6% and 58. 0% ,respectively.%参考GenBank登录的植物胞壁转化酶基因序列,设计1对PCR引物,以番茄(‘中蔬四号’)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为416 bp的cDNA片段,Blast 结果表明,其为番茄胞壁转化酶基因LIN6片段；将其反向插入双元载体pBinAR的CaMV 35S启动子和OCS终止子间,构建反义植物表达载体pBinAR-aLIN6.通过农杆菌EHA105介导转化番茄MicroTom,PCR和Southern斑点杂交检测表明,共获得5株转基因番茄；生化检测表明,5个转化植株叶片胞壁转化酶活性分别比未转化植株下降67.9％、13.4％、73.5％、85.6％和58.0％.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】5页(P241-245)【关键词】番茄;胞壁转化酶;RT-PCR;反义沉默【作者】吴正景;程智慧;孟焕文【作者单位】西北农林科技大学园艺学院,陕西杨陵712100;河南科技大学林学院,河南洛阳451003;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨陵712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨陵712100【正文语种】中文【中图分类】Q786当植物遭受胁迫，例如受伤或病菌侵染，有许多基因参与的一系列防御反应受到诱导。

应用与环境生物学报 2009，15 ( 5 ): 591~595Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2009-10-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00591番茄是一种重要的蔬菜作物，成熟番茄果实主要积累β-胡萝卜素和番茄红素等类胡萝卜素. 在人类所需营养中，类胡萝卜素扮演着重要的角色. β-胡萝卜素是维生素A 的前体[1]，维生素A 的缺乏会导致发生夜盲症，并使皮肤变厚、干燥. 同时，番茄红素和β-胡萝卜素都具有很强的抗氧化活性，不仅可以清除体内的自由基，延缓衰老，而且可以增强机体免疫力[2]. 流行病学、药理实验表明，类胡萝卜素不仅可降低诸多慢性疾病（如冠心病等）的风险率，还具有防癌抗癌的功能[3]. 因此，类胡萝卜素在医药工业、食品、化妆品及饲料业等都有着广泛的用途. 番茄既是人类摄取天然类胡萝卜素最重要的来源，也是类胡萝卜素天然萃取的主要原料，番茄中色素的含量水平是制约其果实营养价值和产业效益的最重要因素. 随着转基因技术的推广，研究人员对番茄类胡萝卜素合成途径中结构基因的遗传操作进行了广泛的尝试[4~6]，但其局限性在于加强或阻断某一关键基因的表达会引起许多负面效应，目标产物的积累也达不到预期的效果.番茄中存在一类单基因的高色素突变体High pigment-1（hp1）和 High pigment-2（hp2），它们分别在1917年和1975年被发现[7]. 在光下生长的hp 突变体与野生型相比，积累更多的花青素，植株矮小，由于过量的叶绿素导致绿色果实呈深绿色[7]. 随后的研究证明，番茄HP1、HP2是色素积累的负调控因子，对HP1或HP2进行RNA 干涉后，转基因番茄果实色素的含量明显升高[8, 9].目前，利用果实特异RNA 干涉技术，将HP1和HP2两个基因同时导入番茄以提高果实色素含量的研究还未见报道. 本实验首先将HP1和HP2两个基因片段连在一起，并构建了番茄HP1和HP2基因RNA 共干涉载体的构建及遗传转化*刘继恺 高永峰 牛向丽 刘永胜**（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 成都 610064）Construction and Transformation of Co-RNAi Vector of TomatoHP1 and HP2 Genes*LIU Jikai, GAO Yongfeng, NIU Xiangli & LIU Yongsheng **(Key Laboratory of Ministry of Education for Bio-resource and Eco-environment, College of Life Sciences, Sichuan University , Chengdu 610064, China)Abstract Tomato HP1 and HP2 genes are negative regulators of pigment accumulation, and they play an important role in photomorphogenesis and pigmentation regulation. In this study, a RNA interference (RNAi) vector composing of inversely-repeated sequence fragments derived from both tomato HP1 and HP2 was constructed. The CaMV 35S promoter in pBI121 was replaced by fruit-specific promoter TFM7. The construct was introduced into tomato Lysopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig by means of Agrobacterium -mediated transformation. The analysis of semi-quantitative RT-PCR revealed a distinct reduction of endogenous HP1 and HP2 expression levels in the RNAi transgenic lines compared to that of wild plants. The chlorophyll content in green fruit of the RNAi repression lines was signi fi cantly elevated, whereas the chlorophyll in their leaves remained unaltered compared with that of wild plants. The results show a new way to modify fruit nutritional quality in tomato through gene engineering. Fig 6, Tab 2, Ref 15Keywords HP1; HP2; RNA interference; fruit-specific promoter; Agrobacterium-mediated transformation; chlorophyll;tomatoCLC Q78 : S641.203.3摘 要 番茄HP1和HP2是色素积累的负调控因子，在光形态建成和色素积累调控中起着重要作用. 将番茄HP1、HP2基因片段导入到植物表达载体pBI121，用番茄果实特异表达的TMF7基因的启动子替换原有的CaMV 35S 启动子，构建果实特异表达HP1、HP2双基因RNA 共干涉植物表达载体pBI121-TMF7-HP1HP2. 通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶，经组织培养成功获得转基因植株. 半定量RT-PCR 分析显示，转基因植株果实内HP1、HP2的表达量均明显低于野生型植株果实. 转基因植株果实叶绿素含量比野生型明显升高，而叶片中的叶绿素含量无明显差异. 该研究结果为采用基因工程的方法改善番茄果实营养品质作出了新的尝试和提出了新的思路. 图6 表2 参15关键词 HP1；HP2；RNA 干涉；果实特异启动子；农杆菌介导转化；叶绿素；番茄CLC Q78 : S641.203.3收稿日期：2008-11-13 接受日期：2009-03-04*国家自然科学基金项目（N o. 90717110），国家高技术研究发展计划（“863”计划，N o. 2007A A 10Z122）和国家杰出青年基金（No. 30825030）资助 S u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l Nat u r al Science Foundation of China (No. 90717110), t h e National High-tech Research and Development Program of China (“863” Program No. 2007AA10Z122), a n d t h e National Science Fund of China for Dis-tinguished Young Scholars (No. 30825030)**通讯作者 Corresponding author (E-mail: liuyongsheng1122@)59215 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 果实特异表达的RNA 干涉载体，以有效避免组成型RNA 干涉的负面影响，将构建好的载体导入番茄，得到了转基因植株. 半定量RT-PCR 分析显示，转基因植株果实内HP1、HP2的表达量明显低于野生型植株果实. 与野生型比较，转基因植株的未成熟果实积累的叶绿素含量明显升高，而叶子中的叶绿素含量没有变化. 本研究为采用基因工程的方法改善番茄果实营养品质奠定了基础.1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 番茄材料 野生番茄（Lysopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig ），来自美国康乃尔大学THOMPSON 植物研究所.1.1.2 菌株、质粒和试剂 大肠杆菌（Escheriachia coli ）DH5α、根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）EHA105、果实特异植物表达载体pBI121-TFM7、pSK vector 均由本实验室保存. 限制性内切酶、Taq 酶、反转录酶、T4DNA 连接酶、pMD18-T vector 购自TaKaRa 公司，TRIZOL 购自Invitrogen 公司，反转录试剂盒购自TOYOBO 公司. 琼脂糖凝胶回收试剂盒及小批量质粒提取试剂盒购自Omega 公司. 引物由上海英骏生物技术有限公司合成. 测序由北京华大基因科技股份有限公司完成.1.2 方 法1.2.1 HP1、HP2片段扩增及HP1HP2RNAi 载体构建 按照番茄H P1基因（G e n B a n k 登录号：AY531660）序列设计引物HP1F ：5’ TCACATTCGTTCAATACCCCT 3’，H P1R ：5’ GTGTCCACAT TCTGTCTG CA A 3’，按照番茄H P2基因（G e n B a n k 登录号：A J 222798）序列设计含有P s t I 和H i n d Ⅲ酶切位点的特异引物，H P 2F ：5’ CTGCAGAATGTTACCGCCAGGCTTTTT 3’，HP2R ：5’AAGCTTCAAGAAAGCACCAATGCTATG 3’. 提取野生番茄叶片总RNA ，通过RT-PCR 分别扩增HP1，HP2基因片段. PCR 反应条件：94 ℃ 5 min ，94 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s ，72 ℃ 40 s ， 30个循环，72 ℃ 10 min. PCR 产物连接于pMD18-T ，对重组克隆进行快提和PCR 鉴定.用Pst I 和Hin d Ⅲ 双酶切连接有HP2片段的重组质粒，将酶切片段插入连有HP1片段的重组pMD18-T 载体上，对重组克隆进行鉴定后测序. 测序结果用DNAMAN （版本5.2.2） 软件进行分析，形成HP1HP2融合序列（1 052 bp ，其中HP1，486 bp ；HP2，566 bp ）.根据形成的HP1HP2融合序列，设计带酶切位点的特异引物（表1），以测序后的HP1HP2重组质粒为模板，PCR 扩增得到用于构建RNAi 载体的正、反向片段. PCR 片段经过胶回收分别正、反向插入双元载体pSK ，然后将HP1HP2正反向片段整体酶切，插入果实特异植物表达载体pBI121-TFM7的T-DNA 序列中（图1）.1.2.2 番茄的遗传转化 构建好的植物表达载体pBI121-TFM7-HP1HP2转入农杆菌中备用.用10%次氯酸钠浸泡番茄种子10 min ，再用无菌水清洗4~5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后于1/2MS 培养基上培养，25 ℃，暗培养4 d 左右，露白后转置于光照下（光照1 500 lx ，16 h/d ）培养. 在其第一片真叶长出前取下子叶，置于预培养基上培养2 d. 转化法采用叶盘法. 将带有目的基因的农杆菌置于28 ℃的震荡培养箱中过夜培养，取5 mL 菌液置于离心管中，5 000 r/min 室温下离心5 min ，然后去除上清液. 用诱导培养基稀释离心后的农杆菌至D =0.1，将预培养2 d 的子叶浸入稀释后的农杆菌10~15 min ，倒掉菌液，将子叶置于无菌滤纸上，吸干多余菌液后，转到共培养基上培养3 d. 然后转入再生培养基上继代筛选培养，每3周换一次培养基，待不定芽长到3 cm 左右时，切下转移至生根培养基上生根. 等根发表1 用于扩增HP1HP2正、反向片段的寡核苷酸引物Table 1 Sequence of oligonucleotide primers used for ampli fi cation of HP1HP2 fragments引物名称Primer name 引物序列Primer sequence酶切位点Restriction site 扩增片段及在HP1HP2序列的跨度Ampli fi cation fragmentsHP1ZX-F GTCCTCGAGTCTAGAAAGAGCAGACCCGGA Xho I, Xba I 正向片段Forward fragment 900 bp (50~950) HP2ZX-R GAAAAGCTTTTTTTCAACTGAAGGGACTCC Hin d III HP1FX-F TCAGAGCTCAAGAGCAGACCCGGACAT Sac I 反向片段Reverse fragment 900 bp (50~950)HP2FX-RGAAGAATTCTTTTTCAACTGAAGGGACTCCEco R I下划线部分为酶切位点 The underlined indicate the sites of restriction enzymes图1 植物表达载体pBI121-TFM7-HP1HP2构建图Fig. 1 Schematic construction of vector of pBI121-TFM7-HP1HP25935 期刘继恺等：番茄HP1和HP2基因RNA 共干涉载体的构建及遗传转化育好后，移出，温室盆栽.（1）预培养基：MS + 1 mg/L 6BA + 0.04 mg/L IAA. （2）诱导培养基（100 mL ）：5 mL AB 盐 + 2 mL MES 缓冲剂 + 2 mL 磷酸钠盐缓冲剂 + 91 mL 1%葡萄糖. （3）共培养基：MS + 0.2 mg/L KH 2PO 4 + 0.1 mg/L Kinetin + 0.2 mg/L 2，4-D + 15 mg/L 乙酰丁香酮. （4）再生培养基：MS + 500 mg/L 羧卞青霉素钠 + 50 mg/L 硫酸卡那霉素 + 2 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IAA. （5）生根培养基：MS + 500 mg/L 羧卞青霉素钠 + 2 mg/L IAA. 以上各培养基的pH 值均为6.0.1.2.3 阳性植株鉴定 用C TA B 法[10]从转基因植株中提取基因组D N A. 以提取的基因组D N A 为模板，根据p B I121载体筛选标记基因新霉素磷酸转移酶Ⅱ（N P T Ⅱ，Gen Ba n k 登录号：A F485783）序列，设计引物N PT Ⅱ-F: 5’ TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC 3’, NPT Ⅱ-R: 5’ GTCACCGACTTGAGCCATTTG 3’，对NPT Ⅱ基因片段进行扩增. 反应条件为94 ℃ 5 min ，94 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s ，72℃ 40 s ，30个循环，72 ℃ 5 min.参照王芋华等鉴定转基因植株的方法[11]，根据形成的HP1HP2序列，用扩增HP1HP2正向片段的引物HP1ZX-F 和HP2ZX-R 对HP1HP2正向片段进行扩增. 反应条件为94 ℃ 5 min ，94 ℃ 30 s ，58 ℃ 30 s ，72℃ 1 min ，30个循环，72 ℃ 5 min.1.2.4 半定量RT-PCR 分析 提取野生型和转基因植株绿色果实的总RNA ，反转录合成第一条cDNA. 以番茄UBI3（Gen Ba n k 登录号：X58253）为内参基因，其PCR 扩增引物为UBI3-F ：5’ AGAAGAAGACCTACACCAAGCC 3’, UBI3-R ：5’ TCCCAAGGGTTGTCACATACATC 3’；HP1基因引物HP1F ：5’ TCACATTCGTTCAATACCCCT 3’， HP1R ：5’ GTGTCCACATTCTGTCTGCAA 3’；按照番茄HP2基因（GenBank 登录号：AJ222798）序列设计引物HP2BDL-F ：5’ AGTTTTTGGACCGACATCACCT 3’， HP2BDL-R ：5’ CTTCTTAGTTCGCCCATCTGTG 3’. PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，从而分析HP1、HP2在野生型和转基因植株果实中的表达情况.1.2.5 叶绿素含量的测定 取田间栽培野生型和转基因番茄植株绿色果实的果皮和植株叶片0.2~0.5 g ，加入液氮后充分研磨，用1 mL 80%的丙酮充分萃取，萃取液离心后用分光光度计检测，读取645 nm 和663 nm 下的光吸收值A 645 nm 和A 663 nm . 按照MacKinney 常数计算出叶绿素a 和b 的含量：Chlorophyll a = 12.7A 663 nm －2.69A 645 nm 和chlorophyll b =22.9A 645 nm －4.48A 663 nm ，采用数据学软件SPSS12进行统计学分析.2 结果与分析2.1 pBI121-TFM7-HP1HP2RNAi 重组质粒的鉴定由图1所示进行酶切鉴定，用Xho I 和Pst I 双酶切pMD18-T-HP1HP2（图2 泳道2），能够得到HP1的436 bp 的片段. 用Xho I 和Hin d III 双酶切鉴定pMD18-T-HP1HP2（图2泳道4），能够得到HP1+HP2的900 bp 的片段. 用Xba I 和Sac I 双酶切连有正反向片段的pSK-HP1HP2 RNAi （图2泳道8），将酶切下的需要克隆的正反向片段（2 000 bp 左右）插入表达载体pBI121-TFM7，通过Xba I 和Sac I 双酶切鉴定pBI121-TFM7-HP1HP2RNAi ，能够得到2 000左右的片段，证明正反向片段已经连入表达载体（图2 泳道10）.2.2 转基因植株鉴定组织培养后，获得转基因植株. 提取获得的抗性植株的总DNA ，利用植物表达质粒pBI121携带的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTII ）基因引物验证阳性植株，预期扩增长度应为857 bp. 结果表明，对照植株未能扩增出857 bp 的条带，而抗性植株扩增出857 bp 的条带，说明NPTII 基因已整合于受体植株核染色体组中（图3）.再以引物HP1ZX-F 和HP2ZX-R 扩增，预期扩增长度应为图2 pBI121-TFM7-HP1HP2RNAi 载体酶切鉴定图Fig. 2 Restriction analysis of pBI121-TFM7-HP1HP2RNAiM ：DL2000；1：未酶切pMD18-T-HP1HP2；2：X ho I + Pst I 双酶切pMD18-T- HP1HP2；3：Pst I + Hin d III 双酶切pMD18-T- HP1HP2；4：Xho I + Hin d III 双酶切pMD18-T- HP1HP2；5：未酶切pSK- HP1HP2 RNAi ；6：Xho I + Hin d III 双酶切pSK- HP1HP2 RNAi ；7：Eco R I + Sac I 双酶切pSK- HP1HP2 RNAi ；8：Xba I + Sac I 双酶切pSK- HP1HP2 RNAi ；9：未酶切pBI121-TFM7- HP1HP2RNAi ；10：Xba I + Sac I 双酶切pBI121-TFM7- HP1HP2RNAiM: DL2000; 1: Non-digestive pMD18-T-HP1HP2; 2: pMD18-T-HP1HP2 digested by Xho I + Pst I; 3: pMD18-T- HP1HP2 digested by Pst I + Hin d III; 4: pMD18-T-HP1HP2 digested by Xho I + Hin d III; 5: Non-digestive pSK- HP1HP2 RNAi; 6: pSK-HP1HP2RNAi digested by Xho I + Hin d III; 7: pSK- HP1HP2 RNAi digested by EcoR I + Sac I; 8: pSK-HP1HP2 RNAi digested by Xba I + Sac I; 9: Non-digestive pBI121-TFM7- HP1HP2RNAi; 10: pBI121-TFM7-HP1HP2RNAi digested by Xba I + Sac I图3 NPTII 基因PCR 检测Fig. 3 PCR analysis for NPTII geneM ：DL2000；P ：pBI121质粒作为阳性对照；C ：未转化植株作为阴性对照；1~3：转基因植株. 下同M: DL2000; P: pBI121 as positive control; C: Non-transgenic plant as negative control; 1~3: Transgenic plants. The same below59415 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 900 bp ，如图4所示，对照植株未能扩增出900 bp 的条带，而抗性植株扩增出900 bp 的条带，说明HP1HP2基因的RNA 干涉片段已整合于受体植株核染色体组中，可以初步确定这些抗性植株为转基因植株.2.3 半定量RT-PCR 分析HP1、HP2的表达情况利用半定量RT-PCR 的方法，分析转基因植株果实中被干涉基因的表达水平. 提取野生型和3株独立的转基因番茄的绿色果实中的RNA ，以此为模板进行半定量RT-PCR 分析. 结果如图5所示，转基因植株果实中HP1、HP2基因的表达水平均显著下降. 说明转入pBI121-TMF7-HP1HP2共干涉植物表达载体后，番茄果实中HP1、HP2基因起到了共干涉的效果.2.4 叶绿素含量的测定孟凡娟等对番茄果实色素含量和表面颜色相关性进行了研究，结果显示，番茄果实内总叶绿素、叶绿素a 、叶绿素b 、类胡萝卜素与果实表面颜色呈正相关[12]. 采用分光光度计法测定叶绿素含量，测定方法简单易行，所以本实验对野生型和转基因植株的绿色果实进行了叶绿素测定.由图6可见，HP1HP2RNAi 转基因植株果实的颜色比野生型植株果实的要深. 利用1.2.5介绍的方法，分析了野生型和转基因植株的绿色果实的叶绿素含量，每个植株取样数N =10. 从表2可见，HP1HP2基因共干涉可以提高果实的叶绿素的含量近一倍. 对野生型和转基因植株的叶片进行叶绿素含量的测定，每个植株取样数N =10. 从表2可见，与野生型植株叶片相比，果实特异表达转基因植株叶片中叶绿素含量并无明显改变.3 结论与讨论RNA 干涉是一种双链RNA 诱导的转录后基因沉默现象，存在于多种生物体内. 由于RNAi 的高度特异性和高效性，RNA 干涉作为基因功能研究的新方法被广泛应用于动植物研究的各个领域[13]. 通常，单个基因的RNA 干涉载体是由一个植物启动子和终止子以及两者之间插入的目的基因的正反向重复序列组成的. 本研究将HP1+HP2两个基因的片段（900 bp ，其中HP1 436 bp HP2 464 bp ）分别正向、反向插入一个包含内含子的克隆载体pSK [14]，并进一步构建植物表达载体（图1），由此表达出的RNA 分子会形成具有双链RNA 的发卡结构，双链RNA 被DICER 酶识别切割成siRNA ，作为RNA 干涉的启动信号. 本研究分别对转基因植株中的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTII ）基因以及HP1HP2基因的RNA 干涉片段进行PCR 扩增，都能够扩增出预期大小的条带，初步确定这些抗性植株为转基因植株. 通过半定量RT-PCR 分析HP1和HP2基因的表达水平，结果显示，与野生型相比，转基因植株果实中HP1、HP2基因的表达水平均显著下降，达到了RNA 共干涉的效果.由于HP1和HP2在植株生长发育过程中起着很重要的作用，所以组成型干涉番茄HP1或HP2基因时，植株发育将会受到影响[8, 9]. 利用果实特异型启动子结合RNA 干涉的方法，能避免由于目标基因表达量降低而对植株正常生长发育所造成的不良影响，从而能特异地对果实进行基因工程操作. 本实验将植物表达载体pBI121原有的CaMV 35S 启动子替换为番茄果实特异表达TMF7启动子[15]，构建HP1HP2双基因RNA 干涉植物表达载体（pBI121-TMF7-HP1HP2）. 在果实特异启动子TMF7的驱动下，转基因番茄植株与野生型相比，植株发育良好，其绿色果实的叶绿素含量明显升高，而叶片中的叶绿素含量无明显差异. 因此，本实验番茄HP1和HP2 基因果实特异RNA 共干涉载体的构建以及转基因番茄的获得，为改善番茄果实营养品质作出了新的尝试和提出了新的思路.References1Liu YS, Roof S, Ye ZB, Barry C, Tuinen AV, Vrebalov J, Bowler C, Giovannoni J. Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato. Proc Natl Acad Sci USA ,2004, 101: 9897~99022Hwang ES, Bowen PE. Can the consumption of tomatoes or lycopene图4 HP1HP2 基因RNA 干涉片段PCR 检测Fig. 4 PCR analysis for the RNAi fragment of HP1HP2 gene图5 HP1和HP2表达水平的半定量分析Fig. 5 Semi-quantitative RT-PCR analysis of the expression levels of HP1and HP2图6 果实特异型RNAi 干涉HP1+HP2基因的植株的果实表型Fig. 6 Fruit phenotypes of fruit-speci fi c HP1+HP2 RNAi transgenictomatoes表2 转基因和野生番茄果实、叶片中叶绿素含量Table 2 Chlorophyll contents in matured green fruits and leavesof transgenic and wild plants株系Plant 果实叶绿素含量Chlorophyll content in fruit 叶片叶绿素含量Chlorophyll content in leafWild 43.679±5.5011512.559±112.233HP1HP2-178.263±9.511*1579.397±64.376HP1HP2-270.996±7.649*1534.007±77.882HP1HP2-363.361±7.978*1566.585±75.101*与野生型相比有显著差异（P ＜0.01） *Represents signi fi cant difference compared with wild plant (P ＜0.01)595 5 期刘继恺等：番茄HP1和HP2基因RNA共干涉载体的构建及遗传转化reduce cancer risk? Integr Cancer Ther, 2002, 1: 121~1323 Giovannucci E, Ascherio A, Rimm EB, Stampfer MJ, Colditz GA,Willett WC. Intake of carotenoids and retino in relation to risk of prostate cancer. J Natl Cancer Inst, 1995, 87: 1767~17764 Ronen G, Carmel-Goren L, Zamir D, Hirschberg J. An alternativepathway to β-carotene formation in plant chromoplasts discovered by map-based cloning of Beta and old-gold color mutations in tomato. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 11102~111075 Romer S, Fraser PD, Kiano JW, Shipton CA, Misawa N, Schuch W,Bramley PM. Elevation of the provitamin A content of transgenic tomato plants. Nat Biotechnol, 2000, 18: 666~6696 Rosati C, Aquilani R, Dharmapuri S, Pallara P, Marusic C, TavazzaR, Bouvier F, Camara B, Giuliano G. Metabolic engineering of beta-carotene and lycopene content in tomato fruit. Plant J, 2000, 24: 413~419 7 Mustilli AC, Fenzi F, Ciliento R, Alfano F, Bowler C. Phenotype of thetomato high pigment-2 mutant is caused by a mutation in the tomato homolog of DEETIOLATED1. Plant Cell, 1999, 11: 145~1578 Davuluri GR, Tuinen AV, Fraser PD, Manfredonia A, Newman R,Buigess D, Brummell DA, King SR, Palys J, Uhlig J, Bramley PM, Pennings HMJ, Bowler C. Fruit-specific RNAi-mediated suppression of DET1 enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes. Nat Biotechnol, 2005, 23: 890~8959 Wang SH, Liu JK, Feng YY, Niu XL, Giovannoni J, Liu YS. Alteredplastid levels and potential for improved fruit nutrient content by downregulation of the tomato DDB1-interacting protein CUL4. Plant J, 2008, 55: 89~10310 Porebski S, Bailey LG, Bemard R. Modification of CTAB DNAextraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphend components. Plant Mol Rep, 1997, 15: 8~1511 Wang YH (王芋华), Mao SL (毛双林), Li HJ (李浩杰), Wang SQ(王世全), Luo K (罗科), Li P (李平). Introduction of bacterial blight resisteance gene Xa21 and molecular detection in transgenic rice. Chin J Appl Environ Biol (应用与环境生物学报), 2001, 7: 228~23112 Meng FJ (孟凡娟), Xu XY (许向阳), Li JF (李景富). Study oncorrelation of the tomato fruit’s pigment content and surface colour. J Dongbei Agric Univ (东北农业大学学报), 2006, 37: 459~46213 Kusaba M. RNA interference in crop plants. Curr Opin Biotech, 2004,15: 139~14314 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, WaterhousePM. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature, 2000, 407: 319~32015 Santino CG, Stanford GL, Conner TW. Developmental and transgenicanalysis of two tomato fruit enhanced genes. Plant Mol Biol, 1997, 33: 405~416。

园艺学报 2010，37（3）：390–396Acta Horticulturae Sinica超表达草生欧文氏菌crtB基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究张建成，周文静，邓秀新*（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070）摘 要：利用重组PCR技术，将草生欧文细菌八氢番茄红素合成酶基因crtB与豌豆质体定位序列ts-rbc S融合，插入质粒载体PMV中，构建了植物表达载体pBI-ts-rbc S-crtB，并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄。

PCR检测、Southern杂交和RT-PCR分析表明，外源基因crtB已整合到番茄基因组中，并在转基因植株中得到表达。

转基因番茄果实中的类胡萝卜素总量增加1.3 ~ 2.5倍，八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素分别增加了4.3、1.8、2.2和2.3倍。

转化株系中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。

crtB基因过量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。

关键词：番茄；草生欧文氏菌；八氢番茄红素合成酶；载体构建；遗传转化中图分类号：S 641.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）03-0390-07 Overexpression of crtB Gene from Erwinia herbicola Improved CarotenoidsSynthesis in Transgenic TomatoZHANG Jian-cheng，ZHOU Wen-jing，and DENG Xiu-xin*（National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Huazhong Agriculture Univercity，Wuhan 430070，China）Abstract：The fused pea ts-rbc S fragment and crtB gene from Erwinia herbicola was inserted into the PMV plasmid vector, resulting the plant expression vector pBI-ts-rbc S-crtB，which was transformed into tomato by Agrobacterium-mediated transformation. The result of PCR，Southern blot and RT-PCR revealed that foreign crtB gene was integrated and expressed in the transgenic tomato lines. Total carotenoids contents in the fruits of transgenic lines were 1.3–2.5 times higher than that of the control, the phytoene, lycopene，β-carotene and α-carotene contents were 4.3，1.8，2.2，and 2.3 times higer respectively. In addition，the expression of endogenous genes involved in carotenoid synthesis was affected in the transgenic lines. These results suggested that overexpression of crtB significantly enhanced the carotenoids biosynthesis and accumulation in transgenic tomato fruits.Key words：tomato；Erwinia herbicola；phytoene synthease；construction of expression vector；genetic transformation类胡萝卜素具有广泛的生物功能（Bartley & Scolnik，1995；Tracewell et al.，2001；Fraser & Bramley，2004）。

华北农学报·2010，25(5):42-46收稿日期:2010－08－13基金项目:国家自然科学基金项目(30671447)作者简介:石玉(1983－)，女，山东青州人，在读硕士，主要从事果树抗性生理与生物技术育种研究。

通讯作者:张军科(1969－)，男，甘肃灵台人，副教授，博士，主要从事果树抗性生理与生物技术育种研究。

苹果PGIP 基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究石玉，张军科，张毅，洪晓娟，马锋旺(西北农林科技大学园艺学院，农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室，陕西杨凌712100)摘要:为了验证苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP )基因表达产物对植物病原真菌的作用，获得转基因植株，培育抗病新品种，本研究用限制性内切酶S al Ⅰ、Bam H Ⅰ将已克隆的苹果PGIP 基因从克隆载体pMD-18T 上切下，定向插入到植物表达载体pWR306的ED35s 启动子和TNOS 终止子中间，成功构建了苹果PGIP 基因植物表达载体pWR306-PGIP 及工程农杆菌，以番茄中蔬四号叶片及茎段为受体，通过农杆菌介导法转化，获得了8株PCR 检测阳性的番茄植株。

关键词:多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因;植物表达载体;根癌农杆菌;遗传转化;番茄中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1000－7091(2010)05－0042－05Plant Expression Vector Construction of Apple PGIP Gene and ItsTransformation into TomatoSHI Yu ，ZHANG Jun-ke ，ZHANG Yi ，HONG Xiao-juan ，MA Feng-wang(College of Horticulture ，Northwest Agriculture and Forestry University ，Key Lab of Northwestern HorticultralGermplasm Resource Application of Ministry of Agriculture ，Yangling712100，China )Abstract :Aimed to study the function of polygalacturonase-inhibiting protein gene in plant ，breed disease resist-ant cultivar ，obtain the transgenic plant ，a plant expression vector pWR306-PGIP was constructed by inserting the PGIP gene coding fragment from cloning vector pMD-18T by S al Ⅰand Bam H Ⅰsites into pWR306between of ED35s promotor and NOS terminator．The identification results showed that the plant expression vector pWR306-PGIP and Agrobacterium tumefaciems were constructed successfully．Subsequently PGIP gene was transformed into Zhongshu No．4tomato leaves and shoot fragments mediated by Agrobacterium tumerfaciens．Eight transgenic resistant plants were proved by PCR preliminarily that the PGIP gene had integrated into tomato genome．Key words :PGIP gene ;Plant expression vector ;Agrobacterium tumerfaciens ;Genetic transformation ;Tomato 植物细胞壁是病原真菌在侵染过程中所遇到的第一道防线，植物病原真菌可分泌一系列的酶来降解植物细胞壁［1］。

LeJA2基因沉默表达载体导入番茄转化系统的建立目前,各类昆虫的侵害对农作物生产构成了极大威胁,而化学杀虫剂的使用对环境和人类健康都会产生极大的危害。

因此明确植物自身的抗性反应机制,从而降低化学药剂的使用量,成为目前的迫切需求和研究热点。

2003年,李传友等[1]发现作物系统抗性中可以进行长距离运输的是茉莉酸而不是系统素,因此茉莉酸介导的抗性反应途径成为目前的研究热点。

LeJA2基因是番茄抗性反应途径重要的上游调控基因,研究和明确该基因的功能对于研究茉莉酸抗性反应途径具有重要的意义。

本研究利用根癌农杆菌介导,将反义LeJA2基因导入番茄, 并试图找到影响转化频率的主要因素, 建立起高效稳定的番茄转化体系,为下一步进行更深入的研究打下基础。

1 材料与方法1.1 材料和培养基1.1.1 菌株及基因根癌农杆菌菌株LBA4404; LeJA2-RNAi基因,长度517 bp,位于载体pUCCERNAi上。

1.1.2 植物材料番茄常规品种M82,由中国科学院番茄资源研究中心提供。

1.1.3 培养基种子生长培养基:1/2 MS;预(共)培养培养基:MS+1.0 mg/L ZT;筛选分化培养基:MS+2.0 mg/L ZT+500 mg/L Amp+100 mg/L Kana;生根培养基:MS+50 mg/L Amp+50 mg/L Kana+1 mg/L IBA。

上述培养基若加抗生素,均需将无菌的培养基置于超净工作台上, 待培养基冷却至60℃后,再将无菌的抗生素加入。

1.2 质粒检测方法采用碱解法提取质粒,于含EB (溴化乙啶)的1.2% 琼脂糖上100 V 电泳45 min,紫外灯下观察,结果见图1。

1.3 植物材料的准备取番茄常规品种M82, 挑选饱满、粒大种子,用70% 酒精消毒2 min,无菌水冲洗3 遍;然后用10%NaClO浸泡15～20 min,再用无菌水冲洗3 遍, 接种于1/2 MS基本培养基上,于25℃光照培养。

LYC-b基因反义表达对番茄果实番茄红素含量的影响徐加新;梁燕【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2009(037)012【摘要】[目的]研究番茄红素β-环化酶(LYC-b)基因反义表达对番茄果实中番茄红素含量的影响,为番茄品质育种提供新方法.[方法]以番茄品种"TTI1117A"和"灵光3号"为材料,构建了分别由CaMV35S启动子驱动的GUS标记基因和反义LYC-b5'基因双价植物表达载体.通过农杆菌GV3101介导,将基因整合到番茄基因组中,采用GUS、PCR以及RT-PCR、Northern杂交进行检测,并测定了转基因植株果实中的番茄红素含量.[结果]由GUS、PCR检测结果可知,筛选出1株"TTI1117A"和4株"灵光3号"转基因植株;RT-PCR、Northern杂交检测结果表明,目的基因在RNA水平上已经表达;对番茄果实中番茄红素含量的测定结果表明,转基因植株果实中番茄红素含量均高于未转基因植株.[结论]LYC-b基因的反义表达具有提高番茄果实中番茄红索含量的作用.【总页数】6页(P127-132)【作者】徐加新;梁燕【作者单位】西北农林科技大学,园艺学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S641.2【相关文献】1.LYC-B基因沉默对紫色番茄果实主要色素及挥发性物质的影响 [J], 吕洁;梁燕;赵菁菁;张颜;常培培;秦蕾;李云洲2.鲜食番茄果实中番茄红素含量的主基因-多基因混合遗传分析 [J], 李纪锁;沈火林;石正强3.番茄红素-β-环化酶(LYC-b)反义基因在番茄转基因后代的表达及其遗传稳定性[J], 吴江敏;孙亚东;梁燕;徐加新4.K+、Mn2+对番茄果实中番茄红素积累及其关键酶基因表达的影响 [J], 王艳;田红梅;张建;王明霞;贾利;方凌5.K＋、Mn2＋对番茄果实中番茄红素积累及其关键酶基因表达的影响 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猕猴桃 AcGL K2a基因过表达载体的构建及在番茄中的遗传转化周昂;牛向丽;刘永胜【摘要】AcGLK2a(Actinidia chinensis GOLDEN2‐LIKE)vector was constructed to transform into tomato to obtain transgenic plants for investigating its effect on fruit and thereof improving fruit quality by transfer ‐ring with exogenous gene .The full‐length cDNA sequence of AcGLK2awas amplified by reverse transcrip‐tion‐polymerase chain reaction(RT‐PCR) .The overexpression vector harboring the gene of AcGLK2adriven by CaMV35S promoter was transferred into tomatothro ugh Agrobacterium‐mediated transformation method and verified by PCR .The semi‐quantitative RT‐PCR analysis showed high levels of AcGLK2ain the transgen‐ic plants ,whereas no AcGLK2aexpression in the wild type plants .The content of chlorophyll in green ma‐ture fruits and leaves of the transgenic lines was higher than that of wild typeplants .These results suggested that the expression of AcGLK2ain tomato could improve the fruit quality .%文章构建猕猴桃 AcGLK2a（Actinidia chinensis GOLDEN2‐LIKE）基因过表达载体，转入番茄植株中对转基因番茄果实进行初步分析，可为采用基因工程方法转入外源基因对改良番茄果实品质做新的尝试。

阔叶猕猴桃GalDH基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。

研究表明AsA不仅是保证人类健康所必需的营养物质之一,而且对于植物自身的抗氧化、光合保护以及调节生长发育等都具有非常重要的作用。

L-半乳糖脱氢酶(L-galactose dehydrogenase,GalDH)是植物抗坏血酸L-半乳糖合成途径中关键酶之一,它可能是L-半乳糖合成途径中的调控位点。

本试验在获得阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia Merr.)GalDH基因全长cDNA的基础上,构建GalDH的过量植物表达载pCSB/GalDH和RNA表达载体pHGRV/GalDH,并将过量表达载体pCSB/GalDH转入根癌农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌介导法将pCSB/GalDH基因导入番茄(Solanum lycopersicum L)Micro-Tom,筛选获得抗性植株,对GalDH基因功能进行验证,并为高等植物抗坏血酸合成奠定材料基础。

获得的主要结论如下:1.建立了Micro-Tom番茄高频再生体系试验探讨了不同激素浓度配比、暗培养时间、头孢霉素浓度等条件对再生影响,探讨了IAA对生根的影响,结果表明不定芽再生最佳的培养基配方为:MS+ZT 2.0mg/L+IAA 0.2mg/L;在MS+0.3mg/LIAA的培养基上可以再生出高质量的根,移栽成活率在80%。

预培养2d,头孢霉素200mg/L可以再生出高频率的愈伤组织和不定芽。

2.构建了GalDH基因过量植物表达载体pCSB/GalDH和RNAi表达载体pHGRV/GalDH用限制性内切酶BamHI和KpnI将已克隆的阔叶猕猴桃GalDH基因从克隆载体pMD-19T上切下,定向插入到植物表达载体pCSB,成功构建了阔叶猕猴桃GalDH基因植物过量表达载体pCSB/GalDH。

ICE1基因表达载体的构建及对番茄的转化张玉;蒋欣梅;于锡宏【期刊名称】《中国蔬菜》【年(卷),期】2010(000)018【摘要】以pCAMBIA3301质粒为基础,构建了由CaMV35S启动子调控的ICE1基因植物表达载体p3301-ICE1.重组质粒通过农杆菌介导转化番茄品种组培大黄经卡那抗性鉴定,获得5株含ICE1基因的番茄抗性植株,PCR扩增和RT-PCR检测结果表明,其中3株为阳性植株,转化率为60%.转ICE1基因的番茄植株经4℃低温胁迫72 h后,与对照植株相比,MDA含量明显降低,Pro含量、POD和CAT活性明显升高.【总页数】7页(P27-33)【作者】张玉;蒋欣梅;于锡宏【作者单位】东北农业大学园艺学院蔬菜生理与设施园艺研究室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学园艺学院蔬菜生理与设施园艺研究室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学园艺学院蔬菜生理与设施园艺研究室,黑龙江哈尔滨,150030【正文语种】中文【中图分类】S641.2【相关文献】1.番茄黄化曲叶病毒 Rep 基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化 [J], 裴华丽;刘永光;乔宁;李美芹;薛其勤;杨天慧2.Trxf1基因表达载体的构建及在加工番茄中的遗传转化 [J], 马展;莘冰茹;王松;何晓玲;刘慧英3.农杆菌介导的ICE1基因转化番茄的研究 [J], 张玉;蒋欣梅;于锡宏4.番茄ACC合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转化 [J], 张晓海;扈廷茂;海燕;李丽莉;王永胜5.人α-干扰素2b基因转化番茄、番木瓜的研究(Ⅰ)──—人α-干扰素2b基因植物表达载体构建方法的研究 [J], 周鹏;赵志英;郑学勤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

M2e-HBC融合蛋白的真核表达刘蕊;李志奎【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2011(040)009【摘要】目的:构建以乙肝病毒核心蛋白(HBC)为载体的甲型流感病毒M2基因胞外区(M2e)通用疫苗杆粒,利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,进行真核表达.方法:利用PCR技术将甲型流感病毒M2e基因序列与HBC相连.经酶切、酶联将融合基因插入pFastBacHTA载体,在DH10Bac细胞中进行同源重组,经测序鉴定后构建M2e-HBC杆粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获并扩增含有M2e-HBC的杆状病毒,经扩增后获得高效价的重组杆状病毒,用SDS-PAGE、免疫荧光法和电镜检测目的蛋白的表达.结果:构建了以HBC为载体的M2e通用疫苗杆粒,通过转染sf9昆虫细胞得到M2e-HBC融合蛋白真核表达.结论:成功构建了HBC与甲型流感病毒M2e融合蛋白的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了基础.【总页数】4页(P1127-1130)【作者】刘蕊;李志奎【作者单位】西安市第四医院呼吸科,西安710004;第四军医大学西京医院呼吸科【正文语种】中文【中图分类】R373.13【相关文献】1.猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建及融合蛋白的表达 [J], 郑亮;张华;曹宏伟;邹德华;程丽鑫;李兴志;张雅婷;沈玉江;武雪宁;徐嘉欣;王显赫2.重组EGFP-aquaporin-4融合蛋白真核表达载体的构建及其在FRT细胞中的表达和定位 [J], 李凤娥;郝峰;藏雨轩;马睿泽;孔繁利;刘磊;李艳3.mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒载体和真核表达载体的构建及体外的稳定表达 [J], 王晶哲;王小铃;王娟;杨鑫鑫;闫美娜;李欣悦;王荟;刘霞;邵启祥4.大鼠髓样细胞表达激发受体-1/人IgG融合蛋白真核表达载体的构建表达与鉴定[J], 张尤历;曹亮;徐岷;路筝;袁伟红;李兆申5.水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 匡文华;王凤阳;张晓茹;成鹰;杜丽;雷明;焦寒伟;张冬琳;郝永昌;祁超因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。