索拉菲尼联合化疗对肝癌细胞株的抑制作用研究

索拉菲尼联合化疗对肝癌细胞株的抑制作用研究摘要：研究索拉菲尼联合不同化疗药物对肝癌细胞株的体外抑制作用。

关键词：肝癌；索拉菲尼；生物化疗中图分类号：R735.7文献标志码：B文章编号：0258-4646（2010）07-0589-03Inhibitory Effect of Sorafenib Combined with Chemotherapy on Hepatocellular Carcinoma Cell Line BEL -7402原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，占癌症相关死亡率的第三位［1］。

肝癌患者病程发展迅速，出现症状时多数已为中晚期并伴有不同程度的肝硬化，往往不适合手术、放疗或介入治疗。

同时由于肝细胞癌的多药耐药性问题，全身化疗的疗效一直不理想［2］。

索拉菲尼作为第一个在肝癌治疗中获得生存优势的分子靶向药物，为肝癌治疗提供了新的思路［3］。

索拉菲尼与其他化疗药物联合治疗可能是肝癌治疗的一个新方向，但是联合治疗方案的制定尚有许多需要解决的问题，如与哪些药物的结合更有利与肿瘤治疗，时机如何选择等。

本研究比较索拉菲尼联合不同化疗药物对肝癌BEL -7402细胞系的体外抑制作用，为临床应用提供实验室依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1药物索拉菲尼［N -（3-三氟甲基-4-氯苯基）-N -（4-（2-甲基氨基甲酰嘧啶）苯氧基）尿素］购自Bayer 公司，先将索拉非尼溶于100%DMSO （Sigma ，St.Louis ，MO ），再用RPMI 1640培养基稀释至所需浓度，DMSO 的终浓度为0.1%。

将0.1%（v/v ）的DMSO 加入培养基作为溶剂对照。

顺铂购自云南个旧生物药业有限公司，氟尿嘧啶购自长春天诚药业有限公司，盐酸表柔比星购自浙江海正药业，依托泊苷购自国药集团国瑞药业有限公司。

Cell Counting Kit -8试剂盒（CCK -8试剂盒）购自江苏碧云天生物技术研究所。

Annexin V -FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司。

1.1.2细胞系BEL -7402人肝癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，于5%CO 2、37℃孵箱中培养。

1.2方法1.2.1CCK8法检测不同药物对肝癌细胞的抑制作用：取对数生长期的肝癌BEL -7402细胞，以1×104/孔的密度接种于96孔板，于5%CO 2、37℃孵箱中培养24h 后加入药物。

实验分为索拉菲尼组（13.8μmol/l 、20.8μmol/l 、41.6μmol/l 、83.2μmol/l 、166.4μmol/l ），顺铂组（7.5μg/ml 、15μg/ml 、30μg/ml 、60μg/ml 、120μg/ml ），表柔比星组（0.6μg/ml 、1.2μg/ml 、2.4μg/ml 、4.8μg/ml 、9.6μg/ml ），氟尿嘧啶组（25μg/ml 、50μg/ml 、100μg/ml 、200μg/ml 、400μg/ml ），依托泊苷组（2μg/ml 、4μg/ml 、8μg/ml 、16μg/ml 、32μg/ml ），联合组为索拉菲尼与以上各化疗药物按对应五个浓度联合，另设不加药对照组及0.1%（v/v ）DMSO 溶剂对照组，每组三个复孔。

分别于药物处理24h 、48h 、72h 、96h 后加入CCK8溶液（10μl/孔），继续孵育2h ，酶联免疫分析仪于波长450nm 测每孔的光密度值（OD 值）。

计算细胞增殖抑制率，抑制率=（对照组-实验组）/对照组×100%。

采用协同作用q 值判断索拉非尼和化疗药物联用的性质。

q 值的计算公式为：q=E AB /（E A +E B -E A ×E B ）。

式中E A 和E B 为各药单用抑制率，E AB 为两药合用抑制率。

1.2.2细胞凋亡AnnexinV/PI 检测及形态学鉴定：用Annex －inV/PI 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，将处于对数生长期的肝癌BEL -7402细胞接种于6孔板，经上述各药物单药或联合处理24h 后，收集各组细胞，调整细胞浓度为5×105/ml ，用500μl binding buffer 悬浮细胞，加入5μL AnnexinV -FITC 混匀后，加入5μL PI ，室温避光反应15min ，流式细胞仪检测细胞凋亡。

数据由WinMDI 2.9软件系统分析。

DNA 核形态使用Hoechst 33258染料（1mg/ml ）对固定后的细胞染色检测。

1.3统计学分析实验数据以x ±s 表示，采用SPSS 13.0统计软件包进行方差分析，检验水准α=0.05。

2结果2.1索拉菲尼单药或联合用药对肝癌细胞抑制作用的比较CCK8结果显示，经索拉菲尼联合不同化疗药物作用后，人肝癌BEL -7402细胞的生长均受到抑制，联合用药组抑制率明显高于各单药组，差异有统计学意义（P <0.05）（见图1）。

药物联合作用于肝癌细胞24h 、48h 、72h 、96h 均表现出抑制作用，索拉菲尼+ADM 组和索拉菲尼+依托泊苷组抑制率在48h 达峰值，72h 开始下降；索拉菲尼+DDP 组和索拉菲基金项目：辽宁省科技发展计划重点项目（2008225008-5）作者简介：李卿（1983-），女，硕士研究生.通讯作者：隋承光，E-mail ：cgsui1964@ 收稿日期：2009-09-04李卿1，王新利1，王红兵2，隋承光1（1.中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳110001；2.中国医科大学附属第一医院外科教研室胃肠胰外科，沈阳110001）中国医科大学学报第39卷第7期2010年7月Journal of China M edical University V o l.39N o.7Jul.2010589··组别（μmol/l+μg/ml ）时间24h48h 72h 96h Sorafenib+DDP浓度1（13.8+7.5）0.910.85 1.140.98浓度2（20.8+15）0.90.91 1.16 1.1浓度3（41.6+30）0.880.93 1.16 1.07浓度4（83.2+60）0.97 1.04 1.180.98浓度5（166.4+120）0.93 1.1 1.170.93Sorafenib+ADM浓度1（13.8+0.6）0.85 1.140.860.89浓度2（20.8+1.2）0.86 1.160.860.92浓度3（41.6+2.4）0.85 1.180.91 1.02浓度4（83.2+4.8）0.86 1.20.97 1.05浓度5（166.4+9.6）0.86 1.17 1.010.89Sorafenib+FU浓度1（13.8+25）0.880.910.910.97浓度2（20.8+50）0.90.86 1.16 1.03浓度3（41.6+100）0.870.82 1.18 1.04浓度4（83.2+200）0.880.91 1.2 1.08浓度5（166.4+400）0.960.94 1.2 1.05Sorafenib+VP -16浓度1（13.8+2）0.87 1.130.850.92浓度2（20.8+4）0.91 1.110.920.92浓度3（41.6+8）0.86 1.160.98 1.04浓度4（83.2+16）0.86 1.18 1.03 1.08浓度5（166.4+32）0.851.21.051.02注：q >1.15为协同作用，0.85≤q ≤1.15为相加作用，q <0.85为拮抗作用。

尼+FU 组抑制率在72h 达峰值，96h 开始下降。

其中，经药物处理48h 后，索拉菲尼+ADM 组和索拉菲尼+依托泊苷组在浓度3、4、5时q 值>1.15，表现为协同作用；经药物处理72h 时，索拉菲尼+DDP 组和索拉菲尼+FU 组在2、3、4、54个浓度梯度表现出协同作用，其余均为相加作用（表1）。

2.2索拉菲尼单药或联合用药对肝癌细胞凋亡率的影响单药及联合组诱导肝癌细胞的凋亡率均较对照组增高（P <0.05），且联合用药组明显高于单药组，差异有统计学意义（P <0.05）（图2）。

Hoechst 33258染料染色，荧光显微镜观察可见各给药组均出现核浓缩，边聚现象（图3）。

表1联合用药对肝癌BEL -7402抑制作用的q 值3讨论肝癌是一种对化学疗法抵抗的肿瘤，大部分系统化疗临床实验结果有效率仅为0~25%，目前仍没有证据显示系统化疗能提高总体生存率［4，5］。

一项多西瑞宾联合不同化疗药物（顺铂/干扰素α/多西瑞宾/氟尿嘧啶）的三期临床实验显示有效率明显增加，但总生存期并没有明显提高［6］。

索拉非尼是一种多激酶抑制剂，它不但可以抑制RAF激酶活性，还抑制几种受体酪氨酸激酶活性，包括血管内皮生长因子受体-2（VEGFR -2）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR ）、FLT 、Ret 和c -Kit ［7］。

研究证明索拉非尼对两种人类肝癌细胞系HepG2和PLC/PRF/5均能抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡，同时其在动物移植模型中也显示了广泛的抗肿瘤活性［8］。

索拉菲尼的作用机制以及其表现出的较小的副作用，使其与化学治疗联合成为可能。

肿瘤细胞P 糖蛋白（P -glycoprotein ，Pgp ）的过度表达在原中国医科大学学报第39卷590··发性肝细胞癌的多药耐药发生机制中占主要地位。

研究发现选择性MEK 抑制剂U0126能下调Pgp 的表达［9］，提示RAF/ERK/MRK 通路和Pgp 表达有关。

国内也有研究证实索拉非尼能抑制Pgp 的表达，增加细胞内化疗药物的浓度从而逆转肝癌细胞的多药耐药性［10］。

本研究发现索拉菲尼和顺铂、表柔比星、氟尿嘧啶、依托泊苷联合均出现相加或协同抑制效应，不同化疗药物与索拉菲尼联合表现出协同效应的时间不同，这可能和药物作用的细胞周期有关，其机制还需进一步研究。

肿瘤的生物化疗（biochemotherapy ）是生物治疗和化学治疗联合应用于肿瘤治疗的全新综合治疗模式，索拉菲尼单药在肝癌的治疗上已取得肯定的疗效，现将索拉菲尼和不同化疗药物联合，探讨不同联合方案对肝癌细胞的体外抑制作用，为肝癌的综合治疗提供了实验室依据。

参考文献：［1］Llovet JM ，Burroughs A ，Bruix J.Hepatocellular carcinoma ［J ］.Lancet ，2003，362（9399）：1907-1917.［2］Palmer DH ，Hussain SA ，Johnson PJ.Systemic therapies for hepato －cellular carcinoma ［J ］.Expert Opin Investig Drugs ，2004，13（12）：1555-1568.［3］Llovet J ，Ricci S ，Mazzaferro V ，et al.Randomized phase Ⅲtrial ofsorafenib versus placebo in patients with advanced hepatocellularcarcinoma（HCC ）［R ］.ASCO Meeting Abstracts ，2007：25.［4］Johnson PJ.Hepatocellular carcinoma ：is current therapy really alter －ing outcome?［J ］.Gut ，2002，51（4）：459-462.［5］Johnson PJ.Are there indications for chemotherapy in hepatocellularcarcinoma?［J ］.Surg Oncol Clin N Am ，2003，12（1）：127-134.［6］Yeo W ，Mok TS ，Zee B ，et al.A randomized phase III study of dox －orubicin versus cisplatin/interferon alpha -2b/doxorubicin/fluorouracil （PIAF ）combination chemotherapy for unresectable hepatocellular carcinoma ［J ］.J Natl Cancer Inst ，2005，97（20）：1532-1538.［7］Wilhelm SM ，Carter C ，Tang L ，et al.BAY 43-9006exhibits broadspectrum oral anti -tumor activity and targets the Raf/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis.Cancer Res ，2004，64（19）：7099-7109.［8］Li Liu ，Yichen Cao ，Charles Chen ，et al.Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway ，inhibits tumor angiogenesis ，and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5［J ］.Cancer Res ，2006，66（24）：11851-11858.［9］Kazuhiro Katayama ，Sho Yoshioka ，Satomi Tsukahara ，et al.Inhibi －tion of the mitogen -activated protein kinase pathway results in the down -regulation of P -glycoprotein ［J ］.Mol Cancer Ther ，2007，6（7）：2092-2102.［10］魏莉，苏宁，曹梦苒，等.索拉菲尼对耐药肝癌细胞株BEL -7402/FU 逆转作用的研究［J ］.细胞与分子免疫学杂志，2009，25（4）：344-347.（编辑孙宪民，英文编辑陈姜）A B李卿等.索拉菲尼联合化疗对肝癌细胞株的抑制作用研究第7期我校附属第一医院刘永锋、程颖、吴刚等人完成的《移植物低温保存的临床基础研究》成果获2009年教育部高等学校研究优秀成果奖科学技术进步一等奖。