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Western Blot—单层贴壁细胞蛋白提取及半干转法为例—中山大学临床检验诊断学硕士—刘记2016/11/141．蛋白制样A．贴壁单层细胞的处理：1）60mm细胞培养皿按200ul/皿，准备RIPA裂解液【6孔板100ul/孔，按底面积换算，用量不能过多，不然后续蛋白浓度过稀，无法保证15ul有足够的蛋白上样量】2）使用前将CockTail按1:100加入RIPA，混匀，冰上备用3）收取培养上清后，预冷PBS洗涤两遍【洗涤干净培养基，防止BCA培养基颜色干扰】4）200ul/皿，加入RIPA裂解液，冰上放置5分钟，轻晃使裂解液铺匀整个底面细胞5）冰上操作，细胞刮刷将细胞刮向一侧，加样枪收样到标记好的EP管，冰上放置6）离心，4℃，14000Xg，15min7）冰上操作，收上清至新标记好的EP管，冰上放置B．BCA测定蛋白浓度：按照碧云天BCA试剂盒说明书操作即可1）收取蛋白样品稀释10-20倍测浓度2）蛋白标准品在公用-20℃冰箱2层C．蛋白浓度调整：1）根据BCA蛋白浓度测定结果，按15ul上样体积【15-20ul】，40ug总上样量【30-100ug】，等体积，等蛋白量上样调整浓度至一致2）加入5XSDS蛋白上样缓冲液3ul，剩余12ul由上样蛋白和PBS补足3）按照计算好的每个15ul总体积需要加入的蛋白体积，PBS体积，5XSDS蛋白上样缓冲液体积，按6个15ul即90ul总体积，用量各X6配总体系【0.5mlEP管】，煮沸5min后再分装到每个小的EP管4）用0.5mlEP管配总体系，煮沸5min【使用0.5mlEP管，煮沸时不易进水】5）分装至0.2mlEP管【不要用0.2ml的EP管煮沸，易进水，改变总体积】，-80℃保存备用2．SDS-PAGEA．配胶【以1.0mm厚度mini胶为例】1）按照目的蛋白分子量大小选择适合浓度的分离胶2）选用新配置AP，4℃保存3）将玻璃板洗洁精洗涤干净，自来水冲洗干净，烘箱烘干备用；固定架上的软垫洗涤干净；梳子洗涤干净，烘干备用4）配胶用小烧杯洗净，倒扣纸巾吸干水滴，严格按照相应浓度分离胶的配方加入各种组分5）按照每块mini胶5ml用量配置分离胶，3ml用量配置浓缩胶6）加入TEMED后，迅速将分离胶倒入15ml离心管，迅速倾倒入玻璃板之间至绿色内边接近上缘，最后用1ml加样枪补加少量分离胶至绿色内边上缘【此步骤速度要快，防止凝固，导致分离胶上缘不平】7）尽快用1ml加样枪加无水乙醇进行液封，将分离胶上缘压平8）可观察配分离胶小烧杯剩余分离胶是否凝固，判断配胶是否出现问题，不凝固最常见问题是AP失效9）待分离胶与无水乙醇间出现明显分界线，5min左右，快速倒去无水乙醇，滤纸沿边缘吸干10）按照配方配置浓缩胶，加入TEMED后，用1ml加样枪迅速加满玻璃板，除去任何气泡11）将洗净的梳子迅速斜行划入，垂直压下，观察严禁梳子下方出现气泡，静置30min【跟室温和AP活性有关，可放入湿度温箱加速凝固】12）通过观察配浓缩胶小烧杯剩余浓缩胶的凝固情况判断配胶是否出现问题13）蛋白胶的保存，放入小袋，加少量单蒸水，保证胶润湿，常温保存可一周【4℃保存过久易出现裂胶】B．蛋白上样1）将配好的两块蛋白胶玻璃板用夹子夹在一起，小玻璃板向内，带字玻璃板向外，组成内电泳槽，放入大电泳槽，内外槽均加满1X的SDS电泳缓冲液2）在电泳缓冲液浸没的情况下，垂直向上轻轻拔出梳子【禁止干拔梳子，易致泳道破裂或粘合】3）蛋白上样，mini胶每孔上样蛋白体积最好15ul，最多不超过20ul，否则容易出现蛋白样品外溢，进入其它泳道或者曝光易出现β-actin的相连成线，上样预染蛋白marker，并记录蛋白样本次序，记住靠近marker的样本【若为了保证蛋白样本跑胶整齐不偏斜，可以在蛋白样本两侧各加一个泳道的蛋白marker，向内压】C．电泳1）按照对应红色黑色电极盖上电泳槽盖子，插上电极2）打开电源开关，调整电压80V，观察电泳槽出现小气泡上浮，证明正在电泳3）2h左右，观察溴酚蓝位置，待溴酚蓝刚跑出内电泳槽绿色底边时，终止电泳，关掉电源，拔下电极，盖子3．转膜-半干转法1）预先配好1L干转专用转膜缓冲液，向小瓷盘倒入一定量转膜液2）将干转专用滤纸两厚张浸入转膜缓冲液，准备干净的玻璃棒，镊子放入转膜液3）用绿色塑料小撬板将小玻璃板撬开，切除浓缩胶，立刻在分离胶一侧切除部分分离胶做标记，标注正面，如果分离胶底部出现一定量的溴酚蓝弥散，可以在玻璃分离胶之前，用手术刀片直接切除底部弥散溴酚蓝的分离胶；在电泳缓冲液里小心撬开分离胶，用撬板拖入转膜液内4）干转仪地面加少量转膜液润湿，从下向上一次放置滤纸，NC膜，分离胶，滤纸，每放入一层，立即用玻璃棒排出气泡，再加一定量转膜液；放下NC膜后即可用刀片在一角切除标记正面；放下分离胶之后，玻璃棒赶气泡时玻璃棒赶动方向应与蛋白泳道连线平行，轻轻赶动5）盖好转膜仪盖子，插上电极，打开开关，调整电压15V，40min，转膜4．封闭1）转模后，用镊子小心将NC膜取出2）在桌面保鲜膜上加少量TBST，按照预知的目的蛋白分子量KD大小，参照预染marker位置，用刀片切下NC膜，至少多切上下各1个marker位点3）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次4）用5%脱脂奶粉（TBST配置），在抗体孵育盒内，每个格子加入5ml，放入剪切好的NC膜5）摇床，最小转速，室温孵育2-3小时5．孵一抗1）回收封闭液，4℃保存，一周可反复用三次2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）用一抗专用稀释液稀释一抗【一抗稀释液碧云天购买或者用TBST配置5%BSA作为一抗稀释液】4）每格加入5ml一抗稀释液‘5）摇床，最小转速，4℃孵育过夜6．孵二抗1）回收一抗稀释液，4℃保存，可反复使用多次，不少于6个月2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）用封闭液5%脱脂奶粉（TBST配置）稀释二抗4）每格加入5ml二抗稀释液‘5）摇床，最小转速，室温孵育2-3小时7．化学发光1）回收二抗稀释液，4℃保存，可反复使用多次2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）1:1配置好化学发光工作液【碧云天】避光操作，避光保存；按每张膜1ml量配置4）带上镊子，干净玻璃平皿，1ml加样枪，枪头，发光工作液5）在化学发光仪上曝光拍照8．配置溶液1）10%SDS—用于配胶，常温保存2）AP—新鲜配置，4℃保存3）20%TWEEN—配置TBST需要使用4）转膜缓冲液—按照配方配置2X储存液，用前单蒸水稀释至1X5）电泳缓冲液—公用5X储存液，用前单蒸水稀释至1X，或者按配方自己配置6）TBS—商品化粉末溶解即可7）TBST—TBS和20%TWEEN配置8）配胶所需其他几种成分（30%丙烯酰胺，0.5M Tris6.8, 1.5M Tris8.8，TEMED），5XSDS loading buffer，TBS粉末，可以购买商品化产品9．注意事项小结1）电泳缓冲液可配置2X或5X，使用之前用单蒸水稀释至1X，最好不要用PBS稀释，影响组分及导电性2）转膜缓冲液最好自己配置，可配置2X，用前单蒸水稀释至1X，干转15V恒压时初始电流应在800-900mA才正常；若购买转膜液粉末需问清楚是湿转还是干转用途，湿转用转膜液，15V恒压转膜，初始电流300mA左右，不适合干转3）拔梳子禁止干拔，应夹好夹子完全浸没在电泳缓冲液中湿拔4）资料：转膜用NC膜不分正反面，注意孔径选择：0.45μm-大于20KD，0.22μm-小于20KD；自己实验证明统一选用0.45μm可以做出结果5）丽春红染色主要目的是NC膜上蛋白，判定是否成功转膜，并可助于染色条带剪切出目的蛋白位点的NC膜条带，剪下的NC膜用TBST洗涤去除丽春红染色，放入孵育盒开始封闭；丽春红染色步骤可以省略，前提是清楚确定目的蛋白所在位置6）封闭选用进口脱脂牛奶溶于TBST中配置5%脱脂牛奶，室温慢摇不少于2h7）一抗用一抗专用稀释液或者TBST配置5%BSA（不能用脱脂牛奶，易变质），4℃慢摇至少孵育过夜一抗专用稀释液稀释的一抗可半年内多次反复使用；一抗可4℃孵育过夜或两天，不影响效果8）二抗用封闭液稀释，室温慢摇不少于2小时9）每次更换孵育液前用TBST进行洗膜，10min/次，洗涤2次，快摇10）剪切好的膜放在抗体孵育盒内，进行封闭，孵一抗，孵二抗及洗膜过程中，不用拿出膜，可直接倾倒液体11）加发光液前，将NC膜从TBST洗涤液夹出，反面放在纸巾吸干液滴，不要正面摩擦纸巾，防止蛋白脱落。
Western blot检测蛋白质的表达实验的结论通常包括以下几个方面：
1. 蛋白质的表达水平：通过比较目标蛋白质与内参蛋白质的信号强度，可以得出目标蛋白质在样本中的表达水平。
2. 蛋白质的分子量：通过比较标准蛋白的分子量和目标蛋白质的分子量，可以确定目标蛋白质的分子量。
3. 蛋白质的特异性：通过比较阳性对照和阴性对照的信号强度，可以确定目标蛋白质的特异性。
在Western blot检测蛋白质的表达实验中，需要注意以下事项：
1. 样本制备：确保样本的质量和数量，避免样本降解或污染。
2. 抗体选择：选择特异性好、灵敏度高的抗体，避免出现非特异性反应。
3. 实验条件：保持实验条件的稳定和一致性，避免影响实验结果的可重复性。
4. 数据分析：对实验数据进行准确的分析和解释，避免误导实验结果。
总之，Western blot检测蛋白质的表达实验是一种常用的生物化学技术，可以用于研究蛋白质的表达、功能和相互作用等方面。
在实
验中需要注意细节和规范操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
Western blot一、提取细胞蛋白1、准备：将培养板置于冰上，准备刮刀，去离子水，纸，PBS，枪，废液缸，离心管，ripa，蛋白酶抑制剂。
2、配制裂解液：取细胞培养板，按：每空加ripa35μl计算共需ripa量，再按1%比例计算共需蛋白酶抑制剂的量。
两者相加即为裂解液的量。
再将两者加入到ep管中。
3、处理细胞：将培养基倒掉，用PBS洗两遍，倒尽PBS，用枪吸干残余PBS，加入裂解液35μl，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
用刮刀刮净细胞。
4、离心：用枪将细胞与裂解液一起吸入，转移至离心管中，离心13500转，离心15分钟。
5、存放：取上清液转移至ep管中，-20°C储存测浓度，-80°C存放。
二、测蛋白浓度1、准备：将取出的蛋白置于冰上，枪，标记96孔板，BCA，ripa2、配BCA液：按：每孔加200μl A计算，每空加4μl B计算，配制共需BCA液。
3、区部混匀：按：每孔28.5μl ripa,1.5μl蛋白,先加入到离心管中,涡旋,瞬离。
4、全部混匀：按：每孔20μl局部混合液，200μl BCA液加入到96孔板中。
加样时枪头在液面下，提抢时贴壁，尽量不产生气泡。
5、反应：将96孔板置于37度温箱，反应30min。
6,、检测：酶标仪检测，计算浓度，ripa，loading，记录数据。
三、蛋白样预处理1、加样：按计算量将1.5倍的蛋白，ripa，loading量加入到ep管中，此过程在冰上进行，涡旋，瞬离。
2、煮样：100摄氏度，煮5min，看好防崩盖，涡旋，瞬离。
四、电泳1，配电泳液，转膜液：1）、电泳液：甘氨酸15.0g，Tris-base3.02 g,去离子水1000ml,摇,SDS1g。
2）、转膜液：甘氨酸14.4g，tris-base3.00g，去离子水850ml，甲醇150m 2，配胶：1)、洗板，板上没有胶粒。
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白的表达情况，并探究其在细胞信号转导中的作用。
实验材料和方法：材料：1. 细胞培养基和培养器具2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳胶和电泳仪4. 蛋白转印膜和转印仪5. 抗体：一抗和二抗6. ECL检测试剂盒方法：1. 培养细胞并进行处理，如添加特定药物或刺激剂。
2. 收集细胞并用细胞裂解液裂解蛋白。
3. 通过SDS-PAGE电泳将蛋白质分离。
4. 将分离的蛋白转移到蛋白转印膜上。
5. 进行膜上抗原的非特异性结合位点的阻断。
6. 使用一抗与目标蛋白特异性结合。
7. 清洗膜，并使用二抗与一抗结合。
8. 再次清洗膜，并使用ECL检测试剂盒进行显色。
9. 使用图像分析软件分析结果。
结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白的表达情况。
在实验中，我们选择了细胞中一个重要的信号转导蛋白作为目标蛋白，以探究其在细胞内的作用和调控机制。
首先，我们培养了细胞并进行了不同处理。
通过细胞裂解液裂解蛋白，我们成功地提取了目标蛋白。
接下来，我们使用SDS-PAGE电泳将蛋白质分离，并将其转移到蛋白转印膜上。
通过这一步骤，我们可以将蛋白在膜上固定，并便于后续的抗体结合。
在进行免疫印迹之前，我们需要对膜进行阻断，以防止非特异性结合。
通过使用牛血清白蛋白或非脂性奶粉等物质，我们可以有效地阻断膜上的非特异性结合位点。
在阻断后，我们使用一抗与目标蛋白特异性结合。
一抗的选择对于实验结果的准确性至关重要，因此我们在实验前进行了充分的文献调研和试验优化。
在与一抗结合后，我们进行了膜的清洗，以去除未结合的抗体。
接下来，我们使用二抗与一抗结合，并再次清洗膜。
二抗通常被标记有荧光素或酶，以便于后续的信号检测。
最后，我们使用ECL检测试剂盒进行显色。
ECL技术利用酶的催化作用产生荧光或发光信号，从而检测目标蛋白的表达情况。
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项-回复西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项引言：蛋白质是细胞功能的重要组成部分，对于研究蛋白质的表达和功能非常关键。
西方博LOT（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于分析特定蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质的大小和相对丰度以及判断蛋白质的分子量。
本文将介绍西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项。
一、实验结论：1. 确定目标蛋白质的存在与否：在Western blot实验中，通过探针的特异性结合，可以确定目标蛋白质在待检样品中的存在与否。
如果探针与待检样品中的蛋白质结合，会出现特异的蛋白质带，从而可以确定目标蛋白质的存在。
2. 确定目标蛋白质的大小和相对丰度：通过Western blot实验的结果，可以确定目标蛋白质的大小和相对丰度。
在蛋白质电泳分离后，较大的蛋白质会相对较靠近电极负极，较小的蛋白质会相对较靠近电极正极。
通过与已知分子量蛋白质标准曲线的对比，可以确定待检样品中目标蛋白质的分子量。
3. 分析蛋白质的表达水平：通过Western blot实验的结果，可以分析目标蛋白质在不同样品中的表达水平。
通过比较待检样品中蛋白质带的强度，可以初步判断蛋白质的相对表达量。
进一步，可以使用图像分析软件对蛋白质带的强度进行定量分析，获得更精确的表达量数据。
二、实验注意事项：1. 样品处理：西方博LOT实验的样品处理是关键的一步。
样品的存储和处理方式可能会对实验结果产生影响。
为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样品应尽快冷冻保存，并在实验前严格遵循相关处理方法。
2. 磷酸盐缓冲液的配制和pH调整：磷酸盐缓冲液是Western blot实验中的关键试剂，用于制备电泳缓冲液、转膜缓冲液和洗涤缓冲液。
正确配制磷酸盐缓冲液的浓度和pH值是确保实验的准确性和稳定性的重要因素。
3. 蛋白质的电泳分离和转膜：蛋白质的电泳分离要求严格的电泳条件。
最美的感动——母爱
导读:本文是关于话题作文最美的感动——母爱,感谢您的阅读.
世界上最美丽的感动是什么？有人说是亲情，有人说是友谊，有人说是爱情，他们说的都对，而我觉得最美丽的感动是那无私的母爱。
一丝银发让我感动
有一次感冒了，发着高烧。
妈妈见我病的严重，很着急，背起我就往医院跑，到了医院，妈妈把我抱到床上，安慰了我几句，也不休息一下就马上跑到医生那里，问我病的怎么样，要开最好的药。
来来回回，出出进进，一会儿给我端水送药，一会儿给我盖被子，擦擦汗，一刻也不停歇……第二天，我睁开眼睛，看见妈妈正趴在我身上小睡。
朦胧中我看见妈妈乌黑的秀发中，有了一丝银发，顿时，心中像打翻了五味瓶，不知是什么滋味，泪水如泉水般涌了出来。
一把倾斜的雨伞让我感动
有一次在秋季的某一天下了大雨，妈妈打了伞来学校接我，我渐渐地发现妈妈身上怎么这么湿啊？而我身上却干干的。
我悄悄地观察，原来是妈妈慢慢地把雨伞向我这边移，尽量不让我淋着，而自己却被雨浇着。
一阵哭声让我感动
“你不认真！让你不好好学习！”妈妈气得脸通红。
妈妈训完我之后，让我在自己的卧室里好好学习，自己去了她的卧室。
过了一会儿，我听到卧室内传来了哭声。
我躲在门后偷听，只听妈妈哭道：小梅啊，妈妈也心疼你啊，妈妈也不想这样骂你啊，妈妈也是恨铁不成钢啊……“听了妈妈的哭声，我的眼泪涌了出来。
妈妈，你的慈爱、关怀、严爱太伟大了，另我太感动了，那是最美丽的母爱。
我将永远记住这伟大的母爱。
来源与互联网，仅供个人阅读参考。
Western BlotWestern Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达WB-蛋白提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（PMSF）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/l浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
一、单层贴壁细胞总蛋白的提取：1.倒掉培养液，并将培养皿倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液2.每皿细胞加1ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3.按1 ml 裂解液加10 μ PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4.每皿细胞加400 μl 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养皿要经常来回摇动。
5.裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）6.于4℃下12000rpm 离心5 min。
（提前开离心机预冷）7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于-20℃保存。
二、组织中总蛋白的提取：1.将少量组织块置于1～2 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2.加400 μ 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。
然后置于冰上。
3.几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4.裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5 min，取上清分装于0.5 ml 离心管中并置于-20℃保存。
三、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1.将培养液倒至15 ml 离心管中，于2500rpm 离心5 min。
2.弃上清，加入4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm 离心5 min。
弃上清后用PBS 重复洗涤一次。
3.用枪洗干上清后，加100 μ 裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
4.将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃.12000rpm 离心5 min，取上清分装于0.5 ml 离心管中并置于-20℃保存。
（可在蛋白浓度测定结束后用SDS稀释蛋白后再保存）WB-BCA蛋白含量测定一、原理：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。
在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu 2+还原为Cu +，一个Cu +螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
二、产品特点：1.步骤简单，45分钟内完成测定，比经典Lowry法快4倍而且更加方便。
2.灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul 。
3.在50-2000ug/ml浓度范围内有良好的线性关系。
4.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
三、注意事项：1. 蛋白标准品需在全部溶解后先混匀，再稀释再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。
标准品曲线配制时，如果吸量不准确或者加样枪不精确会造成标准曲线相关系数减小，可根据需要使用倍比梯度稀释的方法来配制，或者使用精确度高的加样枪。
2. Solution A和Solution B混合成工作液时可能会有浑浊，但充分振荡混匀后就会消失，成为淡绿色的透明溶液。
3. 需酶标仪一台，测定波长为540-590nm之间，562nm最佳；需96孔板。
如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但是测定蛋白浓度时，需根据测定吸光度的杯子的体积，按比例调整A液，B液和样品的体积。
使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
4. BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。
但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA 低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于1mM.不适用BCA 法时建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
还可以考虑用超纯水稀释，透析/除盐，ACETONE/TCA沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。
5. 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但是切勿过热。
6. 如发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，可试用Bradford法蛋白定量四、操作步骤：1．使用时将Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
2．蛋白标准品(0.5mg/ml BSA)：取10ul蛋白标准品(5mg/ml)稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml。
蛋白样品在什么溶液中，蛋白标准品也宜用什么溶液稀释。
但是为了简便起见，也可以用去离子水，0.9%NaCl或PBS稀释蛋白标准品。
3. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液（μL）0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（μL）20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（μg）0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.04. 加适当体积（1μl）样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升.5. 各孔加入200μL BCA工作液, 37℃放置30分钟。
然后在562nm下酶标仪比色测定。
也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
6. （BCA550）以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线，根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量及浓度，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度。
WB—SDS-PAGE 电泳一、原理：聚丙烯酰氨凝胶（PAGE）电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构，具有分子筛效应。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。
1967年，Shapiro他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂巯基乙醇（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
SDS 是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
由于十二烷基硫酸根带负电，在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
