Westernblot试验技术
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蛋白质印迹法westernblot
蛋白质印迹法蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot蛋白免疫印迹Western Blot类似方法1 Southern Blot 杂交方法类似方法2 Northern Blot 杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴原理与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
⑴分类Western Blot 显色的方法主要有以下几种:i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下(二抗用HRP标记)：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRR 即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
western blot技术
百泰派克生物科技
western blot技术
蛋白印迹（Western Blot，WB）也称免疫印迹，是一种基于抗体的蛋白质分析技术。
利用抗体-抗原的特异性相互作用可以在复杂的蛋白质混合物中识别感兴趣蛋白
（目标蛋白质），以实现感兴趣蛋白的定性和半定量分析，在蛋白质表达水平、抗
体活性、蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰分析中广泛应用。
WB主要包括以下步骤：
（1）样品分离：利用SDS-PAGE分离蛋白混合物；
（2）转膜：将蛋白条带从凝胶转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的蛋白质生物学活性不变。
转移后的
NC膜就称为一个印迹（blot）；
（3）标记鉴定：用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用二抗处理，二抗是指一抗
的抗体。
通常，第二抗体带有特殊标记，当与合适的底物结合时，会产生可检测的荧光信号，信号强度与膜上的目标蛋白的丰度相关。
通过以上步骤，可以捕获与一抗相互结合的感兴趣蛋白，用于判断感兴趣蛋白的存在与否以及一抗与感兴趣蛋白的相互作用分析；此外，还可根据荧光信号强度对目标蛋白进行半定量鉴定，用于蛋白质白表达水平分析。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC提供蛋白质分析服务技术包裹，包括蛋白质定性定量
鉴定、蛋白质相互作用分析以及蛋白质翻译后修饰分析等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
Western blot实验步骤
3.61 112/ 168 5.0/7.5 15-100
1.9/ 4× 分 离 胶 缓 冲 液 3.61 （mL） 10% 过硫酸氨（ L ） 112/
168
TEMED（L） 分离范围（kDa）
5.0/7.5 36-150
3.7/5.5 5 1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 7.染色液：称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入
甲醇450ml，冰乙酸100ml、水650ml。
• 8.脱色液 ：甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水 830ml。 • 9.十二烷基硫酸钠（SDS）溶液:10%(w/v) 1g SDS，10ml去离子水配制，室温保存。
SDS-PAGE 电泳采用 Tris- 甘氨酸系统，即按分子克隆 中Sambrook等的方法（Sambrook, 1989）进行
• PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15 分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲 液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲 醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合； • PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜 可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜 结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它 的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
1.9/ 4× 分 离 胶 缓 冲 液 3.61 （mL） 10% 过硫酸氨（ L ） 112/
168
TEMED（L） 分离范围（kDa）
5.0/7.5 36-150
3.7/5.5 5 1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 7.染色液：称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入
甲醇450ml，冰乙酸100ml、水650ml。
• 8.脱色液 ：甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水 830ml。 • 9.十二烷基硫酸钠（SDS）溶液:10%(w/v) 1g SDS，10ml去离子水配制，室温保存。
SDS-PAGE 电泳采用 Tris- 甘氨酸系统，即按分子克隆 中Sambrook等的方法（Sambrook, 1989）进行
• PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15 分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲 液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲 醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合； • PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜 可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜 结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它 的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
westernblot实验步骤
westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。
注意事项：1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前，必须阻断膜上的未被结合的蛋白质，减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断，以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物，控制反应条件，避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
Westernblot实验技术
Western blot试剂配制1. 30%丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺用温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水（超纯水）溶后定容到100ml，过滤后于棕色瓶中储存0.8gN, N’-亚甲双丙烯酰胺注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反映是光催化或碱催化的，故应核算溶液的pH值不超过7.0。
这一溶液置棕色瓶中贮存于4℃，每隔几个月须重新配制。
小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
2. 10%SDS：称5gSDS，超纯水溶解后，定容到50ml。
贮存液保存于室温。
3. 10%AP（过硫酸铵）：称1gAP，溶于8ml超纯水中，定容到10ml，小量分装（250ul/管）保存于-20℃，过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，每次使用均要用新鲜的。
4. 1.5MTris-HCl：称18.2gTris（Mr=121.14）加50ml超纯水溶解后，用浓HCl调pH值8.8，定容到100ml。
5. 0.5MTris-HCl：称3gTris（Mr=121.14）加25ml超纯水溶解后，调pH值6.8，定容到50ml。
6. TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
一旦加入TEMED，立即开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
7. 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液【10×（25mMTris+0.25M+0.1%SDS）】pH8.330.3g Tris 15.15g Tris187.65g Glycine 溶于超纯水中，定容到1000ml 93.825g Glycine 5×缓冲液10g SDS 5g SDS8. 2×SDS上样缓冲液：2×（50mMTrispH6.8+2%SDS+10%甘油+0.1%溴酚蓝+50mMβ-巯基乙醇）loading buffer10ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8)2g SDS10ml 甘油超纯水定容到50ml。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
western blot技术 ppt课件
•
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14
实验步骤
• 一抗杂交孵育 将一抗用含5%脱脂奶粉的 1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封 闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸 弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。 二抗孵育 二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗 用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度为 1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物 素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀释 液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释液， 用1×TBST洗3次，每次5min。
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7
仪器与设备
• • • • • • 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）
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Western-blot 试验技术
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1
概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。 • 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 • 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。
主要试剂
• • • • • • • • • • • • RIPA（华舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司） 丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）
WesternBlot实验实用技术手册总结
Western Blot 实验技术手册Western Blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。
目前 Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一 .一、 Western Blot 基本操作流程图细胞 / 组织蛋白提取↓ 蛋白定量、蛋白变性上样、电泳↓一转膜↓封闭↓孵育一抗↓洗膜孵育二抗↓洗膜底物孵育↓曝光或显色二. Western Blot 操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接决定着WB 结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。
使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS 漂洗 2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净 PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心 12,000 rpm ，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力），轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80 °C，每约 5 mg 加入约 300 μl预冷的裂解液lysis buffer ，冰浴匀浆后置于4℃摇动 2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml,理想的蛋白浓度应为 1-5 mg/ml). ，4℃离心 12,000 rpm ， 20 min ，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford 法、和 Lorry 法或 BCA 法，一般推荐用 BCA 法 .BCA 测定方法如下:A ．酶标板操作1.标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号 1 2 3 4 5 6 7 8蛋白标准溶液（μL）0 1 2 4 8 12 16 20去离子水（μL）20 19 18 16 12 8 4 0对应蛋白含量（μg）0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.02、根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（ 50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；3、各孔加入 200 μ L BCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。
Western Blot 实验技术
（三） SDS －PAGE 电泳
3.电泳
电泳条件： 推荐：浓缩胶 80V 35——45min 分离胶 120V 45——75min
（三） SDS －PAGE 电泳
4.染色
SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色
（四） 转膜
原理：
蛋白因结合SDS而带电 荷，转膜即在电场作用 下从胶中转至膜上的过 程。
（八）凝胶图像分析
• 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理 系统分析目标带的分子量和净光密度值。 • 常用灰度值分析软件： • Image J、Quantity One、Image-Pro PGE电泳
高背景
条带弱
其
他
western为什么必须做内参
• 要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的 蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才 有比较的基础。特别表达量不高时，上样量误差就很可能 影响结果的分析。所以你需要内参。 • 内参的检测，可以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实 验误差，保证实验结果的准确性 • 常用内参：GAPDH、β -action
Western Blot
Western Blot 实验技术
任华
Western Blot
Western Blot实验原理
• Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子 生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验 方法。其基本原理是把通过特异性抗体对凝胶电泳 处理过的蛋白质变为可见、可分析的灰色条带，通 过分析条带的位置和条带着色深度获得特定蛋白质 在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
很多人的经验是：脱脂牛奶封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋 白则用BSA（因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会干扰的）。
western blot实验内容
western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。
在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。
3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。
膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。
4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。
这些一抗可以结合到目标蛋白质上。
6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。
7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。
二抗与一抗结合，形成复合物。
8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。
9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。
例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。
10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。
通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。
Western blot 实验技术
（2） 检测样品蛋白含量
1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。 室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可 做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测 空白样品。
注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。 • 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一
个孔大约上100ug的总蛋白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 后,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之 蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就 只剩下分子大小一项因素。
5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
6、 测完蛋白含量后，计算含20-50μ蛋白（根据自己的实验需要进行 选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200μl 的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×（上样总体积一般不 超过15μl，加样孔的最大限度可加20μ样品）上样前要将样品于沸水 中煮5-10min使蛋白变性。
封闭
脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
Western-blot技术方法、原理及步骤
Western-blot技术⽅法、原理及步骤Western-blot技术原理：Western Blot技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验步骤：Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是⽤抗体检测蛋⽩的重要⽅法之⼀。
Western可以参考如下步骤进⾏操作。
1. 收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)：使⽤适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋⽩，例如细胞核蛋⽩、细胞浆蛋⽩、线粒体蛋⽩等，可以参考相关⽂献提取这些亚细胞组份蛋⽩，也可以使⽤试剂盒进⾏抽提。
亚细胞组分分离⽅法：（参考）制备组织匀浆（根据组织类型选择不同的匀浆⽅法，进⾏优化）离⼼时间亚细胞组分1,000g X 10 min pellets nuclei（细胞核）heavy mitochondria（线⽴体）plasma membrane sheets（浆膜）3,000g X 10 min heavy mitochondria（线⽴体）plasma membrane fragments（浆膜）6,000g X 10 min Mitochondria（线⽴体）Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）intact Golgi（完整⾼尔基体）10,000g X 10 min Mitochondria（线⽴体）Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）intact Golgi membranes（完整⾼尔基体膜）20,000g X 10 min Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）Golgi membranes（⾼尔基体膜）large dense vesicles（⼤⾼密度囊泡）100,000g X 10 min all vesicles from ER（来⾃内质望⽹的囊泡）plasma membrane（浆膜）Golgi（⾼尔基体）Endosomes（内含体）注：以上⽅法仅做为参考，需根据实验条件进⾏优化。
westernblot原理
westernblot原理
Western Blot（西方印迹法）是一种鉴定蛋白质的细胞生物学实验技术。
它利用电泳
技术将感兴趣的蛋白质从细胞内及外的复杂的混合物环境中分离出来，然后在一特殊条件
下将其用抗体、特异性反应连接物或其他特定标记检测方法检测出来。
Western blot技术的基本原理与免疫学原理一致，即检测抗原的特异性抗体的特性。
例如，当抗原蛋白质混合物中存在特异性的抗原性基因片段时，检测抗原蛋白质的抗体将
特异性地结合到抗原基因片段上，而检测抗原蛋白质混合物中不存在的或者很少存在的其
他抗原性基因片段，则不会被特异性抗体结合，而是被特定标记检测方法检测出来。
Western blot实验技术步骤包括：1）将抗原性蛋白质混合物经过抗体特异性抗原基
因片段的凝集形成蛋白质复合体；2）利用电泳技术将能够形成蛋白质复合体的蛋白质物
质从细胞内和外的复杂环境中分离出来；3）在一定条件下用抗体或其他特定标记检测方
法将这些分离出来的蛋白质物质检测出来，根据检测结果判断各个抗原之间的关系。
Western blot实验技术的优点在于它能够快速、简单的检测抗原性蛋白质的特异性，它也可以检测在细胞内外复杂环境中出现的相对较少的蛋白质物质，尽管抗体的能力有限，受到环境的影响，但仍可以达到较高的检测精度。
由于西方印迹法可分离复杂混合物中不
同的蛋白质，因此它是生物学实验研究中必不可少的一部分，广泛应用于细胞学、分子生
物学和分子遗传学等领域。
Western-blot_试验技术
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白 印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差 一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白 吸附容量高，亲水性较好。 都可以用丽春红染色。 具体使用还要参考相关文献
疑难杂证
• 做western，在分子量很低的位臵总是出现一条很 强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？ 是蛋白降解了吗？ 有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异 也是可能的，关键是你要的位臵出现了吗？ 减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视 具体情况了。
• • •
配制试剂
• 30％Acry-Bis 29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml 配成，避光4℃保存 • 10％过硫酸胺，新鲜配制，<1week 0.1克过硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4℃保存 • 封闭试剂 10×TBS （应用液：1×TBS） 10×TBS：取24.2克Tris－Base 80克氯化钠 用 800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定容至 1000ml 1×TBS：取10×TBS 50ml，稀释至500ml，临用 前加0.1％Tween 20，500ul。
•
实验步骤
• 显影：将膜臵入10ml LumiGLO溶液中 （10ml LumiGLO溶液配方为：0.5ml 20×LumiGLO、0.5ml 20×Peroxide、 9.0ml Milli-Q water），室温轻摇1分钟， 注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大 小的胶片，压在暗盒中，约1min；将胶片 放在显影液中洗1-5min；水冲洗；定影液 中洗2-5min；水冲洗，可在相应位臵见到 目的条带。
配制试剂
• 4×SDS Sample Buffer 2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中，调pH6.8 8克SDS 0.4克溴酚兰 定容至100ml 40ml甘油 10ml DTT贮存液 • 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后20℃保存，分装成1ml。 • 考马斯亮兰染液： 45ml 甲醇 45ml 水 用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质 10ml 冰乙酸 0.25克 考马斯亮兰R250
疑难杂证
• 做western，在分子量很低的位臵总是出现一条很 强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？ 是蛋白降解了吗？ 有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异 也是可能的，关键是你要的位臵出现了吗？ 减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视 具体情况了。
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配制试剂
• 30％Acry-Bis 29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml 配成，避光4℃保存 • 10％过硫酸胺，新鲜配制，<1week 0.1克过硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4℃保存 • 封闭试剂 10×TBS （应用液：1×TBS） 10×TBS：取24.2克Tris－Base 80克氯化钠 用 800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定容至 1000ml 1×TBS：取10×TBS 50ml，稀释至500ml，临用 前加0.1％Tween 20，500ul。
•
实验步骤
• 显影：将膜臵入10ml LumiGLO溶液中 （10ml LumiGLO溶液配方为：0.5ml 20×LumiGLO、0.5ml 20×Peroxide、 9.0ml Milli-Q water），室温轻摇1分钟， 注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大 小的胶片，压在暗盒中，约1min；将胶片 放在显影液中洗1-5min；水冲洗；定影液 中洗2-5min；水冲洗，可在相应位臵见到 目的条带。
配制试剂
• 4×SDS Sample Buffer 2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中，调pH6.8 8克SDS 0.4克溴酚兰 定容至100ml 40ml甘油 10ml DTT贮存液 • 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后20℃保存，分装成1ml。 • 考马斯亮兰染液： 45ml 甲醇 45ml 水 用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质 10ml 冰乙酸 0.25克 考马斯亮兰R250
western-blot的原理及应用
Western Blot的原理及应用1. Western Blot的简介Western Blot，又称蛋白印迹法，是一种常用的蛋白质检测技术。
通过将待检的蛋白质样品分离、转移至膜上、以特定抗体探针探测目标蛋白质，然后用染色剂标记抗体来可视化目标蛋白。
2. Western Blot的原理Western Blot技术主要分为以下几个步骤：2.1 电泳分离将待检样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据蛋白质大小和电荷来确定聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型（SDS-PAGE、Native-PAGE等）。
2.2 转移将电泳分离出的蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的转移方式包括湿式转移、半湿式转移和干式转移。
2.3 阻断使用适当的缓冲液对膜进行阻断，如牛奶、BSA等，用于防止非特异性结合。
2.4 探测抗体加入特异性一抗，与目标蛋白质结合。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以选择根据实验需求选择。
2.5 二抗探针加入与一抗来源不同动物的二抗探针，例如兔子抗鼠二抗或羊抗兔子二抗等，二抗探针会与一抗结合。
2.6 可视化通过染色剂等方法来可视化目标蛋白质，常用的方法有辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体与发光底物反应产生发光，或使用染色剂如染蓝等。
3. Western Blot的应用Western Blot技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括：3.1 蛋白质鉴定与定量Western Blot技术可以快速鉴定蛋白质的存在与纯度，通过与已知标准蛋白质比较可以进行定量分析。
3.2 抗体检测和验证通过Western Blot可以检测抗体的特异性和亲和力，验证抗体的质量和功能。
3.3 蛋白质翻译后修饰的研究Western Blot可以用于检测蛋白质的磷酸化、甲基化、酰化等翻译后修饰，帮助我们了解蛋白质功能的调控机制。
3.4 疾病诊断和治疗研究Western Blot在临床疾病的诊断和治疗研究中起着重要作用，如肿瘤标志物的检测、药物疗效的评估等。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
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Western blot 实验技术
定义：
? 印迹法（ blotting ）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
? 1975年，Southern 建立了将 DNA转移到硝酸纤维素膜（ NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的 DNA片段的方法，称为 Southern 印迹法。
? 而后人们用类似的方法，对 RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分析称为 Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为 Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 称为 Eastern 印迹法
Western Blot 基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
SDS－PAGE 电泳
? （1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾 干。
? （2） 灌胶与上样
1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（ 可以用 1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重 复一次，这样可以保证基本不漏胶）
注意事项
? 细胞裂解液的量 ? 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。 ? 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一
个孔大约上100ug的总蛋白。 ? 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 ? 未知蛋白应同时作阳性对照。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 后,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之 蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就 只剩下分子大小一项因素。
（2） 检测样品蛋白含量
? 1、 取足量的 1.5ml离心管，每管加入 4℃储存的考马斯亮蓝溶液 1ml。 室温放置30min后即可用于测蛋白。
? 2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可 做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测 空白样品。
凝胶成份
? 丙烯酰胺和N,N' -亚甲双丙烯酰胺 ? SDS ? 配胶的Tris缓冲液 ? TEMED（四甲基乙二胺） ? 过硫酸铵(时间) ? Tris-甘氨酸电泳缓冲液
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（ KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌 胶时，可用 10ml 枪吸取 5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线 高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时 开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要 沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶 会被冲变型。）
Western Blot一般流程
? 蛋白样品的制备 ? SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
?转膜 ?封闭 ?一抗孵育 ?洗膜 ?பைடு நூலகம்抗孵育 ?洗膜 ?底物显色
蛋白样品制备
（1） 单层贴壁细胞蛋白的提取： 1、倒掉培养液，按每培养皿细胞加4ml 4℃预冷的PBS 洗涤三次。 2、每培养皿细胞加入500ul含PMSF，cocktail的裂解液 ，于冰上裂解10min，为使细胞充分裂解培养皿要经
? 3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯 2次（每次0.5ml），再用无菌 水洗一次。
? 4、 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待测蛋白 样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
? 注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗 2次，无菌水洗一次。 可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很 多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。
常来回摇动。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液 混合）
3、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（ 动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离 心机预冷）（整个操作尽量在冰上进行。）
4、将离心后的上清分装转移并放于－80℃保存。
（2）组织中总蛋白的提取：
1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净 的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400ull单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中， 进行匀浆。然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组 织尽量碾碎。
4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离 心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分 装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（3） 我们实验室常用方法：
1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min 。 2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后
2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 3、用枪洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上
裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂 解。 4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－ 20℃保存。
蛋白浓度的测定--
? 1、 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 ? 2、 取18个1.5ml 离心管， 3个一组，分别标记为 0μg，2.5μg，5.0μg
，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。 ? 3、 按下表在各管中加入各种试剂。
? 4、 混匀后，室温放置 2min。在生物分光光度计上比色 分析。
定义：
? 印迹法（ blotting ）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
? 1975年，Southern 建立了将 DNA转移到硝酸纤维素膜（ NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的 DNA片段的方法，称为 Southern 印迹法。
? 而后人们用类似的方法，对 RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分析称为 Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为 Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 称为 Eastern 印迹法
Western Blot 基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
SDS－PAGE 电泳
? （1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾 干。
? （2） 灌胶与上样
1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（ 可以用 1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重 复一次，这样可以保证基本不漏胶）
注意事项
? 细胞裂解液的量 ? 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。 ? 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一
个孔大约上100ug的总蛋白。 ? 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 ? 未知蛋白应同时作阳性对照。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 后,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之 蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就 只剩下分子大小一项因素。
（2） 检测样品蛋白含量
? 1、 取足量的 1.5ml离心管，每管加入 4℃储存的考马斯亮蓝溶液 1ml。 室温放置30min后即可用于测蛋白。
? 2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可 做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测 空白样品。
凝胶成份
? 丙烯酰胺和N,N' -亚甲双丙烯酰胺 ? SDS ? 配胶的Tris缓冲液 ? TEMED（四甲基乙二胺） ? 过硫酸铵(时间) ? Tris-甘氨酸电泳缓冲液
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（ KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌 胶时，可用 10ml 枪吸取 5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线 高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时 开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要 沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶 会被冲变型。）
Western Blot一般流程
? 蛋白样品的制备 ? SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
?转膜 ?封闭 ?一抗孵育 ?洗膜 ?பைடு நூலகம்抗孵育 ?洗膜 ?底物显色
蛋白样品制备
（1） 单层贴壁细胞蛋白的提取： 1、倒掉培养液，按每培养皿细胞加4ml 4℃预冷的PBS 洗涤三次。 2、每培养皿细胞加入500ul含PMSF，cocktail的裂解液 ，于冰上裂解10min，为使细胞充分裂解培养皿要经
? 3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯 2次（每次0.5ml），再用无菌 水洗一次。
? 4、 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待测蛋白 样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
? 注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗 2次，无菌水洗一次。 可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很 多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。
常来回摇动。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液 混合）
3、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（ 动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离 心机预冷）（整个操作尽量在冰上进行。）
4、将离心后的上清分装转移并放于－80℃保存。
（2）组织中总蛋白的提取：
1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净 的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400ull单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中， 进行匀浆。然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组 织尽量碾碎。
4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离 心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分 装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（3） 我们实验室常用方法：
1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min 。 2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后
2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 3、用枪洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上
裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂 解。 4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－ 20℃保存。
蛋白浓度的测定--
? 1、 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 ? 2、 取18个1.5ml 离心管， 3个一组，分别标记为 0μg，2.5μg，5.0μg
，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。 ? 3、 按下表在各管中加入各种试剂。
? 4、 混匀后，室温放置 2min。在生物分光光度计上比色 分析。