03细胞培养 第三章 培养用液

PBS（Phosphate-Buffered Sallines）
KCl KH2PO4 NaCl 0.20g 0.20g 8.00g
Na2HPO4·7H2O
2.16g
DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型
CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙) KCl KH2PO4 MgCl2· 2O 6H NaCl Na2HPO4· 2O 7H 0.10g 0.20g 0.20g 0.10g 8.00g 2.16g


血清中的沉淀物


絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血 清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响 血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血 清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀 物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认 为血清受污染。一般情况下，此小黑点不 会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量， 则应立即停止使用，更换另一批号的血清
D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)
KCl KH2PO4 NaCl NaCO3 Na2HPO4
0.40g 0.06g 8.00g 0.35g 0.048g
D-Glucose
Phenol Red
1.00g
0.01g
第二节

培养基
：
精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、 苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸 （均为Ｌ型）。
2.碳水化合物：葡萄糖 3.维生素：叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、
硫胺素等。
4.无机离子与微量元素：
二、培养基的分类：


1、天然培养基：即组织提取物和体液。 如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液 等。 2、合成培养基:需要添加血清培养细胞。 3、无血清培养基 不需要添加血清就可维持细胞在体外 较长时间生长繁殖的合成培养基。
注意：

尽管很多实验室在细胞系的培养基中常规 加入抗生素作继代培养，但仍建议不要在 原代培养中加入抗生素。
酚红

大多数培养液中使用酚红作为pH 指示

红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色 表示碱性pH 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固 醇激素（尤其是雌激素）样作用

在一些特殊培养液中不含酚红
其他培养用液

１、消化液 （1）胰酶(trypsin)溶液：
浓度一般为0.1％～0.25％
配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液
（2）EDTA溶液：
使用浓度为0.02%；可与胰酶的混合使用

一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用， 而且毒性小，价格低廉，使用方便

常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲 洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长
第三章 培 养 用 液


培养用液是维护组织细胞生存、生长及进 行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶 液。 主要包括 平衡盐溶液
天然培养基 培养基 合成培养基
其他培养用液
第一节 水和平衡盐溶液

1、水：细胞培养用水必须非常纯净，不 含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜(一周内）的三蒸水或纯净水

2、平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）


血清的主要作用
(1)提供基本营养物质
(2)提供贴壁和扩展因子
(3)提供激素及各种生长因子
(4)提供结合蛋白 (5)对培养中的细胞提供某些保护作用





细胞培养中使用血清的缺点 (1)有可能改变某种细胞在体内的正常状态 (2)血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作 用 (3)每批血清之间都有差别,其成分不能保持一 致。 (4)取材过程有可能带入支原体、病毒，对培 养的细胞产生潜在影响 (5)直接影响某些实验，如生长因子的检测
２、谷氨酰胺补充液 合成培养基中必需成分，但容易降解，所以 都是在使用前添加。 谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配 制为100倍浓缩液，配制时应加温至30℃，完全 溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于-20℃。 3、pH调整液 常用的有 HEPES液 NaHC03

NaHCO3 溶液（常用）
组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持 渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的无 机离子成分；用于洗涤组织、细胞等



几种常用的平衡盐溶液：主要由无机盐、葡萄 糖组成 Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hank’s、DHank’s、Dulbecco（都有相应配方） 最简单的BSS是Ringer。D-Hank’s与Hank’s的一 个主要区别在于前者不含有Ca2+、Mg2+ ，因此DHank’s常用于配制胰酶溶液。 配制平衡盐溶液也应当用新鲜的三蒸水。配好 的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温高压灭菌。 有浑浊或沉淀时，应重新配制

血清的使用与储存
(1)使用前的处理：血清在使用前通常在 56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。
热灭活目的：灭活血清中的补体成分。
对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清 可条件：
血清一般储存于－20℃,同时应避免反复冻融 大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分 装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于20℃，使用前融化。 融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快 使用。
血清：




细胞在单纯的基础培养基中不能存活,基 础培养基中常常要添加血清，添加血清后 的培养基被称为“完全培养基”。 血清终浓度多为5％－20%。最常用的是 10%。 广泛应用的血清种类有马血清与牛血清， 后者又分为胎牛血清、新生牛血清与小牛 血清。 胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新生牛血 清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血 清取自出生10～30天的小牛
四、培养基的配制：
（1）认真阅读说明书。 （2）配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰 胺等物质都要在培养基完全溶解之后才能 添加。 （3）配制所用的水应为三蒸水，离子浓度很 低，水电阻达30万Ω以上。 （4）所用器皿应十分洁净。 （5）配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于 4℃。
DMEM培养液的配制（举例）

常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过 滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸， 对细胞无毒性 防止培养基pH迅速变动。

HEPES（分子量238.31）溶液



主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养 条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境， CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此 时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时 要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L




(溶解)900 mL ddH2O于1000 mL烧杯中，将 DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50 mL ddH2O分 次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶 解。 （调PH）用5％－10％的NaHCO3调pH至7.2 （加抗生素）加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL （过滤除菌）用0.22um的滤膜过滤除菌。 （分装保存）分装（200 mL左右）后4℃冰箱 保存。

常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克 HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。 使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液， 终浓度为20mmol/L
４、抗生素液



青、链霉素的配制及使用浓度 青霉素80万U加Hank’s液至80 mL，浓度1万u/ mL 链霉素100万U（相当于1g）加Hank’s液至100 mL，浓度10mg/mL 分装后至-20℃冰箱保存 使用浓度：青霉素－ 100u/mL 链霉素100ug/mL

市场上可提供干粉培养基和液体培养基

干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优 点是价格便宜。缺点是配制过程比较繁琐， 质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产， 不仅质量得到保证，而且使用十分方便，但 比较昂贵。
RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准 型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、 M199、F10等
EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡盐溶液溶解 后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4℃冰箱保存

（3）胶原酶(collagenase)溶液：
使用浓度为0.1～0.3mg／L或200000U／L， 作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、 Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。
胶原酶作用温和，不易对细胞产生损伤。 在上皮类细胞原代培养时经常使用 缺点：价格昂贵
培养基就是人工模拟细胞在体内生长的营 养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提 供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基 础 细胞培养基的基本要求: 体外培养的细胞 直接生活在培养基中，因此培养基应能满 足细胞对营养成分、促生长因子、激素、 渗透压、pH等诸多方面的要求。

一、培养基中主要的成分包括
1.氨基酸：


常用的培养基种类

三、如何选择培养基？



(1)建立某种细胞株所用的培养基应该是培 养这种细胞首选的培养基。 (2)本实验室惯用的培养基 (3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择 培养基 (4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生 长状态，可用生长曲线、集落形成率等指标 判断，根据试验结果选择最佳培养基