1640细胞培养液的配制

K562细胞培养实验实验人员：刘嵘、郝茜、张寅峰、龙琪实验材料：K562细胞，无菌RPMI-1640培养基，无菌离心管，无菌吸管，无菌培养瓶，离心机，倒置显微镜，超净工作台，CO2培养箱。

培养基成分：培养液由90%不完全1640培养液[RPMI-1640液95毫升；0.1M丙酮酸钠1毫升；0.2M谷氨酰胺1毫升；1M HEPES 1毫升；7.5%NaHCO3 1毫升；青霉素、链霉素（各一万单位）1毫升]和10%灭活胎牛或新生牛血清。

细胞培养操作：一、细胞冻存与复苏：细胞冻存实验步骤1、将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。

5、将冻存管口封严。

如用安郶瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。

冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4o C(20分钟)→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（-30o C 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮细胞复苏实验步骤：1、取出贮存细胞，37o C水浴中快速融化。

2、把1-2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。

3、以大约800rpm离心2到3分钟，弃去上清。

4、在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。

5、细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。

二、细胞培养与传代：1、将细胞培养液转移到离心管中，离心800-1000rpm,5min。

2、去除上清。

3、加入1ml培养基到离心管内，用吹打使细胞悬浮。

4、将细胞悬液吸出，加入到已加入8ml培养基的新的已灭菌培养瓶中。

5、在倒置显微镜中观察瓶中细胞密度是否适中6、旋开半圈培养瓶口，放入CO2培养箱中培养7、观察并适时传代实验结果：b)细胞传代一次时间：其中，第四代（5.20上午-5.22晚上）细胞密度低，生长繁殖时间最长；第五六和第八代细胞生长繁殖一代耗时时间最短，且最终细胞密度也最大，以致培养基变黄。

遗传学重点1.人类染色体的形态染色体的形态、结构特征在细胞周期中，以细胞分裂中期最为典型，称为中期染色体。

每一个中期染色体均由两条染色单体构成，每一条染色单体由一个DNA分子螺旋而成。

两条染色单体互称为姐妹染色单体。

两条染色单体通过一个着丝粒彼此连接。

着丝粒将染色体分为两部分，长臂（q）和短臂（p）。

其它结构有随体、次缢痕、主缢痕和端粒。

总结：染色体的两端为端粒，是一种蛋白-DNA结构，含有TTAGGG六核苷酸重复延伸序列，保护染色体不被降解，防止染色体末端融合，端粒缩短与细胞的寿命有关。

近端着丝粒染色体（13～15，21、22和Y）除Y以外都具有随体，位于短臂末端介细丝连接的球状小体，细丝部位是rDNAgene所在部位，转录rRNA 进而形成核仁。

人类染色体的多态性常见部位Y染色体的长度变异D组、G组近端着丝粒染色体的短臂、随体及随体柄部次缢痕区（NOR）的变异第1、9和16号染色体次缢痕的变异2.人类染色体的类型根据着丝粒的位置可将染色体分为3类：中央着丝粒染色体1/2 （metacentric chromosome）亚中着丝粒染色体5/8 （submetacentric chromosome）近端着丝粒染色体7/8 （acrocentric chromosome）划分的标准有：①臂比值r（长臂长/短臂长）②着丝粒指数i[(短臂长/染色体长)×100%]③短臂长臂比3.人类染色体的分组根据人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN），依据染色体的形态、大小和着丝粒的位置，将染色体分为七组：A、B、C、D、E、F、G等，从1号~22号有44条男女共有的染色体叫常染色体，按从大到小排列，X和Y染色体称为性染色体。

染色体总数，性染色体正常男性：46 ，XY ；正常女性：46 ，XX性别决定及性染色体：●人类性别是由细胞中的性染色体所决定的性染色体（sex chromosome）●性别决定区域Y（sex-determining region Y，SRY）●睾丸决定因子（testis-determining factor，TDF）人类染色体核型分组及形态特征组序染色体编号形态大小着丝粒位置随体次缢痕鉴别程度A 1~3 最大1,3中央无1常见可鉴定2亚中B 4~5 次大亚中无不易区分C 6~12,X 中等亚中无9常见不易区分D 13~15 中等近端有13偶见不易区分E 16~18 小16中央无16常见可鉴定17,18亚中F 19~20 次小中央无不易区分G 21~22,Y 最小近端有不易区分4.人类染色体命名国际体制：概念：界标（landmark）、区（region）、带（band）亚带、亚亚带描述一特定带时需要写明以下4个内容：①染色体序号；②臂的符号；③区的序号；④带的序号5.染色体畸变由于内部或外部的原因，致使染色体数目或结构发生改变，即染色体畸变。

主要有分离淋巴细胞、补液、装袋、分袋、收获等步骤。

细胞培养日程如下：第一天分离淋巴细胞第四天补液50ml第五天补液140ml第六天装袋第十天第一次分袋第十四天第一次收获第二次分袋第二十天第二次收获第三次分袋第二十六天第三次收获1 分离淋巴细胞以100ml外周血为例，如血量不同，可按此操作规程做相应调整。

①患者100ml外周血，室温1200rpm离心10分钟（刹车ON）。

将上层血浆转入离心管-40℃保存。

②用生理盐水1：1稀释血细胞沉淀(生理盐水：原全血体积=1：1)，用移液管吹打混匀后小心加到用50ml离心管分装的15ml Ficoll层上，使分层保持清晰，每管约35ml。

室温2000rpm离心20分钟（刹车OFF）。

③尽量吸尽两液面交接处的细胞层，均分到3个干净的50ml离心管中，用RPMI-1640液补充至50ml混匀，室温1600rpm离心10分钟（刹车ON）。

④倾去上清，将各离心管细胞沉淀振荡开后用10mlRPMI-1640悬浮合并为一管，混匀后取10μl与Turk工作液（1:10）混合，避光反应15min后再加10μl胎盘兰10倍稀释计数。

剩余液体再加RPMI-1640至50ml，室温1200rpm离心10分钟（刹车ON）。

⑤倾去上清，将细胞沉淀振荡后加RPMI-1640培养液50ml重悬，室温1000rpm离心10分钟（刹车ON）。

⑥弃上清，振开管底细胞沉淀后用细胞培养基50ml重悬细胞。

取一新的细胞培养瓶，用移液管吸干瓶中的缓冲液。

将细胞加到培养瓶中，同时加入800μgSM蛋白。

将内有细胞悬液的培养瓶放入CO2培养箱，拧松瓶盖，查看培养箱状态，确保正常。

温度：37±℃、湿度：大于90％、CO2浓度：7.5±0.5％⑦计算细胞密度及细胞数量细胞浓度(个/ml)=N/4×稀释总倍数×104细胞数量(个)=细胞浓度(个/ml)×细胞悬液总体积(ml)起始培养细胞数量应控制在2-3×107以上。

关于RPMI 1640细胞培养液的配制1)配制培养基最好使用新制备的三蒸水。

一般在试验前当天或前一天制备为好。

调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。

2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。

3)溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。

振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。

4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES 等其他试剂。

5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。

市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。

市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。

无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。

6) 调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％ NaHCO3调节pH到7.2。

7) 过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。

注意滤膜正面（光面）朝上。

过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。

8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。

临用前将加入小牛血清(10%~20%)。

【注意事项】每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。

市售小牛血清使用前都应该灭活（56℃，30min），以消除补体活性。

动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。

优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。

生化检测总蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。

【精华】细胞培养常用液体配置细胞冻存！/bbs/post/view?bid=66&id=1075571&sty=1&tpg=1&age=0求助：1%的胰蛋白酶如何配置成0。

25%的？急！/bbs/post/view?bid=66&id=1601091&sty=1&tpg=1&age=0求助海马神经元的培养基配方/bbs/post/view?bid=66&id=1876036&sty=1&tpg=1&age=0【求助】活性碳-葡聚糖苷处理过的胎牛血清问题/bbs/post/view?bid=66&id=1566352&sty=1&tpg=1&age=0谁知道加了小牛血清的1640还能过滤吗？/bbs/post/view?bid=66&id=1936251&sty=1&tpg=1&age=0求助！/bbs/post/view?bid=66&id=1730359&sty=1&tpg=1&age=0小急！乳鼠心肌细胞培养时配胰蛋白酶没调PH值/bbs/post/view?bid=66&id=1949765&sty=1&tpg=1&age=0配ＤＭＥＭ时直接添加粉剂ＮＡＨＣＯ３可以吗？/bbs/post/view?bid=66&id=1949670&sty=1&tpg=1&age=0冻存液怎么配置？/bbs/post/view?bid=66&id=1633674&sty=1&tpg=1&age=0求助乳鼠心肌细胞培养的D-HANKS液配方DMEM液和DMEM/F12液/bbs/post/view?bid=66&id=1888172&sty=1&tpg=1&age=0请教心肌细胞的消化！/bbs/post/view?bid=66&id=1913926&sty=1&tpg=1&age=0求助：急需知道/bbs/post/view?bid=66&id=1941147&sty=1&tpg=1&age=0胞内钙测定/bbs/post/view?bid=66&id=1130119&sty=1&tpg=1&age=0<共享>双抗的配置方法/bbs/post/view?bid=66&id=1933663&sty=1&tpg=1&age=0请教0.1%透明质酸酶的配制/bbs/post/view?bid=66&id=1927260&sty=1&tpg=1&age=0请教高人：关于PBS配方及浓度的问题/bbs/post/view?bid=66&id=1655901&sty=1&tpg=1&age=0【请教】培养基、血清长时间放在37度水浴箱内，还能用吗？/bbs/post/view?bid=66&id=1922789&sty=1&tpg=1&age=0关于1640液的配置/bbs/post/view?bid=66&id=1096940&sty=1&tpg=1&age=0 弱弱地问：EDTA《资源》说明书上关于1640的配置/bbs/post/view?bid=66&id=1906137&sty=1&tpg=1&age=0细胞培养常用液体配制/bbs/post/view?bid=66&id=400040&sty=1&tpg=1&age=0细胞培养用的PBS应该如何处理。

细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。

配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO孵箱（孵育培养物）、2水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

二.无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。

2.CO孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者20.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。

2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。

无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。

3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。

如吸管不能碰到废液缸。

6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

三.器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：(1)新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒原代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。

加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

原代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。

2. 掌握常用的灭菌方法。

3. 了解每种培养用液的作用。

【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。

PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。

培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。

鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。

胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。

EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。

细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。

【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。

每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。

人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。

二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。

所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。

核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。

通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。

在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。

组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。

将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。

这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。

染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。

根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。

对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。

细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。

（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。

(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。

(4)调节pH值至7.2~7.4。

(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。

此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。

(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。

（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。

配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。

3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。