细胞培养溶液配制

含软脂酸的细胞培养液如何配制本人想用含软脂酸的细胞培养液处理细胞以观察软脂酸对细胞的影响，但软脂酸是不溶于水的，查了一些文献但说的都不够清楚，想请教一下曾配制过这种培养液的朋友。

谢谢如果是游离脂肪酸，一般浓度都不会很高，大部分是umol/L。

配制前，现用乙醇或石油醚溶解一定质量的脂肪酸，装进一个干净的瓶子中。

氮气吹干，然后用0.15M KOH溶解。

即可以使用。

如果你需要使用BSA，则事先和溶解于PBS中定量的BSA溶液按比例混合。

祝实验顺利！是的我想用的浓度是250umol/L 、500umol/L,也有可能用2mmol/L。

请问为什么要用氮气吹干呢，用超净工作台上的风把它吹干行吗，先将其溶解又将其吹干的道理是什么？我的确是要用BSA，您说“如果需要使用BSA，则事先和溶解于PBS中定量的BSA溶液按比例混合”，这个事先是什么意思？是不是说在用乙醇之前，另外乙醇的浓度是用多大的？还有按比例混合是按多大的比例呢。

linliangsong这位朋友能给详细解释一下吗？我还看到一些文献上说用蛋白吸附的机理来溶解游离脂肪酸，请问是否就是您告诉我的这个办法呢？哈哈，这个问题困惑了我好久，因为我的实验也是在培养基中加入脂肪酸。

为此问题专门阅读了大量的文献。

发现，国外几乎普遍的做法都是上面我向你介绍的那种。

因为我的脂肪酸特别少，只买了几十毫克，根本没有办法用天平称量，所以就全部拿来配溶液。

首先是用乙醇溶解试剂瓶中那点几乎肉眼看不到的脂肪酸，然后将其全部转移到一个具塞小试剂瓶中。

氮气吹干，用0.15M KOH溶液溶解。

我用的是fatty acie free BSA组分V。

文献中一般说明脂肪酸和BSA的摩尔比4：1。

所以将定量溶解于PBS中的BSA与脂肪酸溶液按照这个比例原则进行混合，制成高浓度的母液。

然后再按照试验要求，添加到培养基中。

其中氮气吹干在一定程度上起到保护的作用。

谢谢这位朋友，我算是问对了人。

我还想请问你一下你的FFA 和fatty acie free BSA是从哪里买的，我查了许多国内外文献几乎都是在SIBMA公司买的，而我在SIGMA公司的产品目录上看到最小的包装也是10g,而你知道我们做细胞培养只需要配umol/L数量级的浓度，所需量很少。

细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。

配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO孵箱（孵育培养物）、2水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

二.无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。

2.CO孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者20.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。

2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。

无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。

3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。

如吸管不能碰到废液缸。

6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

三.器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：(1)新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。

2. 掌握常用的灭菌方法。

3. 了解每种培养用液的作用。

【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。

PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。

培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。

鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。

胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。

EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。

细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。

【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。

每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。

293细胞培养1.培养基DMEM ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：（1）37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。

3. 传代吸出旧培基，加5mlPBS洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滚2遍吸出，37度放1min左右计时，看到变圆即加入新培基吹打，几下就好了，分到新瓶里。

我个人认为：293细胞贴壁后形成圆形，可能是细胞本身状态不是很好，细胞不够饱满，细胞的贴壁后的棱角不易显露出来，所以看上去类似圆形，而且细胞较小。

293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。

它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。

293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。

哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。

这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。

293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。

单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。

一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。

严禁过度生长，这点很重要。

因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。

悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。

293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。

293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。

一般用高糖的DMEM培养基。

2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。

BHK-21传代细胞培养BHK是仓鼠肾细胞[原理]细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

[材料和试剂]1、细胞：贴壁BHK-21细胞株2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等[操作步骤]1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。

用7.5%的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。

2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。

4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。

约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。

5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两到三瓶。

塞好胶塞，置37℃温箱中继续培养。

细胞培养常用溶液的配制一、青、链霉素溶液青霉素钠盐(80万IU／瓶) 5瓶链霉素(100万IU／瓶) 4瓶将两者溶于400ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-20℃保存。

双抗在培养基中的终浓度为100IU/ml为宜。

二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制称取碳酸氢钠7.5g，加入超纯水使总体积为100ml。

高压灭菌，分装于小瓶中，4℃贮存。

三、1%酚红溶液的配制首先配制1mol/L的NaOH溶液。

称取NaOH4.0g，加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4℃贮存（最好现用现配）。

配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g 酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH（不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml，高压消毒，在室温或4℃贮存。

四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制氯化钠8.0g氯化钾0.2g柠檬酸钠(Na3C6H5O7•5H2O) 1.12g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0.056g碳酸氢钠 1.0g葡萄糖 1.0g胰蛋白酶（1：250） 2.5g超纯水加至1000ml放4℃冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20℃保存。

细胞培养液配制的流程
细胞培养液配制的流程：
①材料准备：
- 准备所需的所有化学试剂、培养基粉末、抗生素、血清、pH指示剂、无菌水或三蒸水。

②滤器消毒：
- 准备0.45μm和0.22μm孔径的滤膜，浸入三蒸水中，然后置于滤器上，打包后进行高压蒸汽灭菌。

③容器准备：
- 确保所有使用的容器（如烧杯、量筒、移液管等）都是干净且无菌的。

④溶解培养基：
- 将培养基粉末倒入无菌容器中，加入预热的三蒸水，使用磁力搅拌器充分搅拌直至完全溶解。

⑤添加补充成分：
- 按照实验需求，向溶解的培养基中加入nahco3、抗生素（如青霉素和链霉素）、L-谷氨酰胺等成分。

⑥加入血清：
- 如果配方需要，加入胎牛血清或其他类型的血清，通常为10%或20%体积比。

⑦ pH调节：
- 使用pH计检测溶液的pH值，根据需要加入1N HCl或1N NaOH进行调节，直至达到目标pH值。

⑧温度控制：
- 将配制好的培养液加热至接近细胞培养的温度（37°C左右），以防止温度骤变影响细胞。

⑨过滤除菌：
- 通过0.22μm孔径的滤器过滤培养液，以除去任何可能存在的微生物。

⑩分装：
- 将过滤后的培养液转移到无菌的细胞培养瓶或培养皿中，避免空气中的微生物污染。

⑪标记与记录：
- 在容器上标记培养液的类型、批号、配制日期以及有效期，并记录所
有操作细节。

⑫储存：
- 将配制好的培养液储存在适当的温度下，通常是4°C，直到使用前再恢复至室温或培养温度。

L02细胞培养--复苏/传代/转染/计数/冻存主要试剂：1.培养基：RPMI1640（gibico）2.胎牛血清（天津灏洋）3.质粒小抽试剂盒（美国Omega生物技术公司）4.Lip2000（invirtrogen）5.0.25% 胰酶EDTA溶液：0.25 g 胰蛋白酶0.02 g EDTA-Na2溶解于100 mL冰冷PBS中，0.22 m滤器过滤，-20℃分装保存。

6.细胞冻存液：10% DMSO加全血清。

7.青链霉素混合液（100×）（天津灏洋）8.10×PBS80gNaCL，2gKCL，2.4gKH2PO4，14.4gNa2PO4·H2O溶解于800ml双蒸水中定容至1L。

【复苏：】细胞复苏的原则：快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

（一）实验前准备：1、将水浴锅预热至37℃2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3.、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等4、将RPMI1640培养液、胎牛血清、从4℃冰箱拿出5、配制适量含10％的胎牛血清及青莲霉素混合液（1×）的完全培养液放入4℃冰箱内备用。

（二）细胞复苏：1.取液氮中冻存细胞，于37°C水浴锅中不断的摇动，使管中的液体在1min 内迅速融化，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，拿入超净台内，将冻存管内细胞吹打混匀后吸入10ml离心管内，缓慢加入5-8 ml含胎牛血清和青链霉素的完全培养液。

2.离心机内配平离心，1000 r/min 离心5min，吸弃上清液，将剩余细胞吹打混匀制成悬液转移入培养瓶内，加入完全培养液6ml，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内孵育。

【消化及传代】1.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

常用细胞培养基配方及缓冲液细胞培养基是为了在体外维持细胞生长和增殖所设计的一种营养液。

细胞培养基的配方要求提供细胞所需的基本营养物质，如氨基酸、糖类、维生素和激素，并提供适当的pH和离子平衡。

同时，缓冲液也是细胞培养过程中不可或缺的一部分，用于稳定细胞培养基的pH，维持细胞正常的生长环境。

下面列举几种常用的细胞培养基配方及缓冲液：1. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)-细胞培养基配方：-DMEM培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：无2. RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute Medium) -细胞培养基配方：-RPMI1640培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)溶液，浓度为25mM，用于稳定pH。

3. MEM (Minimum Essential Medium)-细胞培养基配方：-MEM培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)- 缓冲液：盐酸/NaOH缓冲体系，通常用NaHCO3/N-2-羟乙基piperazine-N'-2-乙磺酸(HEPES)缓冲。

4. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)-细胞培养基配方：-HBSS培养基粉末-对应体积的无菌水-缓冲液：无5. L-15 Medium (Leibovitz's L-15 Medium)-细胞培养基配方：-L-15培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-缓冲液：HEPES溶液，浓度为25mM。

6. DMEM/F12 Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham's F-12 Medium)-细胞培养基配方：-DMEM/F12培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：HEPES溶液，浓度为25mM。

高浓度的NaHCO3，常用10%的CO2来平衡。 2.血清 血清添加终浓度一般为5~20%。 3.无血清培养基 • 无血清培养基用化学添加剂（包括某些动物来源的蛋 白质）维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中 添加血清。
细胞培养基配制
• 目前在国内市场主要是干粉型，配制培养基要注意以下 问题：
• 1）认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分， 常见的有NaHCO3、谷氨酰胺（3%Gln）、丙酮酸钠、 HEPES等。这些成分有些时必须添加的，如NaHCO3、谷 氨酰胺，有些根据实验需要决定。
• 3.贴壁生长细胞传代
• 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋 白酶液。
（二）细胞的冻存
• 细胞冻存与细胞传代保存相 比可以减少人力、经费，减 少污染，减少细胞生物学特 性变化。
细胞冻存的原理
• 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器 脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形 成冰晶。
• 2）配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质 都要等培养基完全溶解之后才能添加。
• 3）配制所用的水应是当天制备的三蒸水。
• 4）所用器皿应严格消毒。 • 5）配制好的培养基应尽快过滤，无菌保存.
（二）细胞培养用溶液
1.平衡盐溶液 （balanced salt solution,BSS)
任务二 动物细胞培养
一、动物细胞培养技术概述
（一）动物细胞培养技术及其应用 细胞培养技术是从体内组织取出细胞，在体
外模拟体内的环境下，使其生长繁殖，并维持 其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可 以是细胞群(组织块)。
细胞培养的应用
1、科学研究：
药物研究开发与基础研究 2、生物制药

常用溶液配方（细胞培养）PBS配制一、PBS配方配1L 25倍PBSNaCl 200gNa2HPO4-2H2O 36g 最难溶最后加或Na2HPO4-12H2O 72.4gNaH2PO4-2H2O 6.5g 或NaH2PO4 5g搅拌，1000ml定容，调PH值至7.2—7.4（细胞培养）1倍PBS配方NaCl 8.0gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44g 或者Na2HPO4-12H2O 3.57gKH2PO4 0.24g加水定容至1L，调PH值7.2-7.4（细胞培养）10倍PBS配方NaCl 80gKCl 2gNa2HPO4 14.4g 或者Na2HPO4-12H2O 35.7gKH2PO4 2.4g（组化用）PBS配方配1L 10 倍PBSNaHPO4 10.9g 或Na2HPO4-12H2O 27.50gNaCl 90gNaH2PO4 3.2g 或NaH2PO4-2H2O 4.16g搅拌，1000ml定容，调PH至7.2，分装，常温保存配1倍PBS（0.01PBS）1.取50ml 10倍PBS，倒入容量瓶2.定容至500ml，摇匀，分装二、胰酶的配制：0.25%胰酶1倍PBS 1000ml胰酶粉（trypsin）2.5gEDTA 0.4g搅拌后4摄氏度过夜，然后用NaOH调PH值至7.2-7.4；用0.22um滤器（绿色滤器）过滤分装保存。

三、培养基配制L-DMEM配制1L培养液：L-DMEM 10gNaHCO3 2.2g双抗1%（11ml）胎牛血清110ml注：国产胎牛血清需要56℃，30min灭活加完混合后，用0.22um的滤器过滤除菌，4摄氏度保存。

低糖冻存液的保存冻存液：L—DMEM：血清：DMSO=6：3：1注：（DMSO要缓慢加入，以防散热不均，下面要垫上冰块，助散热。

配好后用0.22微米滤器过滤，分装，4℃保存1640培养液配制1L体系：1640干粉10.3g/LNaHCO3 2g双抗1%100倍谷氨酰胺10mlβ-巯基乙醇3.5 uL胎牛血清10%（灭活）0.22微米滤器过滤，4℃保存。

⑦提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白 酶的损害。
血清的不足之处：
①存在不少有害于细胞生长和繁殖。例：补体、
免疫球蛋白和一些生长抑制因子等。
②血清的成分不明确，影响对结果的分析。
③不同动物，不同批次血清成分和活性差别比
较大，使的培养结果不稳定。
血清一般不自制，如果特殊需要需自制时要 注意： ①消毒 ②空腹 ③隔绝 ④倾斜、室温、4℃过夜 ⑤离心 ⑥滤过，血清检测
微量元素的增加较复杂，多采用商品包
装，现多培养基中已加好无需再加。
无血清培养基内必需增加酶抑制剂来中 止残余酶的作用。如，大豆胰酶抑制剂， 0.1-0.5%
九 消化液
消化液中最常用的是胰蛋白酶液和 EDTA液。
1 胰蛋白酶液
主要作用：使细胞间的蛋白质水解从而使细
胞离散。主要作用于与赖氨酸或精氨酸相连
3 贴壁因子
贴壁因子：细胞体外培养时绝大多数真核细胞
（贴壁依赖性细胞）需要固着于适当的基底， 帮助细胞固着贴附的物质叫贴壁因子或胞外
基质。
配制：
①配贮液（10×）1mg/ml,适当温度保存 ②选择适当贴壁因子保存 ③三蒸水或PBS稀释，0.1mg/ml工作液 ④滤菌 ⑤涂布 ⑥静置，洗涤
4 微量元素
①能提供细胞生存生长和增生所必需的生长调节因子。 ②能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。 ③含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养皿表面贴附和铺 展的生长基质成分。 ④提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。
⑤在有些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤 害的作用。
⑥给培养液提供良好的缓冲系统。
激素：胰岛素、生长激素、胰高血糖素等、
甾体激素等。

膜片钳灌流液配制，细胞培养液等试剂配制pH 用Tris碱调至7.4在离子置换实验中，用同样毫摩尔浓度的NaI（分子量149.9，10.49g/L）、NaBr（分子量102.7，7.2g/L）和葡萄糖酸钠（分子量218.1，15.27g/L）替代灌流液中的NaCl。

MgCl2和CaCl2中的Cl-含量很少，可以忽略不计。

表2 电极内液（pipette solution）*首先将1.366g N-methyl-D-glucamine 加入到80ml三蒸水中*用35.4%浓盐酸（约12滴）调溶液pH至8.0左右*再用1M HCl（约12滴）调溶液pH至4.5至5.5，加入HCl时必须缓慢小心，以防溶液pH下降过速。

停止加HCl后pH仍会降低一点*加入除ATP以外的其他成分，三蒸水配制100ml，用3M tris碱调溶液pH至7.25*过滤，分装，每支0.5ml*ATP用三蒸水配成100mM的储存液，过滤，分装，每支约12μl，放置于-20o C，使用前取10μl加入电极内液0.5ml中，使终浓度为2mM。

表3 human perfusion medium（HPM液）---(用途同PBS)pH用NaOH调至7.40.22μm 的微孔滤过膜除菌，分装无菌容器内，保存4o C，细胞培养用。

4、【RPMI1640溶液】（配置前想看包装上的说明）1、储存于4o C，用三蒸水配制（每袋/1L）2、取约900ml三蒸水，倒入全部的1640粉，袋壁上的粉用三蒸水溶解，缓慢搅拌3、加入2g NaHCO3（2g/L），缓慢溶解后取出磁力棒，加三蒸水定容至1L，再继续搅拌约1-2hrs4、用1M NaOH或1N HCL调pH至7.1-7.2（因为过滤时会增高0.1-0.3）。

溶液最终pH为7.45、过滤、分装后保存-20o C6、使用前配制成1640生长液，如配500ml含：1640液445ml+血清50ml+清链霉素5ml【小牛血清】胎牛血清（杭州四季青），使用前解冻后，36o C振荡灭活30mins，分装后保存在-20o C【冻存液】由60%1640液，30%胎牛血清，10%DMSO（二甲基亚砜）组成，使用前新鲜配制，4o C预冷30mins。

Hela肿瘤细胞培养操作规程一、实验准备1、细胞培养室的灭菌消毒细胞培养室及操作台用75%酒精擦洗3遍2、实验所需器材准备（1）移液器枪头的灭菌、烘干。

（2）3、培养基及溶液的配制PBS溶液的配置：培养基的配置：二、细胞的复苏操作1、把冻存管从液氮或-80℃冰箱中取出来后，立即37℃水浴，同时轻微摇动。

待液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2、把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。

3、把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。

吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4、标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

5、3天换一次培养基。

三、细胞的传代1、培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2、把原有培养基吸掉。

3、加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。

4、细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。

5、用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。

6、把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7、倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8、根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。

一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。

继续培养。

四、冻存细胞消化下来并离心（同上）。

用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分把钟，写明细胞种类，冻存日期。

4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

要注意的就是无菌操作！培养基的配制：实验步骤：在超净台内，安装好滤器。

用去离子水溶解1640培养基，并用磁力搅拌器搅拌2 h，使之充分溶解。

在超净台内过滤。

细胞培养PBS配方
所需试剂和设备:
-NaCl(氯化钠)
-KCl(氯化钾)
-Na2HPO4(磷酸氢二钠)
-KH2PO4(磷酸二氢钾)
-无菌水
-电子天平
-烧杯和量筒
-反应管和磨研器
步骤:
1.称取所需试剂。

根据下述配方，称取正确比例的NaCl、KCl、
Na2HPO4和KH2PO4、确保所有试剂都是无菌的，并在称取时保持清洁卫生。

2.备制1L的PBS溶液。

将称取的试剂添加到烧杯中，并用无菌水稀
释至1L。

3.搅拌混合。

使用一个电子磨研器或类似的设备，将溶液进行彻底的
混合以确保所有试剂充分溶解。

尽可能避免气泡的形成。

4.pH调节。

使用pH计来测定溶液的pH值。

根据需要，使用NaOH或HCl溶液调节pH值。

PBS的理想pH值为7.4左右。

5.灭菌。

将溶液装入无菌试管中，并将其密封。

以121°C的温度下，在高压蒸汽灭菌器中处理溶液。

处理时间为15-20分钟。

注意事项:
-在制备PBS时务必保持实验室的环境无菌，因为这种溶液广泛应用
于细菌和真菌的生长培养中。

-要使用新鲜的试剂来制备PBS，以避免试剂的老化和变质。

-处理溶液时要小心，避免对溶液的污染。

使用无菌操作来减少污染
的风险。

-在制备PBS溶液之前，请先确保相关设备（如烧杯、磨研器等）已
经过彻底清洁和消毒处理。

培养细胞所需的几种主要液体的配制方法：1．DMEM维持培养基DMEM基础培养基95ml 95ml胎牛血清5ml谷氨酰胺液2ml含有DMEM基础培养基95ml，胎牛血清5ml，谷氨酰胺液2ml。

混合均匀，密封后与4摄氏度保存。

2．D-hank’sD-hank’s干粉g(1袋)NaHCO3超纯水1000ml取D-hank’s干粉加入超纯水500ml搅拌均匀，加入的NaHCO3搅拌至完全溶解，倒入1000ml容量瓶中，用1mol/l的HCL或者NaOH 溶液调整溶液的PH值为7.2,最后经过∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装后4摄氏度保存.3. DMEM完全培养基85ml,DMEM基础培养液85ml,, l-谷氨酰胺溶液, 2ml1000u/ml双抗液1ml胎牛血清15ml取DMEM基础培养基85ml, 胎牛血清15ml,l -谷氨酰胺溶液2ml,混合均匀,密封于4摄氏度保存.4. DMEM细胞基础培养基DMEM干粉(1袋)Na2HCO3超纯水1000 ml取DMEM干粉1袋()倒入烧杯中,取800ml 超纯水溶解培养基干粉,搅拌均匀,然后向溶液中加入的Na2HCO3,搅拌至完全溶解后倾入1000 ml容量瓶中,再用1mol/l 的HCL 或者1mol/l的NaOH溶液调整溶液的PH值为7.2,混合均匀后,定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装4摄氏度保存.5. l-谷氨酰胺溶液l-谷氨酰胺DMEM基础培养基100ml称取l-谷氨酰胺干粉g于烧杯中,加80 ml超纯水于烧杯中搅拌溶解,用100ml容量瓶定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中于-20摄氏度保存.使用添加量是1ml/50ml,使用浓度是2mmol/l.青霉素(注射用) 80万单位(1瓶)链霉素(注射用) 0.8 g％生理盐水80ml取注射用青霉素100万单位及注射用链霉素于80ml DMEM培养基中,搅拌混合均匀,用∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中-20℃％的胰酶溶液胰蛋白酶干粉 0.25 gDMEM基础培养基100ml称取胰蛋白酶干粉0.25 g于烧杯中,加入80ml DMEM基础培养基溶液,进行搅拌溶解,100 ml容量瓶定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中于-20℃条件下保存.8.mg/ml的内皮细胞生长添加物溶液(ECGS)ECGS干粉 15 g(1支)无菌超净水 6 ml取内皮细胞生长添加物15 g(1支),加入6 ml无菌超纯水完全溶解后,分装于-20℃条件下保存.在培养基中添加剂量为1ml/50ml,即培养基浓度为50微克/ ml.9.PBS 液KCLNaclNa2HPO4.12H2OKH2PO4分别取KCL, Nacl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4于烧杯中,加入适量的超纯水搅拌至所有药物完全溶解,然后倾入1000ml容量瓶中,最后定容并调节PH为7.20,分装于4℃保存,。

细胞培养注意事项（入门级）总的原则：无菌操作、保证细胞培养环境的稳定性按时间顺序整理1、细胞房和生物安全柜（或超净工作台）先开紫外照射30min。

作用：对环境灭菌（空气）。

（备注：如果着急，至少也要开15分钟）在做实验之前考虑好需要哪些物品。

开始照射之前，将所需要用到的物品都放到生物安全柜（或超净工作台）里面。

常用移液枪或电动移液器等，需要在工作台上放置一套专用设备。

细胞培养箱一般都已经调整好。

定期留意一下二氧化碳是否足够。

不够及时更换。

2、显微镜需要定期消毒酒精擦拭。

注意：显微镜一般都放在细胞房。

3、进入实验之前，首先给自己带上拖鞋、头套，口罩，实验服，手套（手套带双层）。

注意：手套要将袖口套进去。

实验服、拖鞋最好是细胞房专用。

4、开始操作之前先观察细胞。

首先观察细胞培养液的颜色。

现在的细胞培养液通常都放有酸碱指示剂（绝大部分是酚红）。

细胞在培养生长过程中，不断在培养液上清中累积酸性物质，时间长了，培养液变为黄色（同时培养液中营养物质耗尽）。

其次镜下观察细胞的生长状态是否良好，是否需要传代。

如果生长状态不好，需要对培养液进行调整（一般是加大血清浓度）。

过于密集出现大片融合或太密集而导致细胞脱落，则进行传代。

如果长势良好，且细胞培养液颜色未发生变化，可以酌情进行1/2、1/3、1/4换液，也可以全换液。

总之，视细胞生长情况而定。

5、细胞培养预准备：首先是准备各种溶液。

第一是配制溶液过程中要用到的水。

水用纯水，高压灭菌之后，再去内毒素。

去内毒素方法很多，最简单可以放在烘箱180度3小时。

或者过去内毒素的柱子后，高压灭菌。

第二，各种溶液灭菌：抗生素用去内毒素水配制后，直接过滤除菌（过0.22u滤头）。

可以用一次性无菌注射器过一次性0.22u滤头。

现在用的培养液，如果是商业化液体培养基，不用处理。

如果是粉末，需要用去内毒素水在生物安全柜（或超净工作台）进行配制，再过滤除菌。

可以先配浓缩液（如10×），过滤除菌后。

器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。

需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

用HCl或NaOH调PH到7.4。

移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。

注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。

终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。

搅拌混匀，置于4℃内过夜。

用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。

然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。