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RNA抽提一、操作中需要注意的几点1.进行RNA抽提前，要将所有的塑料用品用0.1%的DEPC水浸泡过夜，之后装入容器以铝膜封口再进行高压灭菌（离心管最好使用Rnase-free的产品）。
2.所使用的组织最好是新鲜的，如果分离的组织不立即使用，可在-70℃或液氮条件下保存半年左右。
3.所需要的氯仿，酒精，异丙醇等都要使用新开封或RNA抽提专用的。
4.验过程中，为防止RNase从唾液、汗等途径混入，请使用口罩和手套等。
操作中每次双手离开超净超净台后，再进入时都应更换手套。
5.一定要注意冰上操作，低温离心。
操作尽量迅速以减少RNA抽提的时间。
二、RNA抽提步骤（使用上海生工的UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒）1.如使用组织，请使用液氮在碾钵中将组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5ml离心管中，每50mg动物组织加0.5ml的Trizol。
其他种类样品的最大使用量参见下表：样品种类 动物细胞 动物组织 细菌 酵母 植物组织 丝状真菌 最大使用量 1×10750mg 1×1091×107100mg 100mg 2.用1ml的一次性注射器抽吸离心管中的匀浆两次以剪切基因组DNA，然后直接用注射器将样品转移到Rnase-free的离心管中。
3.加入100μl的氯仿/异戊醇（24∶1），剧烈震荡30s。
4.台式离心机上，12000rpm，4℃离心5 min。
5.将上清液小心转移到无菌1.5ml Rnase-free离心管中，加入150μl无水乙醇，混匀。
6.将上述混匀的溶液全部转移到放于2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，之后8000rpm低温离心1min。
7.小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入450μl RPE Solution，10000rpm低温离心30s。
8.重复步骤7一次。
9.小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，10000rpm低温空转15s。
提rna注意事项在进行RNA实验时，有一些重要的注意事项需要特别关注，以确保实验的准确性和可重复性。
下面是一些RNA实验的注意事项：1.实验前的准备工作：要确保实验室设备和实验台面的干净和无污染。
所有用于RNA操作的器皿、试剂瓶盖等都要经过彻底清洗和灭菌处理，避免引入外源性RNA。
2. 使用RNase-free试剂和器材：RNase（核酸酶）是一种能够降解RNA的酶，在RNA实验中极易引入，对结果的准确性会有很大影响。
因此，在实验中必须使用RNase-free的试剂、离心管、反应管和塑料制品，并保持操作区域干净。
3. 避免RNA降解：RNA在实验过程中容易受到氧化、酶解和碱解等影响，因此必须采取措施保护RNA免受降解。
这包括使用RNase抑制剂（如RNase inhibitors）、避免直接接触皮肤、避光以及快速进行实验步骤等。
4.RNA提取：RNA提取是RNA实验的重要步骤，选择合适的提取方法和试剂对于获得高纯度和高质量的RNA样本至关重要。
常用的RNA提取方法包括酚/酚氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。
无论使用哪种方法，需要根据样本类型和实验目的仔细选择，严格按照操作步骤进行。
5.RNA浓度和纯度的检测：在进行RNA实验之前，需要对提取到的RNA进行浓度和纯度的检测。
常用的方法有光密度测定（如OD260/OD280比值）和琼脂糖凝胶电泳。
确保RNA样本浓度和纯度可靠，有助于后续实验的可靠性和准确性。
6.逆转录反应：逆转录反应是将RNA转录成cDNA的关键步骤，需要选择合适的逆转录酶和引物。
不同的逆转录酶有不同的逆转录效率和特异性，对于不同的RNA种类和实验目的，需要选择适当的逆转录酶。
此外，逆转录反应的条件（如温度和时间）也需要根据实验设计合理设置。
7.定量PCR：在定量PCR实验中，需要合理设计引物和探针，准确选择RNA的内参基因进行比较。
同时，为了保证PCR反应的可靠性，需要对实验过程中的各项条件进行严格控制，如反应体系的制备、反应温度和周期数的设置等。
RNA提取准备工作及注意事项RNA提取是分子生物学实验中常用的操作步骤之一，它是从细胞或组织中提取RNA分子的过程。
在进行RNA提取前，需要进行一系列的准备工作以及注意事项，以确保提取出的RNA质量好、纯度高。
下面是RNA提取的准备工作及注意事项的详细介绍。
一、实验前准备1.实验器材准备：常用的器材有离心管、离心机、恒温水浴器、pH计、显微镜等，根据实验的需要选择相应的器材，并确保所有器材都经过充分的洗涤和消毒。
2.试剂准备：RNA提取试剂盒通常包括缓冲液、酚-氯仿、异丙醇等，根据试剂盒的说明书准备相应的试剂溶液，并保证试剂的纯度和保存状态。
3.工作区准备：RNA提取实验应在清洁、干净的台面上进行。
实验室湿度应保持在50-60%之间，温度保持在20-25°C之间，以防止RNA降解和污染。
二、实验注意事项1. 避免污染：RNA易受到RNase的污染，因此，实验操作时应避免污染源。
严格控制实验室环境的清洁程度，使用无RNase酶的试剂和离心管，避免直接接触RNase。
2. 快速操作：RNA易被RNase降解，因此在提取过程中应尽量减少操作时间。
在每一个步骤中，应迅速进行，尽量避免长时间的搅拌和振荡。
4.酚-氯仿提取法：酚-氯仿法是一种经典的RNA提取方法，但需要注意的是，该方法中酚对人体有毒，因此在操作时应注意避免接触皮肤和吸入。
5.商业试剂的选择：市场上有许多RNA提取试剂盒可供选择，根据实验需求和预算，选择可靠的商业试剂。
确保试剂的批次一致，并严格按照说明书操作。
6.RNA样品的保存：提取得到的RNA样本应立即保存在低温条件下，如-80°C冰箱中，以避免RNA的降解和污染。
7.评估RNA质量：提取得到的RNA样品可以通过吸光光度计检测A260/A280比值来评估其纯度。
通常来说，纯度好的RNA样品A260/A280比值应在1.8-2.0之间。
总结：RNA提取是一项关键的实验步骤，准备工作和注意事项的严格执行对RNA提取的结果和后续实验的顺利进行非常重要。
RNA抽提之应知应会第一篇：RNA 抽提之应知应会RNA 抽提之应知应会背景介绍对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组DNA 抽提要困难得多。
事实上，现有的RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA 更方便，成功率也更高。
那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。
关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。
现有的RNA 抽提试剂，都含有快速抑制Rnase 的成分。
在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。
细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。
也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。
因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。
液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。
但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。
这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。
匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase 降解 RNA 的速度快。
电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。
因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎100% 能获得解决。
影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。
总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。
本人在做RNA抽提实验中总结了一些需要注意的事项，以及一些抽提各种RNA的常用方法及步骤。
希望与大家共同分享：高质量的真核生物mＲＮＡ的提取，必须使用ＲＮＡ酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活ＲＮＡ酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的ＲＮＡ酶的活性。
同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量ＲＮＡ酶也很重要。
下面列举避免ＲＮＡ酶法染问题的一些注意事项。
大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。
（一）实验程序如不谨慎操作，外源性ＲＮＡ酶可以通过下述途径污染ＲＮＡ制品：（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无ＲＮＡ酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存ＲＮＡ。
实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有ＲＮＡ酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。
另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）的水溶液浸泡用于制备ＲＮＡ的烧杯，试管和其他用品。
ＤＥＰＣ是ＲＮＡ酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Ｆedorcsak和Ehrenberg,1966）。
灌满ＤＥＰＣ的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟（Ｋumar和Ｌindberg,1972)。
在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。
上述处理可以除去器甲上痕量的ＤＥＰＣ，以防ＤＥＰＣ通过羧甲基化作用对ＲＮＡ的嘌呤碱基进行修饰。
羧甲基化的ＲＮＡ在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其形成ＤＮＡ：ＲＮＡ或ＲＮＡ：ＲＮＡ杂交体的能力并不明显降低。
用于ＲＮＡ电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满３％的Ｈ２Ｏ２溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％ＤＥＰＣ处理水彻底冲洗电泳槽。
最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为ＲＮＡ实验专用。
rna提取的关键操作及注意事项RNA提取是生物学研究和临床诊断中必不可少的操作之一，它能够从细胞、组织中提取RNA分子，并进行分析和检测。
RNA提取的关键
操作和注意事项如下：
1. 样本的选择和采集：生物样品是RNA提取的基础，样品的选择
和采集直接影响到提取效率和RNA的质量。
应选择新鲜的细胞和组织，采集后应立即转移到冰上并迅速进行下一步操作。
2. 细胞和组织的破碎：RNA是由核酸和蛋白质组成的，因此需要
将样品进行破碎，以释放RNA。
常用的破碎方法包括机械破碎和化学破碎。
机械破碎主要通过磨砂器、超声波等物理方法进行，而化学破碎
主要通过酚-氯仿法或三氯乙酸进行。
3. RNA的纯化：纯化是RNA提取过程中最重要的一步，目的是去
除杂质和提高RNA的纯度。
它常采用硅胶柱层析法、钠酸盐沉淀法等。
在纯化过程中需要注意避免RNA降解，因此要严格控制时间、温度和
pH值等因素。
4. RNA的定量和质量分析：为了确保RNA的质量和纯度，需要对
提取出来的RNA进行定量和质量分析。
定量可以使用紫外分光光度计，质量可以通过琼脂糖凝胶电泳、比色法和荧光标记等进行分析。
总之，在RNA提取过程中，样品选择和采集、细胞和组织的破碎、RNA的纯化以及RNA的定量和质量分析是关键步骤。
在实际操作中，还
应注意严格控制时间、温度、pH值等因素，避免RNA的降解和污染。
同时，在选择RNA提取方法时，也应根据需要选择合适的方法。
这些注意事项都能够提高RNA提取的效率和RNA的质量，有助于后续的研究和诊断。
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或℅SDS溶液均需用DEPC处理过的水配制.操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.,大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞,每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol.加Trizol前不要洗涤细胞,以免降解mRNA.一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理.e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10min,10 000rpm 离心1min.弃上清,收集白细胞沉淀.每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol.2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离.3. 可选步骤:4 ℃ 10 000rpm离心10min,取上清.如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等,可离心去除.离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA.处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂,应除去.取澄清的匀浆溶液进行下一步操作.4. 每使用1ml Trizol加氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s,室温放置3min.如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替.5. 4 ℃ 10 000rpm离心10-15min,样品会分成三层：红色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相约600ul,约为所用Trizol试剂的60%转移到新管中.如要分离蛋白质和DNA,可保留黄色的有机相6. 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃放置20-30min.植物或动物组织RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,导致电泳检测时看不到RNA.可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇,1/2体积的RNA助沉剂,然后进行以下操作.7. 4 ℃ 10 000rpm离心10min,去上清.离心前RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀.8. 加入1ml 75%乙醇DEPC水处理过的水配制洗涤沉淀.每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇.9. 4 ℃ 10 000rpm离心2min,弃上清；短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀.10. 室温放置晾干不要晾得过干,RNA完全干燥后会很难溶解,大约晾干2-3min左右即可.加入适量DEPC水根据实验需要,可加30-100ul水或%SDS,用枪头吸打几次,充分溶解RNA.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液.RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存.注意事项：1. 从少量样品中提取RNA1-10mg组织或102-104细胞：加800ul Trizol,样品裂解后加氯仿,分层,沉淀RNA前,加5-10ug RNase-free糖原,糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成,也不影响PCR反应.2. 匀浆后,加氯仿前,样品可在-70 ℃放置一个月以上：RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上.如果要长期保存,RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中,-70 ℃长期保存.预防RNase污染,应注意以下几个方面：1. 经常更换新手套.因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染.2. 使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染.3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解.但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿.玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h,塑料器皿可在 NaOH中浸泡10min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase.4. 配制溶液应使用无RNase的水将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至中浓度%v/v,放置过夜,高压灭菌.注：DEPC 有致癌之嫌,需小心操作.不同组织或细胞RNA提取预期得率植物叶片 100-200ug/g叶片动物组织 200-400ug/g肝脏组织动植物培养细胞 5-10ug/106细胞大肠杆菌 2-10ug/mlDH5α过夜菌血液 3-5ug/ml人全血问题指南：低得率A. 样品裂解或匀浆处理不彻底B. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A280<A. 检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水.低离子浓度和低pH条件下A280会较高.B. 样品匀浆时加的试剂量太少.C. 匀浆后样品未在室温放置5min.D. 水相中混有有机相.E. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解.RNA降解A. 组织取出后没有马上处理或冷冻.B. 样品或提取的RNA沉淀保存于-5~-20℃,未在-60~-70℃保存.C. 细胞在胰蛋白酶处理时被破坏.D. 溶液或离心管未经RNase去除处理.E. 电泳时使用的甲酰胺pH低于.DNA污染A. 样品匀浆时加的试剂体积太少.B. 样品中含有组织溶剂如乙醇,DMSO等,强缓冲液或碱性溶液.蛋白和多糖污染A. 样品中蛋白、多糖含量高.B. 样品量太大.C. 水相中混有有机相.D. 第6步中加入RNA助沉剂可以帮助去除这些污染.RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解.但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃.RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去.但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性.RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸,再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相.第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失,目前该方法的使用频率已很低.实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA.1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性.2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开.3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc或异丙醇.4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解.5、融解RNA一般使用TE.6、保存RNA应该尽量低温.为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品如胰脏、肝脏中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA,对于长期贮存更是如此.从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定.另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感.为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于- 70℃.用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物.来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年.当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至,12,000×g离心5分钟.氯化锂法提取总RNA：本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶,用氯化锂选择沉淀RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高,小RNA丢失的缺陷.试验试剂：1、氯化锂/尿素溶液氯化锂126g3M 尿素、360g6M 加水至1L,过滤灭菌2、悬浮液10mM Tris-HCL ,1mM EDTA pH8,0 ,%SDS试验步骤：1、对于大量组织或细胞,则每克组织或细胞加入5－10ml 氯化锂－尿素溶液,匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞107个细胞/ml,则每克组织或细胞加入氯化锂－尿素溶液手工匀桨,并转移至Eppendof管中.2、匀桨液在0－4℃放置4小时后,12000g离心30分钟.3、取沉淀,加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液,重复步骤2.4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后,加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀,4000g离心5分钟.5、取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠及2倍体积的乙醇,－20℃放置1小时,5000g离心.6、 70％乙醇洗沉淀一次.真空干燥.7、 RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分装,于－70℃保存.蛋白酶－热酚法－本方法适合于病毒RNA的提取试验试剂：1、蛋白酶K终浓度50ug/ml2、 2×缓冲液：1%SDS 20mMTris-HCL pH试验步骤：1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟.2、加入等体积65℃预热的酚溶液,轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭.3、离心,取上清,氯仿抽提一次.4、取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠及2倍体积的乙醇,－20℃放置1小时,5000g离心10000g,10min.5、 70％乙醇洗沉淀一次.真空干燥.6、 RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分装,于－70℃保存.RNA提取实验经验心得总结一：实验的准备实验之前必须先准备好相关的试剂和实验用品．试剂：１.TRIZOL,一步法提取ＲＮＡ用的,最好是INVITROGENE的,１００ml850RMB,不过也有国产的,便宜些．这个试剂是非常关键的,也是不能省的,经常有很多朋友不想买这个,嫌贵,个人感觉是非买不可,不然用其他办法自己配的话也不便宜,而且配的过程中很毒．2.异丙醇,无水乙醇,三氯甲烷氯仿,ＤＥＰＣ３.逆转录酶等．一般如果做的次数不是很多的话可以买试剂盒的,里面什么都有,ＰＲＯＭＥＧＡ的也不是很贵,记得是３０次的６００多．但是如果实验室做得比较多的话,还是自己分开买的比较好．Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶个人觉得ＰＲＯＭＥＧＡ的最好,而且不贵,其他公司我用得也不多,反正一直用ＰＲＯＭＥＧＡ,还有ＤＮＴＰ,oligodTn,RNA酶抑制剂,除了逆转录酶买ＰＲＯＭＥＧＡ的,其他的几样我都是买的ＴＡＫＡＲＡ的,因为promega的其他几样都很贵,这样配起来用一点也不比原装的差．当然实验室比较富裕的也可以买好的,不过话说回来,咱们花的经费大多数还是民脂民膏,这些不太关键的地方省着点比较好我是不是太罗嗦了４.用具．各种大小的枪头和ＥＰ管.由于RNA提取过程中对于RNA 酶是非常敏感的,所以枪头和管子都要做灭酶处理.灭酶的正常程序是用加入DEPC 的水泡枪头和管子,过夜.DEPC的浓度是%.DEPC是强致癌物,做的时候要戴手套口罩,作好防护措施.泡好后再高压,烘干.灭酶除了用DEPC处理外,还可以用氯仿泡枪头和管子,不用泡过夜,1-2小时就行,也没有DEPC那么恐怖,泡后也是高压烘干.5. 水.实验用的水也是很关键的,必须用DEPC处理灭过酶的水才可以.具体做法是将去离子水中加入%DEPC,摇过夜,之后再高压.高压这步是不能省的,因为必须用高压把残留的DEPC分解掉,不然会影响后续的反应.二．实验步骤TRIZOL提取RNA的原理就是利用变性剂将细胞裂解,释放出蛋白质,DNA,RNA,之后根据它们在不同PH值和不同极性溶剂中溶解度不一样.而把RNA提取出来.详细的原理可以自己查一查,在这里不做赘述.1. 样品处理对于组织样品,书上说的办法是匀浆后加TRIZOL,但是我的经验是用匀浆器匀浆的话很多组织都是沾在匀浆器的壁上了,所以我一般都是用小剪刀剪,剪的时候要耐心,剪得很碎才行.一般样品其始量大概黄豆那么大一坨就行了,加1mlTRIZOL,然后在EP管中剪碎.样品尽量用新鲜的,不是新鲜的泡在PBS中一段时间也行.样品泡在TRIZOL里面后RNA 就基本不会降解,这一步可以放在冰箱里面冻起来,可以保存一段时间2. RNA提取.往第一步中的剪碎的样品和TRIZOL中加入的氯仿,之后剧烈摇晃.震荡,此时整个液体的颜色应该变成一种粉红色的.之后静置10分钟,静置后可以看到液体分层了.12000转4度离心10分钟,可以看见液体分层很明显,最上面的是无色的水相,RNA就溶解在里面,中间一层是白色的固体,这层是蛋白质和DNA形成的复合体,下面是红色的酚相.把上层水相吸到另外一个管子里面,注意不要把下面的两层吸出来了,宁愿少一下没关系.往水相液体中加入500ul的无水乙醇或者是异丙醇,上下颠倒混匀,此时如果RNA量多的话可以看见一些油一样的东西,反正就是感觉怪怪的那种,不过一般都不会出现明显的沉淀的.之后12000转离心10分钟,离心之后就可以看见管底有点半透明的东西了,那就是我们要RNA.倒掉无水乙醇或者异丙醇,加入500ul用DEPC处理水配制的70%乙醇,以洗涤RNA,加入后把管子敲一敲,尽量使RNA 沉淀飘起来.之后在7500转离心8分钟,到掉乙醇,倒扣在干净的吸水纸上面,空气室温干燥,时间可以稍长点,40分钟到1小时,以看不见明显的液滴为准.干后用20ul或者30ulDEPC水溶解RNA,50度保温1小时.之后得到的RNA就可以泡个电泳或者测个浓度什么的,就看大家的需要了,具体方法可以自己查一查,因为我一般是用RNA做RT-PCR,或者是扩基因全长,所以我一般都不用电泳或者测浓度,都是等到逆转录完成之后,用beta-actin或者其他内参做个PCR检测RNA的质量.补充一点：上述实验和下面的逆转录都要在超净台里面完成.3. 逆转录总RNA提取之后,往往我们要的是mRNA,并且由于RNA不好保存,所以要把RNA经逆转录变成cDNA,就可以方便的保存和操作了.逆转录过程就是照着说明书一步步做了,所以就简单说一下.取8-10ulRNA,加上1ul的oligodT,用水补足13ul,这一步RNA的量是可以调节的.70度变性10分钟,然后迅速放在冰上,这一步是为了让oligodT结合到mRNA上.当然,有的实验需要用随机引物做,大家自己把握.变性后加如5buffer ,dntp,RNA酶抑制剂,逆转录酶,42度保温60分钟,这一步最好是在PCR仪上做.保温后再94度变性5分钟,冰上放置.好了,cdna得到了,下面就是要检验一下质量了,也就是拿beta-actin引物为内参做个PCR了.看看扩出来的亮度怎么样了具体的引物设计和PCR的优化有时间我会发到PCR版上去.好了,如果内参扩出来比较好的话,那你就成功了,可以做下面的试验了.总的来说,RNA提取过程中最应该注意的就是RNA酶的防止,所有操作在超净台完成,然后一定要带一次性手套,而且一直要换.其他器具的处理就象前面说的那样了.。
一、研钵的处理一般用三蒸水洗净后，放干后用锡箔纸包好后置高温160-250度烘烤4小时左右，可以灭活所有的酶并杀灭细菌和真菌孢子，冷却后即可使用那如果我有几十个标本的话，我每提一个就要消毒一次研钵？是啊。
你可以一次准备好几个研钵，一次做几个样。
完了再用锡箔纸包上，高温消毒老师您好，研钵最好在150摄氏度的烘箱中烘烤5-7小时，如您不急，可烘烤过夜，我们实验室的做法是：锡箔纸包好，直接180℃烘烤4个小时左右，之后再放入-20℃冰箱中预冷备用。
研钵最好用锡箔纸包好，放在180度烘箱中处理6个小时以上。
二、器械的处理提取rna的所有器械均应经depc处理吗？总之，1）.提取rna的所有器械最好先用DEPC处理，然后再高温灭菌；2）.RNA提取尽量在低温条件下操作，同时整个过程尽量要迅速；3）RNA提取出来以后立即-70度保存，如果暂时不用，可以保存在75%的酒精溶液中。
就个人经历浅谈一下1）如果枪头和EP管是刚拆包的，就无需DEPC处理，处理后反而会破坏？硅化涂层？导致取液不准和挂液；镊子、装EP管的饭盒等要先用DEPC处理，然后再高温灭菌；2）戴橡胶手套，常用95%的酒精擦手、离心机、实验时用到的EP管架和实验操作区域。
不要对着实验区域说话；离心时不能完全按说明书上写的时间，如果离心完管里还有液体就再离心一会。
我觉得提取RNA的器械不必都用DEPC处理。
我通常是这样做的：1.枪头是DEPC处理，然后高压消毒。
2.EP管高压消毒即可。
3.包装样品用的锡箔纸和装试剂的瓶子高温（200度以上）烘烤4小时。
4.镊子、手术剪等器械用75%酒精消毒即可。
5.取材的时候要尽可能快，并迅速放进液氮。
6.保存RNA我通常用DEPC水，—70度保存。
我提的RNA快一年了，依然很好。
要说一句的是：我的低温冰箱曾经停电3、4天，竟然RNA没有怎么降解，呵呵！我的经验是枪头不用DEPC水处理，但是要用新的；EP管直接高压消毒，固体物质如瓶子、量筒先用DEPC水浸泡，然后高温干烤；取材时不要说话。
一、概述RNA提取是生物学研究中的重要步骤，它涉及到从细胞或组织中提取出RNA分子，为后续的分子生物学实验和分析提供基础数据。
在RNA提取过程中，有许多关键步骤和注意事项需要注意，才能确保提取到高质量的RNA样品。
本文将重点介绍RNA提取过程中的关键步骤及注意事项。
二、样品采集和保存1. 样品的采集要尽量避免受到外界环境的污染，采集器具要事先经过严格的消毒处理。
2. 采集后的样品应立即冷藏或置于液氮中保存，避免RNA降解。
三、细胞破碎1. 细胞破碎是RNA提取的第一步，直接影响到RNA的得率和质量。
常用的方法包括酚-氯仿法、超声波法和离心破碎法等。
2. 选择合适的细胞破碎方法，要充分破碎细胞膜，释放出RNA分子，同时避免RNA的降解。
四、蛋白质沉淀1. 蛋白质沉淀的目的是去除DNA和蛋白质，以纯化RNA。
常用的方法包括酚-氯仿法和硅胶柱法。
2. 在进行蛋白质沉淀时，要注意去除酚相和混合相中的DNA和蛋白质，以免对RNA纯化产生影响。
五、RNA沉淀和洗涤1. RNA沉淀的方法有乙醇沉淀法和硅胶柱法等，选择合适的方法要根据样品的特点和后续实验的需要进行。
2. 在RNA洗涤的过程中，要充分去除盐和其他杂质，以保证提取到干净的RNA样品。
六、RNA溶解和质量检测1. RNA溶解的过程要充分溶解RNA，并保证溶解液的质量纯净。
2. 对提取得到的RNA样品进行浓度和完整性的检测，以确保RNA的质量达标。
七、总结RNA提取是分子生物学研究中的重要步骤，本文介绍了RNA提取过程中的关键步骤和注意事项。
通过严格控制每个步骤，可以保证提取到高质量的RNA样品，为后续的实验和分析提供可靠数据。
希望本文能够帮助读者更好地理解RNA提取过程，并在实验操作中取得更好的效果。
八、RNA存储和稳定性1. 存储RNA样品时，应尽量避免反复冻融，因为这样容易导致RNA 降解。
合适的储存温度通常为-80摄氏度。
2. 另外，干燥的RNA样品更容易保存，因此可以考虑使用适当的稳定剂，如DEPC水或RNAlater等，来保护RNA在样品采集至提取过程中的稳定性。
rna提取注意事项
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RNA提取注意事项
1. 样品的收集要快：样品到达实验室后，应尽快进行处理，及时提取RNA，减少样品的RNA失活。
2. 避免RNA的降解：RNA的降解是最大的害处，所以要尽快把RNA提取出来，并尽量避免样品暴露在高温高水分的环境下，同时也要避免样品中RNA受到酶活性物质的污染，以免影响RNA的破坏，一般采用8％聚丙烯（PAGE）来保护RNA。
3. 提取RNA时要严格控制实验条件：RNA的提取一般要求室温下进行操作，如果操作温度过高，会使RNA降解；RNA的提取中，要求操作中保持干净无污染，且不能有RNA外源物质的入侵；实验后存放的液体也要物理和化学上尽量保持稳定，以保证RNA提取后的完整性。
4. 选择合适的提取方法：不同的提取方法有不同的优缺点，在选择提取方法时，应考虑样品材料的种类、RNA特性（类型、分子量）、细胞类型和细胞性质等，以确保提取到最优质的RNA。
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RNA 抽提之应知应会背景介绍对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。
事实上，现有的RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提 RNA，比抽提基因组 DNA 更方便，成功率也更高。
那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。
关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。
现有的 RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。
在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。
细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。
也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。
因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。
液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。
但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。
这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。
匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。
电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。
因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。
影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。
总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。
优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质–用嘴碾磨，肠胃抽提。
究竟怎样才能确保 RNA 抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。
当然，您的选择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。
(go top)实验前方法/试剂的选择0：抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。
cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。
投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，劳民伤财。
1：样品的收集/保存–影响降解的因素样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。
传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。
这两个办法都要求操作快速。
后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。
具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。
2：样品的破碎及匀浆–影响降解和得率的因素样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。
细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。
内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。
最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。
使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。
3：裂解液的选择–影响操作方便程度，内源杂质残留的因素常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。
只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。
4：纯化方法的选择–影响内源杂质残留，抽提速度的因素对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。
但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。
柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。
(go top)RNA 抽提的“三大纪律八项注意”纪律一：杜绝外源酶的污染。
注意一：严格戴好口罩，手套。
注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。
纪律二：阻止内源酶的活性注意四：选择合适的匀浆方法。
注意五：选择合适的裂解液。
注意六：控制好样品的起始量。
纪律三：明确自己的抽提目的注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。
注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。
(go top)RNase 污染的10大来源1：手指头–手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。
另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。
戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
2：枪头，离心管，移液器–单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。
移液器最好是专用的，用前用75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。
3：水/缓冲液–一定要确保无 Rnase 污染。
4：实验台面–最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。
5：内源 Rnase –所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。
液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。
6：RNA 样品– RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。
7：质粒抽提–质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用Proteinase K 消化，PCI 抽提。
8：RNA 保存–即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。
长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
9：阳离子 (Ca, Mg) –在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。
10：后续实验所用的酶–酶均有可能被 Rnase 污染。
(go top)RNase 和 DEPC 处理1：高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。
实验证明：37 C 与 RNA 反应，没有灭菌的 PBS，活性点为 100 pg/ml；灭菌后，活性点为 100 ng/ml。
当然，灭菌后 Rnase仍然不能认为没有残留。
2：DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。
0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底破坏了 DEPC。
破坏后可以闻到一点气味。
3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。
结果提示，0.1% DEPC 只对 MOPS 有效，而 1% DEPC 对三种试剂都有效。
4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A 的浓度分别为：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。
但要注意，DEPC 灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。
(go top)RNA 抽提的10大窍门1：快速阻止 Rnase 活性–样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活 Rnase。
2：选择合适的抽提方法–高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。
3：预判质量要求– Northern，cDNA 文库构建对完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay) 对完整性要求不是很高。
RT-PCR 对纯度 (酶抑制物残留) 要求很高。
4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5：检查 RNA 的完整性–电泳检测，28S:18S =2:1 是完整的标志，1:1 对大部分实验也是可以接受的。
6：去除 DNA –用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。
7：降低外源酶的污染–不能从外面又导入酶。
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。
但要防止助沉淀剂含酶及 DNA 污染。
9：彻底溶解 RNA，必要时可以 65C 加热 5 分钟。
10：合适的保存方法–短时间可以–20C 保存，长期请保存于–80C。
(go top)提高 RNA 得率首先要意识到不同得样品其 RNA 含量差别很大。
高丰度 (2-4ug/mg) 的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度 (0.05-2ug/mg) 的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度(<0.05ug/mg) 的如膀胱，骨，脂肪。
1：裂解细胞使 RNA 释放出来–RNA 如果不被释放出来，得率是会降低的。
电动匀浆比其它匀浆方法效果更好，但也可能需要结合其它得方法，如液氮捣碎，酶消化 (Lysozyme/Lyticase)2：抽提方法的优化。
基于苯酚的方法的最大问题是分层不彻底和部分 RNA 的丢失(不能全部将上清取出)。
分层不彻底是因为核酸和蛋白质含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低样品量解决。
脂肪组织要增加一步氯仿抽提。
RNA 的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。
基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。
(go top)经典抽提小技巧1：Phenol 纯化：将等体积的 1:1 Phenol/Chloroform 加入，剧烈混允 1-2 分钟。
高速离心 2 分钟。
小心取上清 (80-90%)。
决不能取到中间层。
可以使用等体积的反应液加入 Phenol/Chloroform 中，同样再取出上清。
将两次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。
混允时不能太温和，也不要试图取出全部上清。
2：70-80% 乙醇洗涤：洗涤时，一定要将核酸悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去。
