菌种来源 (PPTminimizer)

➢ 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况 下进行。
五、利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一）
利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率
透明圈法
变色圈法
生长圈法
抑菌圈法
将E.coli lacZ 连接在噬菌体的PL启动子下
当DNA损伤时，诱发阻遏蛋白CI分解， PL启动子启 动lacZ 基因转录，表达出-半乳糖苷酶
测定-半乳糖苷酶活性，可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物 的存在
X-Gal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside; 5-溴
3、诱变剂及使用剂量的选择 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。
诱变剂
物理诱变剂
如紫外线、X-射线、-射线、快中子、 超声波等
化学诱变剂
硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍 (NTG)、
亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类 等
紫外线 (Uv)
使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广 对诱变最有效的波长是260nm左右( 253-265nm) 作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活 性,造成菌体变异甚至死亡.
抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等
试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）
采用采联用合专试一验性菌强（的枯筛草选杆技菌术和也绿是色检产出色新链抗霉生菌素或的巴有氏效梭方法 状芽孢杆菌）分离到黄霉素
主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活 剂等建立的筛选技术 如棒酸（clavulanic acid）的发现：通过鉴定氨苄青霉素 和待测样品对-内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制作 用
又如 分离解脂微生物
豆油作底物 中性红（红～黄. 6.8～8.0. ）指示 菌落周围呈红色圈
甘油三丁酸酯为底物 罗丹明B为指示剂 荧光圈
3、生长圈法
通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和 维生素的产生菌
工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株
将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进 行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌 落周围便会形成一个混浊的生长圈
但作为初筛的手段是有意义的
2、变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
同步化前培养的具体做法：
接种培养24h的斜面入50ml基本培养基中，37ºC振荡培 养16h，然后在6ºC放置1h，以得到同步生长和分裂。将菌体 离心并悬浮于营养丰富的前培养基中，37ºC振荡培养3050min。立即降至2ºC保藏10min，再离心洗涤两次，悬浮 于冷生理盐水中。经分散、过滤、调整细胞密度，制备成菌 悬液，供处理用。
菌种来源 (PPTminimizer)
微生物工程工业生产水平 的三个决定要素:
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的 第一环节.
一、菌种分离与筛选工作程序
发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中 分离筛选出来的。
分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤： 样品采集
2、抗肿瘤药物产生菌的分离
➢ 临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑 制核酸生物合成的物质 ➢ 大部分具有抗菌或抗真菌的活性 ➢ 现发展出利用微生物筛选作用于DNA 的抗肿瘤药物
的方法，如生化诱导分析法
生化诱导分析法（Biological induction analysis; BIA）
面筛粉筛选选高加产温工低酶厂温产等酶生场的菌微通所生常易物从分，温离可泉到从、冰火产窖山淀、爆粉南发酶极处、、、深堆糖海肥化等等酶采采的样样菌；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
杨 尺 蠖
赤 松 毛 虫
侧 柏 毛 虫
四、含微生物样品的富集培养
富集(enrichment)培养
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈 法初筛
在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明 圈
如何分离磷细菌？
聚赖氨酸产生菌 （带正电、加美兰、排斥 呈现透明圈）
透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据， 因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之 间并不完全成正比。
一、自然选育
在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变 而进行菌种筛选的过程叫自然选育。
自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些 微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味 着这种突变是没有原因的。
一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变 效应和互变异构效应。
2）使用一聚合或复合形式的生长限制成分
3）避免使用容易同化的碳（如葡萄糖）或氮（如 NH4+），它们可能引起分解代谢阻遏。 4）确定含有所需的辅因子（如Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+）
5）加入缓冲液以减少pH变化
七、一些生物活性物质产生菌的分离
抗生素 抗肿瘤药物 酶抑制剂 生长因子 等等
1、抗生素产生菌的分离
快中子
中子是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电减速器或 原子反应堆产生。
菌种选育
应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变 异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。
菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量 和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。
菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、 代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。
自然选育 诱变育种 杂交育种 (有性、准性) 原生质体融合育种 基因工程育种 （详后）
诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变
对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选 获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。
诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品 质量、扩大品种和简化生产工艺。
目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。 以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过多 次诱变育种现已达50000-100000U/ml。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
六、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
自然选育的一般程序：
制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释
在固体平板上分离 挑取部分单菌落进行生产能力测定 经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株
自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌 种衰退、稳定生产、提高产量等目的。
自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难 使生产水平大幅度提高。
二、 诱变育种
-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）
作显色底物； 反应后呈蓝色
3、酶抑制剂产生菌的分离
➢ 某些酶与病理相关 ➢ 如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶，
它就可能在体内有药理作用 ➢ 选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶
靶区
抗高血压 抗糖尿病 抗血脂症 抗组氨
靶酶
血管紧张素转移酶 -淀粉酶、蔗糖酶等
2）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。
3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营 养要求低等。
4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感 性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发 菌株。例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素 的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。
缩合酶 组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶
4、生长因子产生菌的分离
通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长， 来检测生长因子产生菌。
分离培养基上培养
影印到能支持生长因子产 生菌生长的培养基上
Uv照射杀死菌落
铺上一层含相应生 长因子缺陷型菌株
被杀死的菌落周围有 无检测菌的生长圈
第三节 菌种选育
如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平 板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌 落即为嘌呤产生菌
4、抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选
据工估具计菌，采筛用选抗1生万素个的菌敏株感才菌能得到1株有用的抗生素 产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十
分重要。
抑菌圈法是常用的初筛方法
是在目的微生物含量较少时，根据微生物的 生理特点，设计一种选择性培养基，创造有 利的生长条件，使目的微生物在最适的环境 下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然 条件下的劣势种变成人工环境下的优势种， 以利分离到所需的菌株。
➢ 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其 他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些 抑制剂。
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
一）诱变育种的一般步骤
原始菌株（出发菌株）
诱
变
育
细胞或孢子悬液制备
种
活细胞计数
的
诱变预备处理
诱变剂处理
工
活细胞计数
作
中间培养
程
序