超声波辅助酶法提取菝葜绿原酸工艺优化

超声波辅助酶法提取菝葜绿原酸工艺优化

曾承露;黄德娜;李锋

【摘 要】目的:优化超声波辅助酶法提取菝葜中绿原酸的工艺条件.方法:通过单因素试验考察超声波提取时间、酶用量、酶解时间、酶解温度、pH,对绿原酸得率影响;在此基础上,选取对绿原酸得率影响显著因素:pH、酶解温度和酶解时间,进行3因素3水平的Box-behnken中心组合设计,采用响应面法优化分析三因素及其交互作用对绿原酸得率的影响,确定最优因素及水平并验证.结果:最佳提取条件为超声作用时间30 min,酶用量2 mg/g菝葜粉,反应体系pH值5.46,酶解温度54℃,酶解时间48 min,此条件下绿原酸得率为10.17 mg/g.结论:优化工艺合理可行,可用于菝葜绿原酸的提取.

【期刊名称】《黔南民族师范学院学报》

【年(卷),期】2018(038)004

【总页数】6页(P31-36)

【关键词】菝葜;超声波;酶法;绿原酸;响应面法

【作 者】曾承露;黄德娜;李锋

【作者单位】黔南民族师范学院 化学化工学院,贵州 都匀 558000;黔南民族师范学院 化学化工学院,贵州 都匀 558000;黔南民族师范学院 化学化工学院,贵州 都匀

558000

【正文语种】中 文

【中图分类】TQ464

菝葜(smilax china L)，别名金刚藤、铁菱角、红灯果等，百合科植物菝葜的干燥根茎是其药用部位，为《中国药典》收录品种。大多数分布于我国长江以南各省，现有60种、10种变种。其中分布于贵州全省各地占33种、3变种，多为民用中药，其应用与研究都源远流长[1]。菝葜根茎叶均可入药，主要包含甾体皂苷类、黄酮类、氨基酸等各种化学成分，其总提取物制剂已经广泛用于妇科慢性炎症、附件炎以及调节神经免疫、活血化瘀、抗肿瘤等多种疾病[2]。张清峰等[3]在研究菝葜提取物的抗氧化和对细胞增殖的影响时，发现菝葜中含较高含量的绿原酸。

绿原酸是一种酚类化合物，具有抗病毒、抗菌、清除自由基、降血糖、抗肿瘤、降压、保护心血管等多种生物活性[4]。近年来关于绿原酸类物质研究还发现，对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用，还有抗破坏人体免疫系统病毒的功能，可用于预防和治疗艾滋疾病[5]。同时，还可以作为天然抗氧化剂，应用于食品工业和医药化工行业等领域[6]。

由于绿原酸具有广泛的生物活性，因此如何有效地从菝葜中提取得到越来越受到关注。目前绿原酸提取的方法有回流提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解法等[7-9]。超声波提取技术是利用超声空化效应，产生的声冲击波引起热效应和机械作用，破坏细胞组织，现已发现其能显著强化和改善提取过程 [10]。酶法提取技术是利用酶这种生物催化剂对中草药细胞壁的有效成分进行分解破坏从而提高中药提取率，且此法操作简单、条件温和、环保无毒[11]。为合理利用菝葜资源，从中提取分离得到较高含量绿原酸，本研究采用超声波辅助酶法从菝葜中提取绿原酸，对其不同工艺参数进行筛选，并采用响应面优化工艺参数，以期为菝葜绿原酸工业化提供一种可靠的方法。

1 试验仪器与材料

1.1 仪器 数控超声波清洗机器(昆山市超声波仪器有限公司)；PHS-3C型pH计(上海精密仪器)；TU-1901 型双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；AG-285型十万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；优普超纯水器(成都超纯水有限公司)；HH-S2型数显恒温水浴锅(郑州英峪予华仪器有限公司)。

1.2 材料

菝葜购自黔南州都匀市农贸市场(采摘于2015年9月，产地：都匀市)，将其粉碎过80目筛，放置于4℃冰箱备用；绿原酸标准品(批号：110753-2014159，纯度：96.2%)购于中检所；纤维素酶(酶活力/(U/g)≥15000，批号：20140319)购自国药集团化学试剂公司；乙醇、盐酸和氢氧化钠均为分析纯购自国药化学试剂公司。

2 方法与结果

2.1 绿原酸含量检测方法

2.1.1 标准曲线的制备

以绿原酸为对照品采用紫外-可见光分光光度法测定[12]。将绿原酸标准品溶于60%的乙醇溶液中，精密吸取绿原酸标准品浓度为1.6、3.2、4.8、6.4、11.2、12.8

μg/mL的溶液各5 mL，在最大吸收峰330 nm波长处分别测其吸收度。以绿原酸浓度为横坐标，以其吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得到该曲线的线性回归方程为Y=0.0667X+0.0099(R2=0.9991)。

2.1.2 稳定性考察

分别在0、1、2、4，6 h测定同一样品溶液中绿原酸的吸光度，计算其RSD为0.61%，表明待测样品溶液在6h内稳定性良好。

2.1.3 精密度试验

取3.60 μg/mL绿原酸对照品溶液，连续测样5次，测得吸光度，计算其RSD为1.63%，表明该仪器精密度良好。

2.1.4 回收率试验 取5份已知绿原酸含量为2.30 μg、2.28 μg、2.32 μg、2.30 μg和2.36 μg样品，分别精密加入4.6 μg/mL绿原酸对照品溶液2 mL，制备供测样品溶液，测其吸光度，结果绿原酸的平均回收率为97.34%，RSD为1.18%。

2.2 绿原酸提取率的计算方法

按照“2.1”项方法测定提取液吸光度，将其代入线性回归方程计算绿原酸浓度，并计算绿原酸得率(Y)。

式中 Y-绿原酸得率，%；

C-测定的绿原酸质量浓度(mg/mL);

V-提取液的体积(mL)；

N-稀释倍数；

W-菝葜粉末质量(g)

2.3 绿原酸提取单因素试验

2.3.1 菝葜绿原酸的提取步骤

绿原酸提取工艺流程：

精密称取菝葜粉末2 g，按料液比1∶40(g/mL)加入一定pH水溶液中(通过0.1

moL/盐酸或氢氧化钠调节溶液pH)，超声波清洗器(超声功率500 W)分别作用10

min、15 min、20 min、30 min、45 min、60 min，确定适宜超声时间后进行下一步试验。

在酶用量为2 mg/g菝葜粉末、反应体系pH 5.0和酶解温度50 ℃(采用水浴锅控温)条件下，考察酶解时间(15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90

min；酶解时间从加酶开始至高温灭酶活终止)对绿原酸得率影响。

在反应体系pH5.0、酶解时间30 min、和酶解温度50 ℃条件下，考察酶用量(1 mg/g菝葜粉末、2 mg/g菝葜粉末、4 mg/g菝葜粉末、6 mg/g菝葜粉末、8

mg/g菝葜粉末、10 mg/g菝葜粉末)对绿原酸得率影响。

在酶用量为2 mg/g菝葜粉末、酶解时间45 min和酶解温度50 ℃条件下，考察反应体系pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)对绿原酸得率影响。

在酶用量为2 mg/g菝葜粉末、酶解时间45 min和反应体系pH5.5条件下,考察酶解温度(40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃)对绿原酸得率的影响。每项单因素试验结束后，滤液抽滤，按“2.1”项方法测定绿原酸含量，并计算其得率，每组试验重复3次，取平均值。

2.3.2 结果与分析

由图1A可知，当超声作用时间在10～60 min时，10～30 min之间，绿原酸得率随着时间的延长而增加，但30 min之后，绿原酸得率急剧下降，因此，超声作用时间选择30 min为宜。

由图1B可知，绿原酸得率随着酶用量的添加而逐步提高；但当酶用量大于2 mg之后，绿原酸得率并没有显著增加，因此试验中酶用量选为2 mg。

由图1C可知，随着酶解时间的延长，绿原酸得率显著增加；酶解45 min后，绿原酸得率反而开始降低，由此可以说明细胞壁已基本被破坏，再延长酶解时间，可能会导致绿原酸被氧化，从而造成绿原酸得率开始降低，因此酶解时间选为45

min进行后续试验。

由图1D可知，在40～55 ℃随着温度的升高，绿原酸得率逐步增加，当温度达到55 ℃时，绿原酸得率最高；温度继续升高，绿原酸得率开始下降，因此选酶解温度为55 ℃，进行后续响应面试验。

由图1E可知，在反应体系pH值为4.0～5.5范围之间时，随着pH值的增加而逐步升高，在pH值为5.5时，得率达到最高值，pH值继续增长，反而绿原酸得率开始降低。因此酶解反应体系pH值选择为5.5，进行下一步试验。 图1 各因素对绿原酸提取率的影响

2.4 响应面试验结果

2.4.1 响应面分析因素与水平的确定

结合单因素试验结果，选择影响绿原酸得率显著的三个因素进行响应面分析试验，分别为(A)反应体系pH、(B)酶解温度和(C)酶解时间作为自变量，以(Y)绿原酸得率为响应值，设计3因素3水平响应面分析试验。试验因素与水平数据分析见表1。

表1 响应面试验因素与水平因素水平-10+1(A)pH5.05.56.0(B)酶解温度(℃)

505560 (C)酶解时间(min)304560

2.4.2 响应面设计及结果

试验设计及结果数据分析见表2。

对表2中菝葜绿原酸得率数据采用Desing-Expert V8.0.6软件进行回归拟合分析，得到回归方程：Y=-75.28+13.1575 A+1.74275 B+0.0885C-0.036AB+0.033AC-1.56667×10-3 BC - 1.17 A2 - 0.0135 B2 -1.911×10-3C2

式中： Y为绿原酸得率，A为反应体系pH值、B为酶解温度、C为酶解时间。

结合方差分析可知(表3)，P<0.0001说明所建立多元回归方程模型极度显著，此模型可用于绿原酸提取条件优化。失拟项P=0.1557>0.05，表明失拟项差异不显著，说明方程模型的预测数值与试验数据拟合度较高。R2=0.9914，表明试验所测数值与模型预测值高度相关，拟合度大于99%。同时，回归方程的一次项A、C影响极显著；一次项B影响显著。二次项A2、B2、C2影响均极显著；交互项AC、BC影响极显著，AB影响显著；所选取试验因素对绿原酸得率的影响依次为C>A>B。

表2 Box-Behnken试验设计表及结果试验号A:pHB:酶解温度(℃)C:酶解时间(min)Y:提取率 (mg/g)1-1-109.6621-109.583-1109.7841109.345-10-19.67610-19.027-1019.4881019.8290-1-19.211001-19.29110-119.85120119.461300010.21400010.281500010.221600010.231700010.17

表3 Box-Behnken试验方差分析结果表来源平方和自由度均方FP模型2.5090.2889.76<0.0001A0.08610.08627.870.0011B0.02310.0237.480.0291C0.2510.2581.59<0.0001AB0.03210.03210.490.0143AC0.2510.2579.31<0.0001BC0.05510.05517.880.0039A20.3610.36116.61<0.0001B20.4810.48155.25<0.0001C20.7810.78252.01<0.0001残差0.02273.089×10-3失拟0.01535.008×10-33.040.1557纯误差6.6×10-341.65×10-3总和l2.5216R2=0.9914R2Adj =0.9804CV%=0.57%