超声波辅助提取金银花绿原酸的工艺优化

工作研究WORK RESEARCH

302018·7摘 要 河南封丘金银花种植区是中国最大的金银花产地之一，其金银花产量大、品质优。金银花枝叶及花常因营养丰富和药效价值而被添加到饲料中，具有抗病、增产的效果。为了优化超声波辅助提取金银花中绿原酸的提取工艺，本研究将金银花烘干粉碎之后，按一定的液料比加溶剂浸润，经超声、抽滤、浓缩等处理，借助高效液相色谱检测绿原酸含量。从液料比、乙醇浓度、超声波处理温度等方面通过单因素和正交设计优化，为金银花中绿原酸的提取提供了一定的参考。金银花是我国常见的中药材，它具有清热解毒、抗菌消炎、凉风散热、保肝利胆等众多生理活性。普遍认为，绿原酸在金银花抗菌、消炎等方面起着非常重要的作用，也常用它在金银花中的含量来判断金银花品质的好坏。我国河南封丘是全国最大的金银花种植区之一，当地金银花采收后的枝条常用来添加到饲料中，如鱼饲料、鸡饲料等。金银花饲料能有效增强鱼类肝脏总超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低丙二醛含量，从而有助于鳙鱼、草鱼等体质的增加；金银花与青霉素联用，可增强抗生素效果，有效抑制耐药性金黄色葡萄球菌的作用，且毒副作用小，无药物残留。目前金银花中绿原酸的提取方法主要有：水提法、有机溶剂萃取法、超声波辅助提取、微波辅助提取、酶解醇提等，为了提高效率常常结合两种或两种以上的方法来进行提取，尤其以超声波辅助提取简单、快速、高效。本研究将金银花烘干粉碎之后，按一定的液料比加溶剂浸润，经超声、抽滤、浓缩等处理，借助高效液相色谱检测绿原酸含量。从液料比、乙醇浓度、超声波处理温度等方面通过单因素和正交设计优化，为金银花中绿原酸的提取提供了一定的参考。超声波辅助提取金银花绿原酸的工艺优化宋琳琳* 王园园 荣丽杉（河南科技学院生命科技学院）1 材料与方法1.1 材料、试剂和主要仪器材料：金银花，购自新乡市康怡生大药房；绿原酸标准品：购自中国药品生物制品检定所；试剂：乙腈，色谱纯；无水乙醇、磷酸、蒸馏水等，以上试剂为分析纯；主要仪器：SHB-Ⅲ循环水式多用真空抽滤机，1515型高效液相色谱仪，PE-52A型旋转蒸发仪，3K15型离心机，FRQ-1010HT超声波清洗机，FW-200型高速万能粉碎机。1.2 实验方法1.2.1 工艺流程金银花→烘干→粉碎→按一定液料比加溶剂浸润→超声提取→抽滤→浓缩→过滤→取样测定。1.2.2 样品制备将金银花样品放置于60℃干燥箱中，干燥至重量不再减少为止，高速万能粉碎机粉碎，用80目的筛子筛选粉末，备用。1.2.3 绿原酸标准曲线的制备将绿原酸标准品按照文献方法制备：准确称取10.0 mg的标准品，加入60%乙醇溶解，用50ml容量瓶定容至浓度为200 ug/mL的母液。将配置好的绿原酸标准溶液放入4℃冰箱中保存备用。将母液稀释为绿原酸浓度为0.5 ug/mL、1.0 ug/mL、1.5 ug/mL、2.0 ug/mL、2.5 ug/mL，在上述色谱条件下分别进样10μL，测定峰面积，绘制绿原酸标准曲线，横坐标X为绿原酸的浓度，单位ug/mL，纵坐标Y为峰面积。色谱条件如下：色谱柱：WatersC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.4%磷酸溶液：乙腈（90：10）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：327 nm；进样量：10 μL。1.2.4单因素实验准确称取粉末1.0 g放入提前备好的洁净的250 mL锥形瓶中，按实验计划添加相应的溶剂，设置好温度和时间进行提取。得到的提取液经真空抽滤项目名称：金银花绿原酸提取工艺优化（编号BNYC2017-2-22）WORK RESEARCH工作研究

312018·7机抽滤，再经旋转蒸发仪浓缩到1 mL，用0.22 μm微孔滤膜（有机系）过滤后，最后经高效液相色谱测得其绿原酸提取率。本实验选择的单因素条件有：10∶1 mL/g、15∶1 mL/g、20∶1 mL/g、25∶1 mL/g、30∶1 mL/g的液料比；40%、50%、60%、70%、80%的乙醇；超声处理时间：20 min、30 min、40 min、50 min、60 min以及超声处理温度：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。1.2.5 正交试验在单因素试验的基础上，按照尽量减少实验次

数和寻求设计最优的原则，选择液料比、溶剂浓度、温度和空白对照进行4因素3水平的正交设计。正交因素表见表1。2 结果与分析2.1 绿原酸标准曲线

如图1所示，得到的标准曲线方程为：Y＝471148.38X－58470.72，R2＝0.9971，绿原酸浓度在0.5～2.5 ug/mL范围内满足良好的线性关系。2.2 单因素对金银花中绿原酸提取率的影响2.2.1 不同溶剂浓度对绿原酸提取效果的影响根据图2所显示的曲线可以看出来，随着溶剂浓度的增大，绿原酸提取率呈先升高后降低的趋势，表明绿原酸的含量先升高后降低。在溶剂浓度为40%～60%时，绿原酸的含量逐渐升高，当溶剂浓度为60%时，曲线中绿原酸提取率最大；当溶剂浓度超过60%时，绿原酸提取率逐渐降低，表明绿原酸含量逐渐下降，可能是因为当溶剂的浓度大于60%时，金银花中除绿原酸以外的物质也溶了出来，形成较多的干扰物质，影响了绿原酸提取率，使得绿原酸提取率逐渐下降。因此，选取最佳的溶剂浓度为60%。2.2.2不同液料比对绿原酸提取效果的影响图3表明，随着液料比的增大，绿原酸提取率先增大后减小，绿原酸的含量先升高后降低。当液料比在10∶1 mL/g到25∶1 mL/g之间时，绿原酸提取率逐渐增大，表明绿原酸的含量逐渐增加，原因应该是溶剂乙醇量的增大，使得溶质金银花周围的物质交换加快，从而使绿原酸含量增加；当液料比在25∶1 mL/g时，绿原酸提取率最大，绿原酸含量最高；当液料比大于25∶1 mL/g时，绿原酸提取率逐渐减小，绿原酸的含量逐渐降低。这可能是因为当溶剂的量到达某个点时，绿原酸含量稳定在一定的水平，即绿原酸提取量已经达到最大值，反而因为溶剂乙醇量的增加，增大了杂质物质的溶出量。液料比为25∶1 mL/g时对绿原酸的提取最为合适。2.2.3不同超声处理时间对绿原酸提取效果的影响超声波作用于金银花粉末，造成金银花细胞之表1 正交试验因素水平表 水平 液料比A 乙醇浓度B 提取温度C 1 20∶1 50% 60℃ 2 25∶1 60% 70℃ 3 30∶1 70% 80℃

图1 绿原酸标准曲线图2 乙醇浓度对绿原酸提取率的影响

图3 液料比对绿原酸提取率的影响工作研究WORK RESEARCH

322018·7间有节律的疏密变化，这种变化会对细胞造成压力而破坏细胞结构，使细胞内部物质更易于流出。随着超声波辅助处理时间的增长，一般所需提取的物质浓度会逐渐增大，但超声处理时间过长，水温上升，热敏性提取物结构遭到破坏或分解，反而提取率会下降，因此选用合适的处理时间非常重要。实验结果如图4所示，随着超声处理时间的增加，绿原酸提取率先增大后减小。当超声处理时间低于40 min，绿原酸的含量逐渐升高；当超声处理时间在40 min时，绿原酸提取率最大，绿原酸含量最高；当超声处理时间大于40 min后，绿原酸提取率逐渐减小，表明绿原酸的含量逐渐降低。降低的原因可能有几下几种：随着超声处理时间的延长，绿原酸的性质发生了改变，从而导致绿原酸含量下降；随

着超声处理时间的延长，使得部分杂质成分溶出，从而使绿原酸的含量下降。因此，提取时间为40 min时对绿原酸的提取最为合适。2.2.4不同超声提取温度对绿原酸提取效果的影响图5可以看出来，随着超声处理温度的升高，绿原酸提取率先增大后减小，表明提取液中绿原酸的含量先升高后降低；当超声温度低于70℃时，绿原酸的含量随超声处理温度的增高而逐渐升高，因为温度升高，溶液中的分子运动加快，使得绿原酸的溶解速度加快。当超声处理温度高于70℃时，绿原酸的含量随超声处理温度的升高而降低，这可能是因为提取液中的绿原酸受热容易分解，且随着温度的升高乙醇挥发加速而浓度下降，从而导致绿原酸含量下降。因此，选取最佳超声处理温度为70℃。2.3正交试验结果及分析根据表2正交试验所得提取率变化、极差分析表明：影响超声提取金银花中绿原酸的因素依次为液料比＞超声处理温度＞乙醇浓度，从金银花中绿原酸超声辅助提取的最优组合是：A3B2C3，即液料比为30∶1 mL/g，乙醇溶液浓度为60%，超声波处理温度为80℃。根据表3方差分析得到的F检验结果，液料比（A）对提取率的影响显著，

而乙醇浓度（B）和提取温度（C）对提取率影响不显著，由此可知，料液比对金银花绿原酸提取

率影响最大。图4 超声处理时间对绿原酸提取率的影响

图5 超声处理温度对绿原酸提取率的影响表2 正交试验结果编号 A B C D（空白） 绿原酸提取率%1 1 1 1 1 6.0702 1 2 2 2 6.2773 1 3 3 3 7.2104 2 1 2 3 2.5175 2 2 3 1 4.8566 2 3 1 2 3.0767 3 1 3 2 7.2678 3 2 1 3 7.0419 3 3 2 1 7.961K1 6.519 4.618 5.396 K2 2.816 6.058 4.585 K3 7.090 5.749 6.444 R 4.274 1.440 1.859表3 正交实验方差分析表变异来源 偏差平方和 自由度 F值 P* 液料比（A） 32.297 2 19.693 ＜0.05乙醇浓度（B） 3.448 2 2.102 ＞0.05提取温度（C） 5.214 2 3.179 ＞0.05误差 1.640 2 1.000 总变异 42.599 8 注：F（2,2）＝19（下转第46页）科技视野HORIZON OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

462018·7鸡的发病率及死亡率都有所上升，但添加牡丹籽蛋白肽的试验组，因舍内氨气含量有所降低，发病率和死亡率显著降低（P＜0.05），见表4。

3 讨论3.1 牡丹籽蛋白肽对肉鸡舍氨气浓度的影响鸡舍中，氨气产生的来源是粪便和尿液中含氮有机物的分解及肠道排放的废气。当饲料中的蛋白质类物质利用率低时，肠道中易产生较多的氨气，粪尿中残存的氮化合物较多时，会产生很多氨气，从而污染环境。本试验中，添加牡丹籽蛋白肽后，氨气浓度明显降低，应该是饲料中加入牡丹籽蛋白肽后，提高了饲料中蛋白质的吸收率，粪尿中残存的含氮化合物减少的缘故。因为有研究表明，饲料中添加蛋白肽后，能够提高氮在体内的沉积率和减少粪尿中的蛋白质含量。另外，不少研究证明，当粪尿中残存的蛋白质减少时，氨气的产生和释放量就相应降低，进而减少鸡舍中的氨气浓度 。3.2 氨气对肉鸡的危害肉鸡因生长速度快，因此对空气的质量要求较高，但冬季为了鸡舍保暖而通风较少，氨气等有害气体浓度较高，严重危害肉鸡的生产性能及健康。本研究中随着鸡舍内氨气浓度升高，肉鸡的眼病和呼吸道疾病直线上升，死亡率也明显提高，原因大概是鸡舍内空气中氨气浓度升高时，肉鸡体内血氨浓度升高超过正常范围，采食中枢神经抑制引起采食量下降。又因氨气极易溶解在鸡眼部和呼吸道黏膜的水分中，对这些部位的黏膜造成碱性腐蚀伤害，使这些黏膜失去了天然保护屏障后，更易感染病毒和细菌，因此氨气浓度较高时，肉鸡的发病率和死亡率都有所上升。3 小结牡丹籽蛋白肽主要是通过增强肉鸡对饲料中的蛋白质吸收能力，减少粪尿中的含氮物质，从而起到显著降低鸡舍中的氨气浓度的作用。鸡舍内空气质量提高，氨气含量少了，对鸡眼部和呼吸道的刺激也相应减少，因此降低鸡的眼病和呼吸道疾病发病率，最终降低肉鸡死亡率。（参考文献略）表3 各周舍内氨气浓度时间 空白对照组 试验组7d 25.2 ±3.3a 17.8 ±3.1b14d 32.5 ±4.0a 21.9 ±5.0b21d 39.9 ±5.8a 26.2 ±4.8b表4 每周发病率、死亡率统计结果 项目 时间 空白对照组发病率/% 试验组发病率/% 7d 1.90±0.52a 1.01±0.29b 眼病 14d 2.51 ±0.58a 1.32±0.30b 21d 3.14 ±0.40a 1.78±0.31b 7d 1.62±0.22a 0.98±0.13b呼吸道 14d 2.40 ±0.56a 1.29±0.30b 21d 2.62 ±0.42a 1.48±0.22b 7d 1.11±0.12a 0.91±0.07b死亡率 14d 1.42±0.20a 1.00±0.13b 21d 2.13±0.24a 1.39±0.18b