实时荧光定量PCR技术进展

・综述・

作者单位:100024,北京天坛生物制品股份有限公司乙型肝炎室(洪云,李津);300192,天津博荟生物制品有限公司(汪和睦);100024,北京生物制品研究所(赵铠)通讯作者:李津,E-mail:leegene@126.com实时荧光定量PCR技术进展

洪云　李津　汪和睦　赵铠

【摘　要】　实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)技术是一种新型的核酸定量检测、分析技术,它通过在PCR扩增反应过程中加入荧光物质,使得对反应过程的实时监控成为可能。它具有实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点,已逐步成为分子生物学研究中的重要工具。【关键词】　聚合酶链反应;实时定量;荧光

Progressinreal-timequantitativePCRtechniqueHONGYun

,LIJin,WANGHe-mu,ZHAOKai.BeijingTiantanBiologicalProductsCompanyLimited,Beijing100024,China【Abstract】　Real-timequantitativePCRisanewlydevelopedtechniqueforbothnucleicacidanalysisandquantitativemeasurement.Becauseofusingfluorescencematerialinthereaction,theprocessofthePCRcouldbewellinspected.Themeritsofthereal-timequantitativePCR,suchasitsgoodaccuracy,quicknessandrepeatability,enableitasoneofthemostimportanttoolsintheresearchofmolecularbiology.【Keywords】　PCR;Real-timequantitative;Fluorescence

1971年Khorana等最早提出PCR理论:“DNA变性解链后与相应引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段,核酸体外扩增设想似乎不切实际,且Smith等已发现了DNA限制性内切酶,使体外克隆基因成为可能,Khorana等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)引入PCR,使扩增反应的特异性和效率大大提高,并简化了操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化,迅速推动了PCR的应用和普及。PCR技术问世后,由于其良好的实用性,在生物医药领域得到广泛的应用。随着应用的不断推广和对其认识不断加深,基于经典PCR又衍生出很多新技术,包括原位PCR、逆转录PCR、锚定PCR、套式PCR、定量PCR等,其中实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)技术以其实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点成为分子生物学研究中的重要工具。本文介绍了该技术的主要原理和应用。

一、PCR基本反应原理及要素PCR反应是将处于同一密闭反应管中的一对寡聚DNA引物、模板以及耐热DNA聚合酶,经变性(DNA双链解离为单链)、退火(引物与DNA模板结合)、延伸(在耐热DNA聚合酶作用下合成与模板互补的DNA链)等步骤后合成一条全新的双股DNA链。反复进行以上流程,可使模板DNA以几何级数得到大量扩增。PCR体系中的基本要素包括DNA模板、一对寡聚DNA引物、耐热DNA聚合酶、反应所需的循环温度等条件。

二、实时荧光定量PCR1992年Higuchi等首次提出用动态PCR和封闭式检测方法对目的核酸数量进行实时分析,最初是将荧光计与PCR仪相连接,在反应管中加入可与双链DNA分子结合而发射荧光的染料,在PCR扩增过程中,随循环扩增产物不断增加,与扩增产物结合的染料所产生的荧光也不断增强,可通过荧光计检测到的荧光强度估算扩增产物量。在PCR扩增反应达到平台期前,靶序列的扩增效率相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增・161・国际流行病学传染病学杂志2006年6月第33卷第3期InterJEpidemiolInfectDis,June2006,Vol.33,No.3加。在扩增产物量一定的情况下,起始模板数越多,所需循环数就越少[1],以循环数为横坐标,以一系列标准DNA分子的起始拷贝数的以10为底的对数为纵坐标作图,可得到一条直线。未知样本中的靶序列可以通过对照这种标准曲线的方法来定量。实时荧光定量PCR通过检测荧光强度变化来反映扩增产物量的情况,适合定量分析靶序列[2]。

三、荧光化学基础实时荧光定量PCR所使用的荧光化学方法主要有DNA结合染料、双标记探针(taqmanprobe)、分子信标(molecularbeacon)及FRET探针(fluorescenceresonanceenergytransferprobe,荧光共振能量转移探针)等。1.DNA结合染料DNA结合染料是荧光定量PCR最早使用的化学物质,染料分子主要包括溴化乙锭、SYBRgreenⅠ、　唑磺衍生物[3]等,这类染料可在插入或结合双链DNA分子后发射荧光。在PCR反应体系中加入过量荧光染料,当每一反应循环末期有新的双链DNA形成时,染料与之结合后发射荧光信号,通过检测信号的强度就可间接反映目的DNA合成的水平。由于荧光染料可非特异性地渗入任何PCR产生的双链DNA中,如反应中出现非特异性扩增产物或引物二聚体,实验将出现假阳性信号,降低其灵敏性。在某些情况下,染料发射的荧光几乎与起始靶DNA的含量间没有任何对应关系。为了解决该问题,在实验完成后还需对扩增产物进行荧光寡核苷酸熔解曲线[4]分析,以确定是否存在非特异性扩增产物。2.双标记探针该探针又称TaqMan技术,该技术是在PCR反应体系中引入了一个寡核苷酸探针,该探针与被扩增DNA序列特异结合的部位处于两端引物的中部,其5′端标记了报告荧光基团,3′端标记淬灭荧光基团。探针完整时,由于3′端荧光淬灭基团的存在,使5′报告荧光基团的荧光不能被检测到。在PCR反应退火阶段,探针和引物均与靶DNA特异结合,而后在DNA聚合酶的聚合作用下,引物延伸至下游探针,此时DNA聚合酶利用其5′→3′外切酶活性切断探针,使两种基团分离,报告荧光基团发射的荧光即可被检测到[5]。每一次扩增子的产生对应于一个荧光基团的发光,仪器在每个循环的延伸阶段检测荧光,根据荧光强度推算出扩增水平。双标记探针技术的出现解决了荧光染料非特异性的缺点,反应结束后不需进行寡核苷酸熔解曲线分析,缩短了实验时间。其缺点是探针标记成本较高,不便普及应用,定量的准确性有赖于聚合酶的外切活性。3.分子信标[6]该探针也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子,与双标记探针不同的是,该探针5′和3′末端自身可形成8个碱基左右的发卡结构,此结构使荧光分子和淬灭分子邻近,荧光被淬灭基团吸收。PCR反应的高温变性阶段发卡结构被破坏,退火时与靶DNA序列特异性结合,此时荧光分子和淬灭分子彼此在空间上产生足够的距离,淬灭基团不再吸收荧光。此时的荧光强度与溶液中合成的模板量成正比,可用于PCR定量分析。该技术与双标记探针相比,避免了DNA聚合酶外切活性对检测结果的影响,缺点是发卡结构在高温变性阶段有时不能完全打开,探针不能完全与模板结合,影响实验结果稳定性。由于探针合成时标记较复杂,成本相对较高。4.FRET探针[7]FRET探针技术是将供体荧光素分子和受体荧光素分子分别标记在2个独立的特异性探针上,供体荧光素标记在探针的3′端,受体荧光素标记在探针的5′端。两探针为与同一条模板链互补的、前后相邻的核酸序列,杂交时两探针的供体荧光素分子和受体荧光素分子紧密相邻,两者产生荧光共振能量转移,使受体荧光基团发出荧光;当两探针处于游离状态时,供体和受体荧光素分子相距较远,不能发生能量转移而不产生荧光。由于荧光强度与起始模板的量成正比,可以进行PCR定量分析[8]。反应中使用了2个探针,增加了检测的特异性,另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析,从中获取有用的信息。

四、定量方法实时荧光PCR的定量方法大致可以分为绝对

定量和相对定量两大类。绝对定量是指用样本同已知的标准曲线进行比较来推算样本的靶DNA量。相对定量是指在一定样本中靶序列相对于另一参照品序列的量。1.绝对定量法该方法是利用标准品作一条标准曲线,通过标准曲线对样本进行定量。绝对定量标准品一般是用・261・国际流行病学传染病学杂志2006年6月第33卷第3期InterJEpidemiolInfectDis,June2006,Vol.33,No.3质粒DNA或是PCR扩增产物等制备的。标准品的量根据260nm的吸光度值计算得出。由于样本的浓度完全是通过标准曲线来确定,所以合适的标准品是定量准确的关键。一方面标准品与未知样本应具有一致的扩增效率,另一方面标准品的定量必须准确。这就要求标准品的扩增序列与样本完全一致,制备的标准品纯度要高,不应含有影响定量的因素如Dnase、标准品与未知样本各自反应体系内的干扰因素要一致等。该方法的优点就是测定范围很广(10～1010拷贝),结果可直接通过软件得出,不需额外计算。2.内参法相同条件下,在同一试管内同步扩增来自样本的一段靶序列和另一段内参序列(如看家基因),通过比较2种序列的扩增量来对靶基因定量。该方法可以避免绝对定量中标准品定量误差对结果造成的影响,在测定细胞内基因拷贝数时,不需要进行细胞计数,不需测算细胞破碎率,简单易行。需要注意的是只有当靶序列与内参序列以相同效率扩增时才能获得理想的结果。3.相对定量反应循环值(Ct)比较法Ct值是指扩增产物量达到临界值时所对应的循环数。该方法不需要标准曲线,它是根据PCR扩增反应的原理,假设每个循环增加1倍的产物数量,在PCR反应的指数期得到扩增产物的Ct值来反映起始模板的量,通过数学公式来计算相对量。它也需要一个参考品,最终结果也是靶序列和参考品的相对比值。该方法需确定靶序列和参考品的扩增效率是否一致,如不一致则会影响结果的准确性。

五、实时荧光定量PCR技术的应用与展望实时定量PCR的应用非常广泛。在科研方面,可定量分析各种基因的表达[9]、分析基因突变和多态性[10]、分析细胞因子的表达[11]、单核苷酸多态性(SNP)[12]测定及易位基因的检测[13]等;在医疗方面,可用于免疫组分分析[14]、临床疾病早期诊断、病原体检测[15]、耐药性分析[16]、肿瘤研究[17]和微小残留病变(MRD)[18]检测等;还可以在进出口检验、公安系统、考古与物种分类等方面发挥重要作用。实时荧光定量PCR与其他一些技术的结合应用,是今后发展的方向,如与高级微型解剖技术结合后,能提高形态学损伤所至低水平扩增的检测能力[19]、可定量分析石蜡包埋储存样本中的核酸[20]及少量细胞中的全部转录产物[21]等。此外,微阵列实验中所选基因表达水平的测定仍需使用实时PCR技术[22,23],利用该技术还可使等位基因特异表达分析以及生化武器证据甄别成为可能。