猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备及鉴定

动物医学进展，２０１３，３４（１１）：２７—３１　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备及鉴定　

唐　娜　，王金良　，张春玲。，董　林　，祖立闯。，　

曲光刚　，谢金文　，张松林　，柳增善。，沈志强　（１．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州２５６６００；２．吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春１３００６２；　３．山东绿都生物科技有限公司，山东滨州２５６６００）　

摘要：将猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）经密度梯度离心纯化后免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，取免疫小鼠脾细　

胞与ＳＰ２／Ｏ细胞融合，间接ＥＬＩＳＡ筛选能稳定分泌抗ＰＲＲＳＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对制备出的单克　隆抗体进行生物学与免疫学特性鉴定。结果成功筛选出３株能分泌ＩｇＧ型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别　

命名为６Ａ４、３Ｆ１和７Ｆ２。３株抗体均表现良好的特异性，ＥＬＩＳＡ方法检测与其他病毒及Ｍａｒｅ－１４５细胞培养物　无交叉反应，免疫荧光染色试验表明３株单克隆抗体均可不同程度地识别细胞中的病毒而呈现特异性荧光。　

Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ说明６Ａ４、７Ｆ２能够分别特异性识别２５　ｋｕ和１５　ｋｕ蛋白。试验初步表明６Ａ４、３Ｆ１具有中和抗体　活性，７Ｆ２不具有抗体依赖性增强（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＡＤＥ）作用，但可以应用于ＰＲＲＳＶ　Ｎ蛋白　

检测。　关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；单克隆抗体；特性鉴定　

中图分类号：￥８５８．２８　文献标识码：Ａ　

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　文章编号：１００７—５０３８（２０１３）１１—００２７—０５　

ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）是影响养猪　

收稿日期：２０１３—０７－０２　基金项目：国家自然科学青年基金项目（３１２０１９１３）；农业微生物国家重点实验室开放课题（Ａｍｌｋｆ２０１２０３）　作者简介：唐娜（１９８２一），女，助理研究员，江苏连云港人，博士研究生，主要从事预防兽医学与疫苗免疫学研究。＊通讯作者　

Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｕｒｖｅｙｓ　ｏｆ　５　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｉｎ　

Ｓｅｖｅｒａｌ　Ｌａｒｇｅ—ｓｃａｌｅ　Ｄａｉｒｙ　Ｃｏｗ　Ｆａｒｍｓ　ｉｎ　Ｘｉｎｊ　ｉａｎｇ　

ＬＩ　Ｊｉｎｇ　，ＬＩ　Ｙａｎ　，ＦＡＮ　Ｗｅｉ—ｘｉｎｇ。，ＹＵＡＮ　Ｌｉ—ｇａｎｇ。，ＱＩ　Ｙａ—ｙｉｎ　，ＰＵ　Ｊｉｎｇ—ｗｅｉ。　

（１．Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｓ，Ｕｒｕｍｑｉ，ｘｉｎｊｉａｎｇ，８３００６３，Ｃｈｉｎａ；　２．Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２６６０３２，Ｃｈｉｎａ；３．Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　Ｔｗｅｌｖｅ　ｉｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｓ，Ｕｒｕｍｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，８３０００９，Ｃｈｉｎａ；　４．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ・Ｘｉｎｊｉａｎｇ，８３２０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｆｉｎｄ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ（ＩＢＲＶ），ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｒａｌ　ｄｉ—　

ａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ（ＢＶＤＶ），ａｎｄ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ（ＢＲＳＶ），ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ　３　ｖｉｒｕｓ（ＢＰＩＶ３）ａｎｄ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｒｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｄａｉｒｙ　ＣＯＷ　ｆａｒｍｓ　ｉｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ，ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅｑｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔＯ　ｄｅｔｅｃｔ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒａ　ｆｒｏｍ　ｐｒ￣ｉｍｍｕｎｅ　ｄａｉｒｙ　ＣＯＷＳ　ａｎｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｏｃｃｕｒｒｅｄ　ｉｎ—　

ｆｅｅｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄａｉｒｙ　ｆａｒｍｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅｓ　ｆｏｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ，ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｒａｌ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ，ｂｏｖｉｎｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ，ｐａｒａｉｎｆｌｕ—　ｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ　３，ａｎｄ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｒｉｓ　ｗｅｒｅ　８２．５　（６６／８０），８８．８　（７１／８０），８２．５　（６６／８０），９１．３　（７３／８０）　

ａｎｄ　８６．３　（６９／８０），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｍｉｘｅｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　２　ｔｏ　５　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　

ｄａｉｒｙ　ｆａｒｍｓ。ａｎｄ　ｍｉｘｅｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅｓｅ　ｆｉｖｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｗａｓ　ｒｅａｃｈｅｄ　ｔｏ　７　１．３　．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｆｉｖｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ａｌｏｎｅ　ａｎｄ　ｔｏｇｅｔｈｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅ　ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｄａｉｒｙ　ｆａｒｍｓ．Ｉｔ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　

ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ｆｉｖｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｓａｆｅ　ａｎｄ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｄａｉｒｙ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｕｍｅｒｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＩＢＲＶ；ＢＶＤＶ；ＢＲＳＶ；ＢＰＩＶ３；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｒｉｓ　２８　动物医学进展　２０１３年第３４卷第¨期（总第２４５期）　

业健康发展的最重要的病原体之一。上世纪末至　今，世界各国多个领域的人员，尤其是养殖场、兽医　

部门、研究人员、疫苗研发人员已经在猪繁殖与呼吸　

综合征的防控中投入了大量精力并取得了一定的成　果。但由于ＰＲＲＳＶ变异等原因，该病仍在持续流　

行中，给全球养猪业造成巨大损失。研发安全、有效　

的疫苗仍然被公认为控制和减少ＰＲＲＳＶ感染的关　键，而ＰＲＲＳＶ特异性单克隆抗体是开展ＰＲＲＳ诊　

断与研究的有效工具。本研究制备了３株特异性识　

别ＰＲＲＳＶ的杂交瘤细胞株，并进行了单克隆抗体　

特性的鉴定与初步应用。　

１材料与方法　

１．１　材料　１．１．１　细胞与病毒株　Ｍａｒｃ一１４５细胞、ＳＰ２／０骨　

髓瘤细胞由山东省滨州畜牧兽医研究院保存。高致　

病性ＰＲＲＳＶ　ＸＺｈ株分离自江苏某猪场［　，传统　

ＰＲＲＳＶ　ＶＲ２３３２株由山东省滨州畜牧兽医研究院　

保存。　

１．１．２　主要试剂　弗氏完全佐剂（ＦＣＡ）、弗氏不　完全佐剂（ＦＩＣＡ）、ＨＡＴ浓缩液、ＰＥＧ、ＨＲＰ标记羊　

抗鼠ＩｇＧ抗体、单克隆抗体亚类鉴定试剂盒均为　

Ｓｉｇｍａ公司产品；ＤＭＥＭ、胎牛血清等试剂均为　Ｇｉｂｃｏ公司产品；蛋白Ｍａｒｋｅｒ为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产　

品；重组ＰＲＲＳＶ　Ｎ、ＧＰ５蛋白由山东省兽医生物技　

术重点实验室保存。　１．２　方法　１．２．１　病毒的增殖与纯化　将ＰＲＲＳＶ　ＸＺｈ株接　

种单层Ｍａｒｃ一１４５细胞，３７℃吸附１　ｈ后加入维持　液，３７℃培养箱静置培养３ｄ～５　ｄ；细胞病变达７５　

以上时，弃去一半培养液，将剩余培养物反复冻融３　次；４℃、３　０００　ｒ／ｍｉｎ离心３０　ｍｉｎ去除细胞碎片，再　

５　０００　ｒ／ｍｉｎ离心３０　ｍｉｎ，取上清以３０　０００　ｒ／ｍｉｎ离　

心３０　ｍｉｎ，弃去上清，以少量ＰＢＳ充分悬浮沉淀；采　用２５０、３５０、４５０、５５０　ｇ／Ｉ　不连续蔗糖梯度离心，　

２０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２　ｈ，收集病毒带，以ＰＢＳ洗涤沉　

淀后，分光光度计测定病毒含量，置一８０℃分装保　

存备用。　１．２．２　抗ＰＲＲＳＶ杂交瘤细胞的制备　按照１００　ｇ／只剂量，将纯化的ＰＲＲＳＶ与等量弗氏佐剂乳化　

后，按照常规方法免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠４只，同时建立　

间接ＥＬＩＳＡ方法监测小鼠血清抗体效价，当抗体效　

价大于１：１０　时，以２００　ｆｉｇ抗原进行加强免疫，３　ｄ　

后取小鼠脾脏，制备脾细胞，与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞　按照ｌＯ：１比例进行融合。阳性细胞株的筛选与亚　克隆按照常规方法　进行，经３次细胞亚克隆且阳　性孔率达１００　时，对获得的杂交瘤细胞株进行扩　

大培养，收集上清并冻存细胞。　１．２．３小鼠腹水的制备分别将亚克隆鉴定后的　

阳性细胞株按照文献Ｅ３３方法注射Ｂａｌｂ／ｃ与昆明系　杂交鼠制备腹水，采用饱和硫酸铵沉淀法初步对腹　

水进行纯化。　１．２．４　单克隆抗体亚型鉴定　按照单克隆抗体亚　

型鉴定ＥＩ　ＩＳＡ试剂盒操作说明书，对得到的各株杂　交瘤细胞上清进行亚型鉴定。　

１．２．５　染色体分析　参考文献［４］方法应用秋水仙　素处理杂交瘤细胞株，吉姆萨染色进行细胞染色体　数目分析。　

１．２．６　交叉反应性鉴定分别将ＰＲＲＳＶ　ＸＺｈ株、　ＶＲ２３３２株、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病　

毒、猪细小病毒、ＰＲＲＳＶ重组Ｎ蛋白、ＧＰ５蛋白等　８种抗原根据蛋白含量不同稀释至约０．０１　ｍｇ／ｍＬ，　

包被酶标板，以所制备的单克隆抗体为一抗，以　ＨＲＰ标记羊抗鼠ＩｇＧ为二抗。正常Ｍａｒｃ一１４５细胞　

冻融离心后的上清液为阴性对照，ＰＢＳ为空白对　照，按常规方法进行间接ＥＩ　ＩＳＡ，分析单克隆抗体　

的交叉反应性。　１．２．７　间接免疫荧光染色鉴定　用ＰＲＲＳＶ　ＸＺｈ　株接种长满单层Ｍａｒｃ一１４５细胞的４８孔细胞培养　

板，设置未接种ＰＲＲＳＶ的细胞对照，各培养３　ｄ后　取出，冷甲醇固定１０　ｍｉｎ，将制备的单克隆抗体做　

１：１００稀释，分别加入细胞板孔内，室温孵育１　ｈ，　

ＰＢＳ洗涤４次后，按照说明书要求加抗鼠荧光二抗，　避光室温孵育４５　ｍｉｎ后，洗涤细胞板，在荧光显微　镜下观察结果。　１．２．８　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析　将ＰＲＲＳＶ病毒液加　

蛋白裂解液裂解，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ（１２　）后，半干　法转印至ＮＣ膜上，以纯化的单克隆抗体腹水作为