猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

新疆农业大学学报󰀁2008,31(4):83~86JournalofXinjiangAgriculturalUniversity

文章编号:1007󰀁8614(2008)04󰀁0083󰀁04

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的

克隆、表达与免疫印迹

刘󰀁焕1,2,冉多良1,王一成2,袁秀芳2,徐丽华2

(1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐󰀁830025;2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,杭州󰀁320021)

摘󰀁要:󰀁将猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因克隆入原核表达载体pET󰀁28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET󰀁ORF5,将此重组质粒分别转化到受体菌E.coliBL21(DE3)中,并用诱导剂IPTG进行诱导表达,2h后表达达到高峰。经15%SDS󰀁PAGE电泳检测,表达得到的蛋白大小约为13.75kD。经WesternBlotting分析,表达蛋白能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应,具有较好的免疫原性,为研究PRRSV亚单位疫苗奠定了基础。

关键词:󰀁猪繁殖与呼吸综合征病毒;ORF5;克隆;表达中图分类号:Q786󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁

Cloning,ExpressionandImmunityBlotofORF5ofPRRSV

LIUHuan1,2,RANDuo󰀁liang1,WANGYi󰀁cheng2,YUANXiu󰀁fang2,XULi󰀁hua2

(1.CollegeofAnimalMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830025;2.ZhejiangA󰀁

cademyofAgriculturalSciences,Hangzhou320021)

Abstract:󰀁TheORF5geneofPRRSVwasamplifiedbyPCRwithasizeof375bp.TheamplifiedDNA

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3(cz)株ORF5基因序列分析及原核表达

刘涛;陈赛娟;曹洪战;刘子伟;朱子杰;苏霞;孙继国

【期刊名称】《中国兽医杂志》

【年(卷),期】2008(44)12

【摘 要】从河北沧州分离到1株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株.根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株ORF5基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF5基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一对引物(P3/P4)从重组载体pGM-ORF5中扩增出缺失了N 端28个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,并成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应.为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础.

【总页数】4页(P88-91)

【作 者】刘涛;陈赛娟;曹洪战;刘子伟;朱子杰;苏霞;孙继国

【作者单位】商务部流通产业促进中心,北京,丰台,100070;河北农业大学动物科技学院,河北,保定,071001;河北农业大学动物科技学院,河北,保定,071001;河北农业大学动物科技学院,河北,保定,071001;河北省保定市北市区动物防疫监督站,河北,保定,071000;河北农业大学动物科技学院,河北,保定,071001;河北农业大学动物科技学院,河北,保定,071001;河北农业大学动物科技学院,河北,保定,071001 【正文语种】中 文

【中图分类】S852.65

【相关文献】

1.猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达

[J], 梁望旺;徐涤平;熊忠良;刘泽文;杨克礼;伍锐;邓均华;段正赢;余爱冬;唐文娟

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报

摘 要：利用反向遗传操作技术，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）也可以被用作外源基因表达的活载体。前期研究将猪瘟病毒E2蛋白的编码基因插入了高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的非结构蛋白和结构蛋白编码间区，所拯救的重组病毒rPRRSV-E2能够在体外和体内高效表达E2蛋白。能够为猪瘟和HP-PRRS的感染提供100%的免疫保护。本研究利用rPRRSV-E2的

全长感染性克隆平台，在PRRSV基因组ORF7和3'非翻译区之间插入了转录调控序列6（TRS6）和绿色荧光蛋白的编码基因，构建并拯救了重组病毒rPRRSV-E2-EGFP，该病毒感染MARC-145细胞后，可以同时表达猪瘟E2蛋白和EGFP。外源序列在载体中能够保持遗传稳定。本研究为开发PRRSV作为病毒活载体疫苗提供了一个新的外源基因插入位点和构建策略，对今后多价疫苗的研发有重要意义。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；3'非翻译区；转录调控序列；外源基因表达中图分类号：S852.65 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）03-0012-08

Attenuated Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Vaccine Strain as a

Live Virus Vector for Exogenous Gene Expression

CHEN Jinxia1, ZHANG Kuan1, ZHANG Yujiao1, DU Nannan1, ZHENG Haihong1, LI Liwei1,2,

ZHOU Yanjun1,2, YU Lingxue1,2, TONG Wu1,2, ZHENG Hao1,2, TONG Guangzhi1,2, GAO Fei1,2

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）

PRRS，又称猪繁殖与呼吸综合征，猪蓝耳病，猪流行性流产----呼吸综合征，是近年来发现的一种病毒性传染病，给养猪业造成很大的经济损失。本病主要引起母猪繁殖障碍，仔猪肺炎和断奶前后仔猪的死亡率增高，自1987年在美国，1990年在欧洲被发现后传播蔓延速度十分惊人，病毒分离和血清检查表明，PRRS现已传遍世界主要养猪国家。1995年，我国在北京郊区首次暴发了PRRS，1996年以来，国内一些单位进行的流行病学和血清学调查证明，我国大部分省市都已有此病，且血清阳性率都很高，但呈地方性流行特征。特别是2002年大有全国一片蓝的趋势。

针对PRRS的现状，各国都已引起高度重视，近年来在流行病学，免疫学及致病机理，实验室诊断技术，综合防制等方面开展了大量的调查研究工作，PRRS的诊断与防制尤其成为当前兽医研究的一个热点。

（--）病原

PRRSV为一有囊膜的病毒，直径50---65nm,表面相对平滑，立方形核衣壳，核心直径25—35nm。PRRSV对热敏感，这种敏感性提示用于病毒分离的血清和组织样品应保存在-20C下或4C条件下，以保护样品的感染性，用脂溶剂氯仿和乙醚处理以后，PRRSV失去活性。北美和欧洲PRRSV分离株虽然不能凝集进行实验的各种红细胞，但最近的研究发现，部分毒株及用去污剂预处理的毒株可以表现出对一定动物红细胞的凝集性。

PRRSV具有严格的宿主特异性，最初是用猪肺泡巨噬细胞（ PAM）及其它组织的巨噬细胞进行病毒的分离与鉴定的，在体外培养中，PRRSV可以在猪肺泡巨噬细胞（PAM）和非洲绿猴肾细胞（vero）及其衍生的细胞系如MARC—145，CL——2621中生长。

在肺泡巨噬细胞的培养物种加入PRRSV抗体后，可使病毒的复制增强，同样在病毒中加入PRRSV抗体后，其在妊娠期胎儿体内的复制也大为增强，这种现象称为抗体依赖性增强作用（ADE）其原因可能是病毒与抗体形成免疫复合物后借助细胞表面Fc受体与PAM结合，从而促进了病毒进