猪繁殖与呼吸综合征病毒微载体培养试验研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒微载体　

培养试验研究　

刘晓航夏一今／哈药集团生物疫苗有限公司　李一经／东北农业大学动物医学学院　

猪繁殖与呼吸综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　

ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）是由猪繁殖与呼吸　综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　

ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）引起的一种以感染猪发热、厌　

食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，　

各种年龄猪（特别是仔猪）呼吸障碍为特征的高度传染性　

疾病。郭宝清等（１９９６）首次从国内疑似ＰＲＲＳ感染猪群　

中分离出ＰＲＲＳＶ，从而证实了本病在我国的存在。此病　

常为地方流行性，长期危害养猪生产，给养猪业造成巨　

大的经济损失。　

目前，猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的生产主要是　

转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖ＰＲＲＳＶ。但　

转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中对细胞和病　

毒的培养条件，如ｐＨ、溶氧、糖耗等难以监控和适时补　给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，　

劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导　

致存在生产的产品质量稳定性不够、批间差较大、产量　

低等问题。　

本研究摸素了利用微载体大规模培养Ｍａｒｃ一１４５细　

胞增殖ＰＲＲＳＶ病毒的条件，根据试验结果确定最佳增　殖条件，为以哺乳动物细胞为基质大规模增殖病毒及制　

备蓝耳病疫苗提供依据。　

一　材料与方法　

１．毒株与细胞。ＰＲＲＳＶ　Ｈｕｎ４　Ｆ１１２株病毒由中国　

农业科学院哈尔滨兽医研究所猪病分子诊断实验室惠赠；　

Ｍａｒｃ一１４５细胞由本单位保存，传代培养至５４代。　

２．主要设备与试剂。５Ｌ生物反应器（Ｂ５，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｃｙｔｏｄｅｘ－１购自ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；ＤＭＥＭ购　

自Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；其他试剂均为进口或国产分析纯产品。　３．静置培养。Ｍａｒｃ－１４５细胞生长至３ｄ～４ｄ后，　

细胞基本铺满方瓶时，先用ＰＢＳ清洗２次，再加入０．２５％　胰酶（含０．０２％ＥＤＴＡ）溶液消化，倾去胰酶，加含　

１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，吹打，Ｔ７５方瓶以ｌ：３～１：４　

的比率传代。　

４．微载体培养。　（１）微载体处理。用无ｃａ２＋、Ｍｇ２＋离子的磷酸　

缓冲液清洗并浸泡至少３　ｈ后，经１２１℃高压蒸汽灭菌　

２５　ｍｉｎ，冷却后储于４　ｏＣ密封待用。使用前用３７℃的细　

胞培养液清洗２遍。　

（２）Ｍａｒｃ一１４５细胞的反应器培养优化。　①不同初始密度细胞对细胞生长的影响。不同初始　

密度１．５×１０　个细胞／ｍｌ、３．０×１０　个细胞／ｍｌ、４．５×１０　个细胞／ｍｌ的Ｍａｒｃ一１４５细胞分别接种于５　Ｌ反应器中，　

微载体用量为３　ｇ／Ｌ，观察不同初始密度对细胞生长的影　

响，确定最佳接种细胞密度。　

②搅拌速度对细胞生长的影响。本实验分别考察了　

搅拌速度为５０／ｍｉｎ、７５　ｒ／ｍｉｎ和１００　ｒ／ｍｉｎ时Ｍａｒｃ一　

１４５细胞在ＤＭＥＭ培养基中的生长情况，微载体浓度为　３　ｇ／Ｌ。以３．０×１０　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ细胞密度接种于５　Ｌ反应器　

中，工作体积为２Ｌ，每隔８ｈ进行监测，取样计数细胞。　

③不同微载体浓度对细胞生长的影响。微载体供应　

商ＧＥ公司推荐的微载体浓度为２～３　ｇ／Ｌ，分批培养　

细胞时一般不超过５　ｇ／Ｌ。本实验考察了微载体浓度为　

ｌ　ｇ／Ｌ、３　ｇ／Ｌ和５ｇ／Ｌ时细胞的生长情况。　

④代谢产物对细胞生长的影响。Ｍａｒｃ一１４５细胞培　

养过程中，乳酸和葡萄糖的代谢情况是细胞生长的主要　

指标。因此，本研究检测细胞生长过程中葡萄糖、乳酸　

代谢情况，并对灌注策略进行分析。　５．微裁体培养ＰＲＲＳＶ病毒条件优化。　

６７　Ｅ　｜虿匿２Ｏ１６年第９期　ＷＷＷ．ｚｇｚｙＳ５／．ｃｏｍ　

（１）病毒感染量（ＭＯＩ）的确定。细胞培养４８　ｈ后，　分别以ＭＯＩ＝０．叭、０．１、０．５、ｌ和５接种病毒，检测病　

毒滴度。　（２）病毒感染时间（ＴＯＩ）的确定。细胞分别培养　

２４、４８、７２和９６　ｈ后，以１．３．１中优化的ＭＯＩ接种病毒，　

检测病毒滴度。　（３）病毒测定。样品ＴＣＩＤ　测定：将在含血清培养　

基中培养好的Ｍａｒｃ　１４５细胞消化，稀释至所需的细胞　

密度（０．８～１．０×１０　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，即每孔８　０００～１０　０００　

个细胞），向９６孔板中每４ＬＪＪｆ　１００ｕｌ细胞悬液ｌ置培养　箱中３７℃孵育２４　ｈ至细胞铺成单层约６０％丰度；取出　

孔板，吸去培养液，每孔添加约１００“ｌ　ＰＢＳ摇晃洗涤２　遍以除去血清；将１０倍比系列稀释好的病毒液加到９６　

孔板上，每孔１ｏ０　ｌ，从ｌ到ｌ１作ｌ１个梯度，从Ａ到　

Ｈ作８个重复，最后一列（Ａ１２一Ｈ１２）做阴性对照（各加　

１００　ｌ病毒稀释液），置培养箱３７￣Ｃ孵育ｌ　ｈ；吸除病毒液，　

加入１００　ｌ细胞维持液；置培养箱３７℃培养，逐日观察　

细胞病变和对照，共观察２～５日，并记录细胞病变的　

孔数，按照Ｒｅｅｄ—Ｍｕｅｎｃｈ法计算病毒的ＴＣＩＤ　同时　

以相同的方法对用转瓶培养的ＰＲＲＳ病毒液进行ＴＣＩＤ蝴　

测定。以此作为对照组。　

６．高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫原性实　验。免疫攻毒测定：用５～６周龄健康易感仔猪ｌ５头，　随机分为３组，每组５头。一组用供试疫苗进行免疫保护，　

另一组用转瓶苗进行保护；两组试验猪各颈部肌肉注射　

疫苗ｌ头份。第三组不接种疫苗，作为对照，在相同条　件下隔离饲养。２８日后，所有猪各肌肉注射检验用强毒　

ＨｕＮ，株的病毒培养液（１０　。ＴＣＩＤ，。／ｍ１）ｌ　ｍｌ，每头滴　

鼻２　ｍｌ，每Ｅｔ测温并观察２１日。　

二．结果　

１．初始细胞密度的确定。当微载体用量为３　ｇ／Ｌ时，　初始细胞密度１．５×１０　个细胞／ｍｌ、３．０×１０　个细胞／ｍｌ　

和４．５×１０　个细胞／ｍｌ使得Ｍａｒｃ一１４５细胞在微载体上　生长曲线有所差异（图１）。低初始密度（１．５Ｘ１０’个细胞　

／ｍ１）使Ｍａｒｃ一１４５细胞的延迟期延长，这是由于单个微　

载体上分布的细胞过少，同时微载体的空球率较高（图　

２Ａ），细胞生长缺乏初始密度效应而造成生长相对缓慢，　

最大细胞密度也最低，但细胞存活率始终维持在较高水平。　

４．５×１０　个细胞／ｍｌ的初始密度可以使Ｍａｒｃ一１４５细胞快　

速进入生长期，但细胞存活率相对较低，这是由于接种后　

细胞存在聚团和游离细胞不黏附的现象，虽然单个微载体　上分配的细胞个数很多，但不能提供有效的黏附生长表面，　

不利于细胞生长（图２ｃ）。所以细胞接种于微载体上培养时，　

合适的细胞初始密度（３×１０　个细胞／ｍ１）既能均匀分布细　

胞于每个微载体表面，促使细胞快速生长，同时也为细　

胞的生长预留了充裕的生长表面，最终获得较好的培养　

效果，维持较高的细胞存活率（图２Ｂ）。细胞不同密度接　种对细胞的增殖会有较明显的影响，初始密度过ＩＩ，￥Ｉｉ过　

大均不利于细胞的增殖，中密度接种较为适合。　

堇　

：　

熏　◆低密度　－＠－中密度　鲁高密度　

Ｏ　Ｂ　１６　２４　３２　４ｏ　４Ｂ　５６　６４　７２　８Ｏ　８８　９６　时间，ｈ　

图１不同初始密度的Ｍａｒｃ－１　４５细胞在３ｇ／Ｌ　

微载体上生长曲线　

豳　

Ａ　Ｂ　Ｃ　

图２不同初始密度的Ｍａｒｃ－１４５细胞在３ｇ／ｋ　

微载体上培养６　ｈ时的黏附效率比较　

２．搅拌速度对细胞生长的影响。微载体培养过程中　

为了使微载体充分悬浮，必须要有足够高的搅拌速度；　但过度的搅拌会延长细胞贴壁时间，严重损伤已贴壁细　

胞，尤其对有丝分裂周期细胞的伤害更大，导致细胞密　度降低。因此本实验分别考察了搅拌速度为８０／ｍｉｎ、　

１００　ｒ／ｍｉｎ和１２０　ｒ／ｒａｉｎ时Ｍａｒｃ一１４５细胞在ＤＭＥＭ　

培养基中的生长情况。结果如图３所示，当搅拌速度为　

８０　ｒ／ｍｉｎ时，细胞密度缓慢上升，最高细胞密度仅为　８．３×１０　ｃｅｌｌ／ｍｌ，这可能是因为搅拌速度过低，转瓶中　

氧传质速度不能满足细胞消耗，因此细胞生长不出现对　

数生长期；搅拌速度为１２０　ｒ／ｍｉｎ时，最高密度大干前者，　

但也明显小于当搅拌速度为１００　ｒ／ｍｉｎ时的最高细胞密　

度，说明这时搅拌过度，对细胞产生了严重的剪切伤害。　

搅拌速度为１００　ｒ／ｍｉｎ时，细胞快速进入对数生长期，　

５６　ｈ时细胞最高密度为１．８　Ｘ　１０。ｃｅｌｌ／ｍｌ，因此我们确定　

１００　ｒ／ｍｉｎ为最佳搅拌速度。

　ＷＷＷ．ＺｇＺｙＳｙ．ＣＯｍ　２０１６￣ｇ　９期　蜀四　

ｌ　

＝　簌　薰　

０　８　１６　２４　３２　４ｏ　４８　５６　６４　７２　８０　８８　９６　时问，ｈ　任细胞放火培养过　１Ｉ，　．ｒＵｔｆｉｔｔ１｛￣以葡萄糖代ｉｌ．ｂ，￣－生火　＿．Ｉ　８ｏｒ／ｍｉｎ　谜乳酸为特，止，灌往培养　以挖Ｉｌｌ￣Ｌ酸浓度住较低水　

－◆ｏ－　２００ｒ／０ｒ／ｍｍｌｎｉ　为目的，灌注量３～４　ｆ￣ｆ，ｑ；『｛ｌ　期以细胞维持　仔为　

灌注臼的，灌注　ｌ～２体　，逐步减少以达剑较高培　

养基利用率。　

图３搅拌速度对微载体培养ＭＤＣＫ细胞生长的影晌　

３．微裁体浓度的确定。微裁体浓度影响种ｒ细胞的　

准备　、最高　片色！锌　叟、细胞代数、换液频率币ｌ】策略，　义　为微载体价格　赞，对培养成本也存　大影响，所　

以选择合适的徽栽体｝＝ｆ∈度对大规模¨［业｛Ｅ￣ｌｌｔ胞培养有　

重要意义。微载体供应商ＧＥ公司推荐的微载体浓度为　

２～３　ｇ／Ｉ　。小实验考察ｒ微载体浓度为１　ｇ　／Ｉ　、３ｇ／［　

和５　ｇ／１　１ｌ￣ｆｆｌｔ胞的　ｋ情况，实验结果女『１　４所爪，微　

裁体浓度为ｌｇ／ｌ　时，小能提供足够的表　秋供　ｌｆ￣ｄｚ　

ｋ，细胞受到较严最的接触抑制，５６ｈ时细胞密度　仃　

５．０×ｌ０、ｃｅｌｌ，＂１１１ｌ；Ｉ　微载体浓度为３　ｇ／ｌ　千”５　ｇ／Ｉ　时，　３６　ｈ前细胞密度九ｌ】Ｊ】　别，３６～６０　ｈ前者细胞　度　

略高１：后并，最Ｉ　细胞密度分别为１．５　Ｘ　１０　ｃｅｌｌ／ｎｉ１和　

１．３×１０“ｃｅｌｌ／ｍｌ。考虑剑使用成本，选择３　ｇ／［　ｆ１；为微　

载体的使用雨最。　

毛　三　

薰　＋１ｇｔＬ　－０－３ｇｌＬ　－ｌ｝５ｇｔＬ　

Ｏ　８　１６　Ｚ４　３２　４０　４８　５６　６４　７２　８Ｏ　８８　９６　时间ｍ　

图４微载体浓度对微载体培养Ｍａｒｃ一１　４５　

细胞生长的影响　

４．生物反应器细胞培养代谢分析和灌注策略。　

Ｍａｒｃ　１４５细胞进入埘数　长期过程中葡萄糖　量迅速　降列最低值５　１１１１１１０１／，Ｉ｜，代｝身｝乳酸由０　ｍｍｏｌ／Ｉ　快速　高　

到２０　ｍｍｏｌ／Ｌ，随符细胞总数接近最大值，细胞的葡翩　

糖消耗逐渐趋１　稳定，　时乳酸含量也下降到・个较低　

的水平（图５）。山ｆ　１分Ｆ葡萄糖完全代诩－ｆ为乳酸的情　

况下，可以，仁成２分　乳酸。在细胞生长期，葡萄精消　

耗量略低１　乳酸，　成｛ｔ；＝，晚明葡萄糖　是完全代ｌ身寸生成　

乳酸，低下５０％的萧ｊ简糖完全氧化供给细胞能量。　此，　－Ｊ　＝＝　ｏ　Ｅ　Ｅ　

Ｏ　２４　４８　７２　９６　１２０　时间，ｈ　＋葡萄糖含量　＋乳酸含量　

图５　５Ｌ生物反应器ＭＤＣＫ细胞葡萄糖、乳酸含量曲线