大鼠前脊髓综合征的模型制备及评价

急性大鼠脊髓损伤Allen's法模型的改良及电生理评价李一帆;陈东;张大威;薛辉;刘佳梅【摘要】目的建立一种更实用、标准、可靠的急性大鼠脊髓撞击损伤模型,为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的进一步研究奠定基础.方法将36只成年雌性Wistar大鼠随机分成三组,每组12只.脊髓损伤(SCI)组:用自制改良的Allen's撞击器,以60gcm致伤力损伤大鼠T10胸椎对应脊髓.假手术组:只打开椎板,暴露脊髓,不造成SCI.正常对照组:正常大鼠,不做任何处理.各组定期行为学观察(BBB评分),术后30天进行组织学观察和神经电生理检测.结果 HE染色:假手术组与正常对照组基本一致的.SCI组可见灰、白质组织结构不完整,损伤区可见大片坏死灶、细胞肿胀.BBB评分:假手术组术后1周功能恢复接近正常.SCI组术后第2周开始恢复,到第3周基本停止,最终BBB评分未超过6分,两组比较有明显差异.神经电生理(SEP,MEP)检测:SCI组可以明显看到SEP与MEP的峰-峰值急剧降低,且潜伏期明显延长,差异显著(P<0.01).结论改良后的急性大鼠脊髓损伤模型制作法操作简便、重复性好,是较为理想的方法.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2010(014)008【总页数】4页(P1169-1172)【关键词】动物模型;脊髓损伤;BBB评分;电生理;改良【作者】李一帆;陈东;张大威;薛辉;刘佳梅【作者单位】吉林大学白求恩医学院,组织学与胚胎学教研室,吉林,长春,130021;长春中医药大学,基础医学院解剖教研室;吉林大学白求恩医学院,组织学与胚胎学教研室,吉林,长春,130021;广东医学院,组织学与胚胎学教研室;吉林大学白求恩医学院,机能科学实验平台;吉林大学白求恩医学院,组织学与胚胎学教研室,吉林,长春,130021;吉林大学白求恩医学院,组织学与胚胎学教研室,吉林,长春,130021【正文语种】中文【中图分类】R683.1;R687.32脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是交通、工矿事故及运动意外中常见的中枢神经系统损伤性疾病,损伤所致的截瘫严重影响伤者的身心健康,目前,脊髓损伤模型繁多,但尚无统一的分型[1,2]。

大鼠脊髓横断及半横断模型的复制动物脊髓损伤模型既可用来研究脊髓损伤的病理生理学机制，又可用来筛选有助于脊髓损伤恢复的治疗措施。

损伤模型包括以下几类：①机械损伤；②电损伤；③激光损伤；④缺血性脊髓损伤以及化学损伤。

复制机械性脊髓损伤模型的关键点，是如何使脊髓损伤客观化、定量化，并具有较高的可重复性。

脊髓横断或半横断模型最常见，方法较为简便。

1、实验准备（1）动物：SD大鼠，体重180～220g。

（2）器械：大鼠固定木板1块医用酒精棉球若干5ml一次性注射器1支弯头手术剪1把（14#，备皮用）双面保险刀片1片尖端圆钝的细钢丝钩形探针1根（可用回形针自己制作，尖端尽量磨圆）手术显微镜1架（条件允许时）直尺1把缝线及缝针（3）试剂：3%戊巴比妥钠（30mg/kg），冰冻生理盐水，温热生理盐水2、实验步骤（1）观察大鼠在脊髓损伤前的行走行为，并用针刺其后肢脚趾，观察反应情况。

（2）选择体重180～220g的雌性大白鼠，经腹腔注射3%异戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉后，腹位固定于手术台上，剪除胸腰断背部毛发，于T5~T13中线切开皮肤，钝性分离浅筋膜，剪开棘突两侧筋膜及肌肉，于T8~T9进行椎板切除术。

暴露脊髓，用温热生理盐水冲洗伤口。

（3）脊髓横断：将双面保险刀片打磨成适当的形状，尖端呈锐角，便于切断脊髓。

将一尖端圆钝的细钢丝钩形探针，沿硬脊膜外由椎管的一侧导致另一侧，轻轻提起脊髓，运用刀片往返运动（如锯木头般）切断脊髓。

此时，如脊髓完全横断，则探针可由脊髓断端取出。

用冰冻生理盐水反复冲洗伤口止血。

（4）脊髓半横断：将打磨好的尖端锐利的保险刀片沿脊髓中线（尽量避开脊髓中央动脉）垂直插入至椎管底，并向椎管一侧划开脊髓，重复一次，保证一侧脊髓完全横断。

用冰冻生理盐水反复冲洗。

（5）手术效果观察：在手术显微镜下观察伤口出血情况和脊髓断端损伤程度。

断端回缩，测量断端间隙，检查脊髓横断或半横断是否完全。

（1）脊髓损伤手术完成后，用细缝线缝合深层肌肉，逐层缝合伤口。

TRPV1与pJNK在RTX致痛模型大鼠脊髓背角的表达变化及意义背景及目的:带状疱疹后神经痛(Postherpetic neuralgia,PHN)是一种令患者绝望的疾病,是罹患带状疱疹(Herpes zoster,HZ)后最常见的并发症,被普遍认为是一种神经病理性痛的综合症[1,30]。

在北美、欧洲及亚非地区,每年每千人中就有4至4.5个新增的HZ病例[5]。

在如此庞大基数的HZ患者中,10%至20%将发展成为PHN患者[30]。

其临床症状主要是在之前疱疹所波及的皮节区范围内发生的自发性疼痛、痛觉过敏和感觉迟钝等,大多数人的症状会持续3个月至1年,更有甚者可持续数年。

PHN患者的生活质量及工作受到严重的影响,症状较重者常导致抑郁甚或自杀倾向,为家庭和社会增添了沉重的经济、精神负担[25,30,35]。

目前主要是通过药物进行对症治疗,但各类药物均无法长期有效的改善症状,并且不可避免的带来了药物副作用[4,5,25,35,47,59]。

因此,要研发出更有效的治疗手段及药物,我们首先要搞清楚PHN的确切病因及其背后的发病机制。

PHN的主要发病原因可能是潜伏于患者颅神经节、背根神经节以及整个神经轴上的自主神经节内的带状疱疹病毒再次激活而产生的相应复杂的级联反应所导致的[1,5,8,10]。

有学者于1990年首次成功将带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)导入成年大鼠体内,且病毒能够长期潜伏感染于大鼠周围神经系统中。

并由此成功构建了PHN模型大鼠,该模型逐渐成熟并大为推广[30,42,87]。

然而,该模型的构建难度大,成功率低,常以失败结局,包括VZV培养条件苛刻,热痛阈异常状态诱导困难,局部组织炎症状态,局部皮损严重甚至是vzv扩散至中枢神经系统后导致的大鼠瘫痪等等[44,67,86]。

也许正是因为模型构建难以达标,因此phn发病机制的研究进展才缓慢不前。

学者hui-linpan等人于2003年意外发现树酯毒素(resiniferatoxin,rtx)作用于成年大鼠后能够使其产生机械痛阈及热痛阈的双相变化,这种痛阈的双相变化与phn患者的临床表现十分相似[68]。

PCOS—IR大鼠动物模型的构建与评价目的建立丙酸睾丸酮（testosterone propionate，TP）及高脂饲料诱导的大鼠多囊卵巢综合征（polycyst ic ov ar ian syndrome，PCOS）胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）动物模型，并探讨其胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）特征。

方法将21 日龄雌性SD大鼠随机分为PCOS 组（10只）和对照组（10只），PCOS 组每日皮下注射丙酸睾丸酮的油剂连续8周；对照组每日皮下注射同剂量大豆油剂，连续8周。

观察卵巢形态学改变，测定血中性激素、空腹血糖（FPG）和空腹胰岛素（FIN S）浓度，并计算胰岛素抵抗指数（HOMA1-IR）。

结果模型组卵巢见多个呈囊性扩张的卵泡黄体细胞少见，颗粒细胞层减少。

与对照组比较，模型组体重增加，卵巢重量及卵巢平均体积增加（P＜0.05），血清睾酮（T），LH、LH/FSH、FINS 和HOMA-IR 均显著增高（P＜0.05）。

结论丙酸睾丸酮合并高脂饮食可成功诱导大鼠PCOS胰岛素抵抗模型。

标签：多囊卵巢综合征；动物模型；胰岛素抵抗多囊卵巢综合征是育龄期妇女常见的生殖内分泌及代谢紊乱性疾病，其病因不清，具体发病机制不明，同时至今没有最佳治疗方案，因此建立一种理想的PCOS动物模型非常重要，由于大鼠有规律的动情周期，且周期较短（4-5 d），容易在较短时间观察到更多的生殖周期，因而成为较理想PCOS造模动物[1]。

现代研究认为高雄激素血症和胰岛素抵抗是PCOS的主要内分泌特征，二者相互促进，恶性循环，参与了PCOS的病理过程，为进一步探索治疗PCOS的方案，本文采用丙酸睾丸酮及高脂饲料诱导雌性SD大鼠PCOS 动物模型，并分析其胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）特征，旨在寻找一种符合人IR 特征的PCOS 研究模型。

1实验资料与方法1.1实验动物及动物模型构建选取21 日龄的SD雌性大鼠，随机分成模型组与对照组，每组各10 只。

BBB评分BBB评分的定义：将动物放入以开口盆，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。

BBB评分(Basso, Beattie & Bresnahan locomotor rating scale, BBB scale) ,(大鼠脊髓损伤)评分标准：0分：无可见后肢运动。

1分：一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节。

2分：一个关节大幅活动或一个关节大幅活动且有另一关节轻微动。

3分：两个关节大幅活动。

4分：后肢全部三个关节可轻微活动。

5分：两个关节轻微活动，第三个关节可大幅活动。

6分：两个关节大幅活动，第三个关节可轻微活动。

7分：后肢全部三个关节可大幅活动。

8分：非承重情况下可以爪掌面着地。

9分：足底仅位于负重位，或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行。

负重：足底负重位时或仅在后躯干抬高时，HL伸肌收缩。

10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作。

11分：可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作。

12分：可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作。

13分：常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作。

14分：有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动15分：持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行16分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。

17分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。

18分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。

19分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。

大鼠脊髓损伤模型构建脊髓损伤 ( spinal cord injury，SCI) 是一种致残率高、后果严重的中枢神经系统性损伤，给个人、家庭、社会带来了沉重的负担。

建立理想的动物模型是开展脊髓损伤相关研究的首要问题。

国内外已经建立了脊髓挫伤、压迫损伤、横断损伤、缺血损伤、牵张损伤和化学损伤等多种脊髓损伤动物模型。

目前常采用小型动物（大鼠、小鼠），这是由于其大多遗传背景明确，体内微生物可控制，其性状显著稳定，质量和规格也可任意选择，并且价格低廉，易于获得，便于管理。

Allen 于 1911 年采用重物坠落撞击动物脊髓背侧，复制出脊髓损伤模型，开创了脊髓损伤的标准化实验研究。

此后很多研究者在此基础上进行了许多改进。

皮质撞击装置、空气撞击装置等能精确控制撞击力度，具有很好的可重复性，但是费用很好，限制了推广应用范围。

采用重物自由下落打击在放置于大鼠脊髓表面的垫片上, 从而造出损伤模型。

模型的特点是:①模拟人类脊髓受损的过程, 临床相似度高。

②可以人为调整致伤的部位和范围。

③硬膜具有完整性, 保证无外源性成分侵入, 防止脑脊液外漏。

麻醉后，将大鼠背部至腰部的毛剔除干净。

将大鼠俯卧固定在手术板上。

用手从大鼠的肋骨向脊柱摸动，确定第十三胸椎（与第十三肋骨连接）的位置。

再沿脊柱棘突向前，确定第十胸椎的位置。

用碘伏消毒液对背部进行消毒。

以第十胸椎为中点，纵向切一道2-3cm的切口，切开皮肤，即可看到脊椎。

再次确定第十胸椎，用剪刀沿棘突将左右两侧的肌肉与棘突分离，直到看到椎板为止。

用缝针穿过分别左右两侧肌肉往两侧牵拉，暴露棘突和椎板。

用剪刀剪去棘突与棘突之间的肌肉，将第十棘突从第九和第十一棘突间游离出来。

可以明显看到脊柱的连接处，从连接处的小口将剪刀轻轻伸入，先向大鼠右侧方向，沿椎板向内深入，剪断椎板，相同操作剪断左侧椎板。

若是能顺利剪断椎板，则用镊子提住棘突稍一用力即可将棘突处的椎骨完整取下，暴露脊髓。

该过程是操作中最麻烦也最重要的过程，伸入剪刀时，千万不能伤到脊髓。

Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)脊髓损伤的行为学评分脊髓损伤的行为学评分1、BBB法评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。

将动物放置于平台上,观察记录其后肢的行走及肢体活动。

评分分三部分第一部分为0一7分,评判动物后肢各关节活动第二部分为8一13分,评判后肢的步态及协调功能第三部分为14一21分,评判运动中爪的精细动作,三项满分为21分.实验动物分别在损伤后第周进行评分"Basso Beattie Bresnahan(BBB)运动功能评分及脚印分析术前3 d，每天由2 人分别对动物进行BBB 运动功能评分。

术后1 d、3 d 及每周对动物进行BBB 评分。

评分2 人不了解实验进程及分组情况。

在实验过程中，对BBB 评分大于8 分的动物进行脚印分析：将动物的前后足分别用绿红2 种染料标记后，置于预先铺有白纸的7.5 cm×100 cm 的跑道中，使动物从一端跑到另一端，计算大鼠同侧前后足中心的距离（interlimb coordination，ILC）及后肢第3 足趾的外旋角度(angle of rotation，AR)进行分析。

分数特征说明0无可观察到的后肢运动HL：（hind-limb，HL）后肢11或2个HL关节轻度活动轻度：≤5%关节活动范围21个HL关节大幅运动和另一关节轻度活动大幅：＞50%关节活动范围32个HL关节大幅运动2个关节：通常为髋和膝4所有3个HL关节轻度活动3个关节：髋、膝、踝；第3个关节通常为踝52个HL关节轻度运动和第3个关节大幅运动62个HL关节大幅运动,第3个关节轻度活动7所有3个HL关节大幅运动8不负重拖动或足置于不负重位拖动：节律性伸展3个HL关节,身体侧卧9足底仅位于负重位,或偶尔/频繁/持续以足背负重步行,无足底负重步行负重：足底负重位时或仅在后躯干抬高时,HL伸肌收缩10偶见负重步行,但前、后肢不协调偶尔:＞5%且≤50%：步行：足底负重触地，HL前置使足底再次触地11由频繁到持续负重步行,但无前一后肢协调频繁：51%-94%观察期；持续：95%-100%观察期12由频繁到持续负重步行,偶见前一后肢协调6%-50%协调运动13由频繁到持续负重步行,频繁前一后肢协调51%-95%协调运动14持续协调足底步行,优势爪在刚触地和抬起时旋转频繁足底步行,持续前一前肢协调,偶尔足背侧旋转：当其触地或抬起时后爪内或外旋15持续协调足底步态,当前肢向前时无或偶有伸趾,优势爪在刚触地时平行平行：后爪在刚触地或抬起时与躯干平行伸趾：听趾，拖踏音，及足音中无趾拖踏音16持续协调足底步态,频繁伸趾,优势爪触地时平行，抬起时旋转频繁伸趾：一半以上足音中无趾拖踏音17持续协调足底步态,频繁伸趾,优势爪在触地及抬起时均平行18持续协调足底步态,持续伸趾,优势爪在触地及抬起时均平行持续伸趾：4min观察期中仅有≤4次趾拖踏音19基本内容同18，尾在部分或全部观察期中垂20基本内容同18，尾持续上翘，但躯体不稳尾上翘：不触地：躯体不稳：当快速移动时,重心侧移,出现摇摆、倾斜、滑倒21基本内容同20，且躯体持续稳定躯体持续稳定：无滑倒,骨盆环与尾在运动时保持一直线B B B表评分项目表2、斜板实验(Rivline ta l.,1 977):总体评估四肢肌力。