下载文档原格式
RNA-seq中的基因表达量计算和表达差异分析RNA-seq中的基因表达量计算和表达差异分析差异分析的步骤：1）⽐对；2） read count计算；3） read count的归⼀化；4）差异表达分析；背景知识：1）⽐对：普通⽐对： BWA，SOAP开⼤GAP⽐对：Tophat（Bowtie2）；2） Read count(多重⽐对的问题）：丢弃平均分配利⽤Unique region估计并重新分配表达量计算的本质⽬标基因表达量相对参照系表达量的数值。
参照的本质：（ 1）假设样本间参照的信号值应该是相同的；（ 2）将样本间参照的观测值校正到同⼀⽔平；（ 3）从参照的数值，校正并推算出其他观测量的值。
例如：Qpcr:⽬标基因表达量（循环数）相对看家基因表达量（循环数）；RNA-seq:⽬标基因的表达量（测序reads数），相对样本RNA总表达量（总测序量的reads数），这是最常⽤的标准。
归⼀化的原因及处理原则：1）基因长度2）测序量3）样本特异性（例如，细胞mRNA总量，污染等）前两者使⽤普通的RPKM算法就可以良好解决，关键是第三个问题，涉及到不同的算法处理。
RNA-Seq归⼀化算法的意义：基因表达量归⼀化：在⾼通量测序过程中，样品间在数据总量、基因长度、基因数⽬、⾼表达基因分布甚⾄同⼀个基因的不同转录本分布上存在差别。
因此不能直接⽐较表达量，必须将数据进⾏归⼀化处理。
RNA-seq差异表达分析的⼀般原则1）不同样品的基因总表达量相似2）上调差异表达与下调差异表达整体数量相似（上下调差异平衡）3）在两组样品中不受处理效应影响的基因，表达量应该是相近的（差异不显著）。
4）看家基因可作为表达量评价依据（待定）不同的算法⽐较：以什么数值来衡量表达量：RPKM、FPKM、TPM以什么作为参照标准：TMM（edgeR软件）、De seq矫正RPKM：是Reads Per Kilobase per Million mapped reads的缩写，代表每百万reads中来⾃于某基因每千碱基长度的reads数。
➢ 基因表达谱数据基因表达谱可以用一个矩阵来表示，每一行代表一个基因，每一列代表一个样本（如图1）。
所有基因的表达谱数据在“gene_exp.txt ”文件中存储，第一列为基因的entrez geneid ，第2~61列是疾病样本的表达，第62~76列是正常样本的表达。
图1 基因表达谱的矩阵表示➢ 寻找差异表达的基因：原理介绍：差异表达分析是目前比较常用的识别疾病相关miRNA 以及基因的方法，目前也有很多差异表达分析的方法，但比较简单也比较常用的是Fold change 方法。
它的优点是计算简单直观，缺点是没有考虑到差异表达的统计显著性；通常以2倍差异为阈值，判断基因是否差异表达。
Fold change 的计算公式如下：normalDiseasex x c Fold =_即用疾病样本的表达均值除以正常样本的表达均值。
差异表达分析的目的：识别两个条件下表达差异显著的基因，即一个基因在两个条件中的表达水平，在排除各种偏差后，其差异具有统计学意义。
我们利用一种比较常见的T 检验（T-test ）方法来寻找差异表达的miRNA 。
T 检验的主要原理为：对每一个miRNA 计算一个T 统计量来衡量疾病与正常情况下miRNA 表达的差异，然后根据t 分布计算显著性p 值来衡量这种差异的显著性，T 统计量计算公式如下：ns n s x x t normal Disease normalDisease miRNA //22+-=对于得到的显著性p 值，我们需要进行多重检验校正（FDR ），比较常用的是BH 方法（Benjamini and Hochberg, 1995）。
1+=Nvt分布程序实现：●基因表达谱数据--- gene_exp.txt●Matlab软件实现mRNA差异表达分析：MATLAB软件安装好之后，双击系统桌面的MATLAB图标，或在开始菜单的程序选项中选择MATLAB快捷方式，即开始启动MATLAB。
基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
测序数据做差异表达基因分析流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!测序数据的差异表达基因分析流程详解在现代生物信息学中，差异表达基因分析（Differential Expression Gene Analysis，DEG）是研究基因功能和疾病机制的重要手段。
差异基因的分析原理是差异基因的分析原理是通过比较不同样本或条件下的基因表达水平或基因组变异特征，找出在不同情况下显著差异的基因。
差异基因分析在生物学和医学研究中具有重要的应用价值，可以帮助我们理解基因调控、疾病机制等方面的问题。
下面将从数据获取、数据预处理、差异分析及结果解释等方面介绍差异基因的分析原理。
首先，差异基因分析的第一步是获取基因表达数据。
基因表达数据可以通过转录组测序（RNA-seq）技术或芯片技术获取。
RNA-seq技术是目前最常用的获取基因表达信息的方法，它可以快速高效地测定所有基因的表达水平。
通过RNA-seq或芯片技术获得的原始数据是一个包含大量数值的矩阵，该矩阵的行代表基因，列代表样本，每个元素表示该基因在对应样本中的表达水平。
第二步是数据预处理。
数据预处理是为了剔除低质量数据，减少技术误差，并使不同样本之间的数据具有可比性。
常见的数据预处理方法包括去除低表达基因、归一化、标准化等。
去除低表达基因可以减少干扰信号，提高差异基因分析的效果；归一化可以消除不同样本之间的技术差异，使得样本之间可比性更好；标准化可以将表达水平转化为统一的尺度，方便后续的差异分析。
第三步是差异分析。
差异分析的目标是从大量的基因中找出在不同样本或条件下表达存在显著差异的基因。
常用的差异分析方法有t检验、方差分析（ANOVA）、Wilcoxon秩和检验（Mann-Whitney U test）等。
这些方法可以计算不同样本间与差异的显著性，得到每个基因的差异分析检验统计量和p-value。
通常，差异基因的筛选会设定一个显著性水平（如p-value<0.05），只有差异显著的基因才会被选出。
最后，对差异基因结果进行生物学意义上的解释。
差异基因分析得到的结果可能包含大量差异表达的基因，但这些基因的意义需要进一步解释和分析。
一般情况下，研究人员会进行富集分析，如基因本体论（Gene Ontology，GO）分析、通路分析等，以揭示差异基因在不同的生物学过程、分子功能、细胞组分以及通路中的富集情况。
差异基因表达差异基因表达是指在不同组织、不同时间或不同环境条件下，某些基因的表达水平发生变化的现象。
这种变化可能是由于遗传因素或外部环境因素导致的，它们对生物体的形态和功能具有重要影响。
差异基因表达研究是现代分子生物学和生物信息学领域中的一个重要研究方向。
它可以帮助我们了解生物体在不同条件下的适应性和适应机制，以及某些疾病的发生和发展过程。
同时，通过对差异基因表达进行分析和挖掘，还可以为新药开发、农业育种等领域提供重要参考。
差异基因表达分析通常包括以下几个步骤：1. 样品采集：收集不同组织、不同时间或不同环境条件下的样品，并进行处理，如RNA提取等。
2. RNA测序：利用高通量测序技术对样品中的RNA进行测序，并生成海量的原始数据。
3. 数据预处理：将原始数据进行质量控制、去除低质量序列、去除rRNA等预处理工作，以得到高质量的数据集。
4. 比对分析：将预处理后的数据与参考基因组进行比对，以确定每个基因的表达水平。
5. 差异表达分析：通过统计学方法比较不同样品之间的基因表达水平差异，并筛选出显著差异的基因。
6. 生物信息学分析：对差异表达基因进行功能注释、通路富集分析等生物信息学分析，以了解其在生物体中的作用和调控机制。
在差异基因表达研究中，常用的统计学方法包括DESeq2、edgeR、limma等。
这些方法可以对高通量测序数据进行标准化、归一化和显著性检验，以确定差异表达基因。
同时，生物信息学工具如DAVID、KEGG等可以帮助我们对差异表达基因进行功能注释和通路富集分析。
总之，差异基因表达研究是一个复杂而重要的领域，在生命科学研究和应用中具有广泛应用价值。
随着技术的不断进步和算法的不断优化，我们相信这一领域将会取得更加深入和广泛的发展。
差异基因表达引言差异基因表达是指在不同组织、细胞类型或生理状态下，基因的表达水平存在显著差异。
通过研究差异基因表达，可以深入了解组织与细胞的功能及其在生理和疾病过程中的作用。
本文将探讨差异基因表达的原因、分析方法及其在生物学研究中的应用。
一、差异基因表达的原因差异基因表达的原因可以归结为两类：遗传因素和环境因素。
遗传因素包括基因座的多态性、突变等DNA序列的变异，以及基因调控元件（如启动子和增强子）的变化。
环境因素包括内外部环境的改变，如营养状态、感染、药物刺激等。
差异基因表达的遗传基础主要包括单核苷酸多态性（SNP）、拷贝数变异和结构变异等。
SNP是指基因组中单个核苷酸的变异，可能导致基因表达的差异。
拷贝数变异是指某一段DNA序列的重复拷贝数目的变化，可能导致基因的过量表达或缺失表达。
结构变异是指染色体上的大片段DNA序列插入、删除、重排等的变化，这些变化可能影响基因的转录和翻译过程。
环境因素对差异基因表达的影响主要通过调控基因的表达水平来实现。
一些环境因素如营养物质、药物和化学物质等可以直接作用于细胞并改变基因转录水平。
其他环境因素如感染和创伤则通过免疫系统的活化和细胞信号传导通路的改变来影响基因表达。
二、差异基因表达的分析方法差异基因表达的分析方法可以分为两大类：基于RNA测序的方法和基于芯片技术的方法。
基于RNA测序的方法是目前应用最广泛、最准确的差异基因表达分析方法。
该方法通过建立细胞或组织的转录组数据库，将不同样本中的RNA提取、逆转录合成cDNA，并进行高通量测序。
随后，利用生物信息学手段对测序结果进行比对、拼接和定量分析，最终得到差异基因的表达模式。
基于芯片技术的方法是早期使用较多的差异基因表达分析方法。
该方法通过将样本中的RNA提取、逆转录合成标记的cDNA，并将其与芯片上的探针序列杂交，利用荧光信号检测差异基因的表达水平。
芯片上的探针通常是特异性的DNA片段，可以与不同基因的RNA序列互补配对，从而实现对基因表达的检测。
差异表达基因分析：差异倍数（foldchange）,差异的显著性（P-value）⽕⼭图Differential gene expression analysis：差异表达基因分析Differentially expressed gene (DEG)：差异表达基因Volcano Plot：⽕⼭图差异倍数(fold change)fold change翻译过来就是倍数变化，假设A基因表达值为1，B表达值为3，那么B的表达就是A的3倍。
⼀般我们都⽤count、TPM或FPKM来衡量基因表达⽔平，所以基因表达值肯定是⾮负数，那么fold change的取值就是(0, +∞).为什么我们经常看到差异基因⾥负数代表下调、正数代表上调？因为我们⽤了log2 fold change。
当expr(A) < expr(B)时，B对A的fold change就⼤于1，log2 fold change就⼤于0（见下图），B相对A就是上调；当expr(A) > expr(B)时，B对A的fold change就⼩于1，log2 fold change就⼩于0。
通常为了防⽌取log2时产⽣NA，我们会给表达值加1（或者⼀个极⼩的数），也就是log2(B+1) - log2(A+1). 【需要⼀点对数函数的基础知识】为什么不直接⽤表达之差，差直接有正负啊？假设A表达为1，B表达为8，C表达为64；直接⽤差B相对A就上调了7，C就相对B上调了56；⽤log2 fold change，B相对A就上调了3，C相对B也只上调了3. 通过测序观察我们发现，不同基因在细胞⾥的表达差异⾮常巨⼤，所以直接⽤差显然不合适，⽤log2 fold change更能表⽰相对的变化趋势。
虽然⼤家都在⽤log2 fold change，但显然也是有缺点的：⼀、到底是5到10的变化⼤，还是100到120的变化⼤？⼆、5到10可能是由于技术误差导致的。
