免疫细胞的检测47页PPT

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抗原和抗体
• 抗原的概念： 引起机体产生特异性免疫反应的物质叫做抗原。
• 举例： 病原体 寄生虫 花粉 异型红细胞 异体组织 异种动物的血清等异物
抗原决定簇示意图
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• 抗体的概念： 机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原
发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
1免疫器官 胸腺、骨髓、脾、淋巴结、扁桃体
（免疫细胞生成、成熟或集中分布的场所）
T细胞（迁移到胸腺中成熟）
淋巴细胞 B细胞（在骨髓中成熟）
2免疫细胞
（发挥免疫作用 的细胞）
（位于淋巴液、血液和淋巴结中）
吞噬细胞
3免疫活性物质 ：体液中的各种抗体和淋巴因子等
（由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质）
A、肝脏 B、脾脏 C、胸腺 D、淋巴结
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问题探讨：
前面讨论的主要是免疫系统的防卫功能，人们通过这种防卫功能，使机体 能有效地防御病原体，那么免疫系统的防卫功能是不是越强越好呢？你能不能举 几个例子？
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自身免疫病
• 自身免疫反应： 人体的免疫系统在特殊情况下，对机
既各自有独特的作用，又可相互配合共同发挥免疫效应
抗原类型
发挥免疫作用的主要方式
细菌外毒素
体液免疫
结核杆菌、麻风杆菌 等胞内寄生菌
病毒感染
细胞免疫 体液免疫、细胞免疫
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与免疫有关的细胞及其功能
来源
功能
巨噬细胞 造血干细胞
B细胞 造血干细胞
T细胞 造血干细胞在
胸腺中发育
浆细胞 B细胞或记忆B
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分析人体抵御病原体侵害的第一、二道防线
除了皮肤，还有哪些结构属于人体的第一道防线？
消化道表面的黏膜 能分泌杀菌物质（如胃 酸等） ，杀灭病原体。
分析人体抵御病原体侵害的第一、二道防线
皮肤 黏膜 阻挡、清扫病原体
功能
第 一 道 免 疫 防 线
组成
分泌杀菌物质，杀死病原体
分析人体抵御病原体侵害的第一、二道防线
发炎程度小，恢复快
模拟探究皮肤是一道保护屏障
实验结论
皮肤像苹果皮一样具有防御 病菌侵害的作用。皮肤是一道人 体的保护屏障。
分析人体抵御病原体侵害的第一、二道防线
皮肤为什么能成为抵御病原体入侵的第一道防线？
角质化 细胞
细胞排 列紧密 汗腺
皮脂腺
皮肤结构模式图
分析人体抵御病原体侵害的第一、二道防线
八年级下册
人体的免疫防线（二）
主讲人：张翀（苏州立达中学）
模拟探究皮肤是一道保护屏障
提出问题 作出假设
皮肤能像苹果皮一样阻挡病菌的侵害吗？
皮肤
像苹果皮一样阻挡病菌的侵害。
制定计划
实验材料和用具
模拟探究皮肤是一道保护屏障
实施计划
模拟探究皮肤是一道保护屏障
请各小组交流 本次实验的实施情 况和实验结果。
分析人体抵御病原体侵害的第一、二道防线
分析人体抵御病原体侵害的第一、二道防线
科学家曾经做过这样一个实验： 把一种致病的链球菌涂在健康人的手 部皮肤上，三分钟后，链球菌的数量 为3000万个，一个小时后，变成了170 万个，两小时后变成了3000个。
分析人体抵御病原体侵害的第一、二道防线
分析人体抵御病原体侵害的第三道防线
第三道防线与第一、二道防 线有何不同？ 人后天获得的， 只针对某一特定的抗 原起作用的免疫功能。

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细胞废用性死亡(被动)
抗原剌激↓生长因子↓ ---- 细胞代谢↓ 线粒体退变
---- 细胞色素C释放 ---- caspace级联反应 ---- 细胞凋亡
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Fas三聚体胞内有3DD→吸引胞
浆内FADD(DD+DED)
→激活caspase8→启动半胱 (C)天冬(asp)蛋白酶(-ase)的级 联反应→DNA片段化、染色质 浓缩、胞膜泡化、细胞皱缩
1.活化的两个信号 2.Th1细胞募集巨噬细胞到感染部位
（1） 分泌IL-3和GM-CSF ：刺激骨髓内新单核细胞 的产生；
（2） 分泌TNF-和TNF- ：扩张血管和改变血管内皮细 胞粘附分子(如ICAM-1)的表达,分泌MCP-1 吸 引聚集巨噬细胞。
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（2）对MHC II类分子提呈抗原的识别
—— 外源性抗原的提呈过程 指抗原在囊泡系统内被酶降解成小肽片段，与MHCII
类分子结合，运送到细胞表面，供CD4＋T细胞识别的过程。
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二、 T细胞的活化、增殖和分化
接受信号刺激、转导信号、胞内酶活化，
表达的Fas 结合，启动凋亡程序；
3、反复循环杀伤
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本章要点
1.细胞免疫应答的概念； 2.TD抗原处理，加工和递呈的一般途径； 3.T细胞的抗原识别方式； 4.T细胞活化的信号刺激； 5.T细胞介导的特异性免疫效应。
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第一节 T细胞对抗原的识别
抗原识别：初始T细胞表面TCR与APC表面的抗原 肽-MHC分子复合物特异性结合的过程，是T细 胞特异性活化的第一步。

免疫细胞（Immune cells） 泛指所有参与免疫应答及与免疫应答活动相关的细胞。
免疫活性细胞（Immune competent cell，ICC） 能够接受抗原刺激、产生特异性的活化、增殖、分化并形成效
应产物的淋巴细胞。
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免疫细胞的类型
红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细
半抗原-C-O-C-O-CH2CH（CH3）2 + 蛋白质- NH2 半抗原-CO- NH -蛋白质 + HO-CH2CH（CH3）2
半抗原与载体直接联接
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琥珀酸酐法
OO 半抗原-CH2 –OH + C-O-C
CH3 CH3
O 半抗原-CH2 –O-C-(CH2 ) 2-COOH
半抗原与载体间接联接
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第二节 有关免疫学基本概念
一、抗原的概念与属性 二、免疫细胞的概念与分类 三、免疫应答的概念与过程
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抗原的概念与属性
免疫原性——可识别、可反应性 （诱导机体产生免疫应答的特性） 免疫反应性 ——选择结合性 （和免疫应答产物特异性结合的特性）
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免疫细胞的概念与分类
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免疫应答的概念与过程
免疫应答（immune response） 免疫系统接触抗原后，免疫细胞对抗原进行识别；并使特异性淋巴细胞
活化、增殖；表现出免疫效应的过程。 免疫应答的阶段 1、抗原识别阶段（antigen-recognizing phase） 2、淋巴细胞活化阶段（lymphocyte-activating phase） 3、抗原清除阶段（antigen-eliminating phase）

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产黄青霉菌落 细菌生长 抑制区域 正常细菌 生长区域
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6、现代(xiàndài)微生物学的发展
随着(suízhe)现代生物学，化学，物理学等基 础学科的发展，推动了微生物学的发展 ，如电子显微镜，PCR技术，基因工程 技术，分子杂交等，使微生物的诊断和 传染病治疗等得到快速的提高。
2、学好微生物学需以生物学、细胞学、 生理学和生物化学为基础，同时也为学 好以后的传染病和中药学等课打下基础 。
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3、通过课程的教学(jiāo xué)，要求学生掌握 医学微生物学 基本概念、理论和微生物 观察、接种分离和鉴别技术，为今后实 践工作打好基础。
二、教材：医学微生物与免疫学 三、参考书： 1、医学微生物。北京大学医学出版社 2、动物微生物学 中国农业出版社 3、兽医微生物学 中国农业出版社
微生物的特点
5、分布(fēnbù)广，种类多
种类
(多zhǒngl地èi)球上的微生物： 估计(gūjì)有100万种以上
已发现的微生物： 约有10万种 已开发利用的微生物： 约1000种
微生物的微观性 研究手段的限制 分离培养的局限
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6.
地球形成于46亿年
前，微生物产生于35亿年前，人类的形
微生物学是研究微生物的形态，结构， 生命活动规律，进化，分类、以及与人类 (rénlèi)，动植物，自然界相互关系的一门学科。
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（六）医学(yīxué)微生物学
Medical Microbiology
医学微生物学主要研究病原微生物的生物学特性以 及与人类相互关系的科学。
近20年来(niánlái)，医学微生物学有很突出的研究进展

4. 膜结构和抗体包被
关于膜的一些参数（单孔面积）
厚度：120-150um 最大蛋白吸附量： 80-100 ug ELISPOT所需量：1 ug 包被抗体集中于膜表面1um (透明板容纳量为：30-40 ug)
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ELISPOT实验的难点在于细胞处理与培养
▪ 从外周血提取淋巴细胞时, 应避免凝血引起的细胞活 性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过6小 时。
10. 预培养法经与过预直孵接育，法斑点更分散，清晰
可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；粒 细胞的影响（虫啃）也可以大大减轻
某些细胞因子通常很难用直接法得到结果，比如颗粒酶、 IL-10
预孵育的缺点：
需要长时间孵育刺激，更为严格的无菌操作环境
需耗费额外的物资和时间
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IFN-γ直接法与预培养法 比较
1 . E L I S P❖O T 一加入般生物操素标作记流的检程测抗体
37 ℃ 1h，洗涤；
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7
❖ 加入酶联亲和素37 ℃ 1h， 洗涤；
❖ 加入显色底物，显色
10~40min；
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❖ 获得斑点，计数。
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细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染 细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开
direct
通 常 的 包 被 条 件 是 4 ℃ 过 夜 ， 也 可 以 室 温 2 小 时 37 ℃包被不能超过1小时，否则包被效率急剧降低 膜 吸 附 能 力 远 远 超 过 包 被 抗 体 的 量 ， 所 以 需 要 封 闭 包 被 后 必 须 接 着 封 闭 ， 否 则 包 被 抗 体 会 逐 渐 失 活 封 闭 之 后 用 纯 水 或 P B S 洗 涤 ， 可 以 在 4 ℃ 长 期 存 储

内源性过氧化物酶的阻断
一抗孵育，TBS漂洗 二抗孵育，TBS漂洗
DAB显色，蒸馏水中止反应
苏木素复染及封片
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切片
烤片
脱蜡水化
H2O2处理
热修复
二抗 Enlivision试剂
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DAB显色
一抗
苏木素复染
IHC染色结果的判读原则
细胞增殖相关蛋白：Ki67、PCNA 转录因子：MyoD1、myogenin、TTF-1、CDX2、
PAX5
肿瘤抑制基因：如 p53、p63、Rb、WT1 基因错配产物：如 MLH1、MSH2
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细胞核酶：如 TdT 类固醇激素受体：如 ER、PR、AR
黑色素小体和前黑色素小体：如 HMB45、Melan-A
细胞毒颗粒：如TIA-1、granzyme B 线粒体: 如抗线粒体抗体, HEP-PAR1 神经内分泌颗粒：各种激素（如PTH、 ACTH、insulin）、
CgA、Syn W-P 小体: F-VIII相关抗原 分泌颗粒：如BRST-2、surfactant、PSA 细胞内微生物：如弓形虫
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免疫组 织化学
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识别系统
联结系统
显示系统
识别系统是指特异性抗体识别组织或细 胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是
本技术的基本依据。
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联结系统由联结抗体构成。它的作用 是联接识别系统和显示系统。
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再在膜上结合反应显色。
此法常用于病毒性感染的早期诊断。如甲型肝炎病 毒（HAV）抗体的检测
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• 间接法一般仅适用于检测总抗体或IgG 抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM抗体，因标本中一般同时存在较高 浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相 抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固 相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间 接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋 白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。
• 同时双抗原夹心法能检测总的抗体量，即
IgM,IgG,IgA等的量；既可检测人血清抗体， 亦可检测动物血清抗体，对人兽患病的检测更 有价值，实现了同一种试剂测不同种属抗体。 • 但需要注意HOOK效应。
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• HOOK效应 此现象在标本受检抗原/抗体的含量很高
时出现。具体原因是：抗原/抗体在和标 记抗体/抗原结合的同时，过量的抗原/ 抗体也和包被抗体/抗原结合，从而将一 部分的结合位点占住，导致前段形成的 复合物一部分不能结合到包被膜上，出 现了显色变浅的情况。
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抗体
• 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋 白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即 IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫 测定有关的Ig主要为IgG和IgM。
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IGg
IGM
IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000
• 还有一种多抗，在免疫动物时当成免疫 抗原来使用，即鼠IGg，羊IGg等通过取 动物血，再经纯化得到的材料，此类生 物材料和二抗配套使用。
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• 单抗的优点是特异性好，但灵敏度可能 较差，而多抗的优点是灵敏度度好，结 合能力强，但特异性较差。