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鼻咽癌转移相关基因fascin-1的功能及机制研究的
开题报告
一、研究背景
鼻咽癌是一种源于鼻咽上皮的恶性肿瘤，由于发病部位特殊，易造成局部浸润及淋巴结转移，导致患者预后不佳。
目前，鼻咽癌的诊断和治疗方法已经得到了显著改进，但其复发和转移仍是临床上需要重点关注的问题。
因此，研究鼻咽癌的转移机制及相关基因，对于提高鼻咽癌的治疗效果具有重要意义。
二、研究目的
本研究旨在探讨鼻咽癌转移相关基因fascin-1的功能及机制，为深入了解鼻咽癌的发病机制提供有价值的参考。
三、研究内容
1. 对鼻咽癌临床样本进行fascin-1的表达检测，探究其表达与鼻咽癌转移的关系。
2. 构建fascin-1的上调和沉默表达模型，利用细胞增殖、迁移、浸润等方法研究fascin-1参与鼻咽癌转移的生物学过程。
3. 筛选fascin-1靶向抑制剂，评估其对鼻咽癌细胞的生长和转移的影响。
4. 利用蛋白组学等方法筛选出fascin-1信号通路中的关键蛋白，在体外和体内验证其对鼻咽癌转移的作用。
四、研究意义
通过探索鼻咽癌转移相关基因fascin-1的功能及机制，可以为找到新的治疗靶点提供依据。
此外，该研究还可以为鼻咽癌的早期预警和精准治疗提供支持。
一、实验目的1. 了解鼻咽癌的病理学特征。
2. 掌握鼻咽癌细胞培养和检测方法。
3. 分析鼻咽癌细胞的生物学特性，为临床诊断和治疗提供依据。
二、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠。
2. 鼻咽癌细胞系：HNE1细胞。
3. 培养基：DMEM培养基。
4. 细胞培养试剂：胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶。
5. 实验仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪等。
三、实验方法1. 鼻咽癌细胞培养（1）将HNE1细胞复苏后，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
（2）待细胞生长至80%左右，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，接种于新的培养瓶中。
（3）重复上述步骤，直至获得足够数量的细胞。
2. 细胞形态观察（1）将细胞接种于盖玻片上，置于培养箱中培养。
（2）待细胞生长至一定时期，用倒置显微镜观察细胞形态。
3. 细胞增殖实验（1）将细胞接种于96孔板中，每孔加入100μl细胞悬液。
（2）置于培养箱中培养，每隔24小时更换新鲜培养基。
（3）用酶标仪检测细胞吸光度（OD值），计算细胞增殖情况。
4. 细胞凋亡检测（1）将细胞接种于6孔板中，加入药物处理或未处理细胞。
（2）收集细胞，加入Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞术检测细胞凋亡率。
5. 细胞迁移实验（1）将细胞接种于Transwell小室上室，下室加入含有细胞因子的培养基。
（2）置于培养箱中培养，收集迁移至下室的细胞。
（3）用细胞计数试剂盒检测细胞数量。
四、实验结果1. 鼻咽癌细胞形态：细胞呈多边形，大小不一，核质比高，可见核仁。
2. 细胞增殖：细胞呈指数增长，OD值随时间逐渐升高。
3. 细胞凋亡：药物处理组细胞凋亡率显著高于未处理组。
4. 细胞迁移：细胞迁移数量显著增加。
五、讨论本实验成功培养了鼻咽癌细胞，并对其形态、增殖、凋亡和迁移等生物学特性进行了观察。
结果表明，鼻咽癌细胞具有明显的恶性特征，如核质比高、细胞增殖能力强、凋亡率低、迁移能力强等。
鼻咽癌的生物标志物和新型诊断方法鼻咽癌是一种发生在鼻咽部的恶性肿瘤，其早期症状难以察觉，因此往往在晚期才被发现。
随着医学科技的不断进步，人们对于鼻咽癌的生物标志物和新型诊断方法的研究取得了显著的进展。
本文将讨论与鼻咽癌相关的生物标志物以及采用这些标志物进行诊断的新型方法。
一、非编码RNA与鼻咽癌非编码RNA（non-coding RNA，简称ncRNA）是一类在基因转录过程中产生的RNA，与传统的编码蛋白质的信使RNA（mRNA）功能不同，ncRNA在调控基因表达、细胞发育和疾病进程方面起到重要的作用。
近年来，研究人员发现某些ncRNA在鼻咽癌中表达异常，且具有潜在的生物标志物的特征。
1. 微小RNA（microRNA）微小RNA是一类长度为约22核苷酸的ncRNA，在基因调控中起到重要的作用。
研究发现，某些微小RNA在鼻咽癌中的表达水平与疾病的进展和预后密切相关。
例如，miR-21的高表达与鼻咽癌的发生和恶性程度相关。
通过检测患者血液或组织中特定微小RNA的表达水平，可以辅助鼻咽癌的早期诊断和预测疾病的进展。
2. 长链非编码RNA（long non-coding RNA）长链非编码RNA是一类长度超过200核苷酸的ncRNA，在基因调控中具有重要作用。
研究发现，某些长链非编码RNA在鼻咽癌的发生和发展中起到关键的调控作用。
通过检测这些长链非编码RNA在患者组织中的表达水平，可以为鼻咽癌的诊断和治疗提供参考依据。
二、靶向荧光探针和光谱成像技术的应用在鼻咽癌的早期诊断中，传统的组织活检和影像学检查存在一定的局限性。
因此，研究人员致力于开发新型的诊断方法，靶向荧光探针和光谱成像技术应运而生。
1. 靶向荧光探针靶向荧光探针是一种能够识别和结合特定生物标志物的荧光探针。
研究人员可以通过将这种荧光探针注入患者体内，利用显微镜或其他荧光成像设备观察和记录鼻咽癌相关标志物的荧光信号。
靶向荧光探针具有高度的特异性和灵敏性，可以在早期发现鼻咽癌病变，有助于提高诊断的准确性和敏感性。
鼻咽癌的基因组学研究与应用近年来，鼻咽癌的基因组学研究在癌症治疗领域取得了重要突破。
基因组学是研究基因组的结构、功能和相互作用的科学，通过对鼻咽癌基因组的研究，我们可以深入了解该疾病的发病机制、诊断标志物和潜在治疗靶点。
本文将重点介绍鼻咽癌基因组学研究的进展及其在临床应用中的意义。
一、鼻咽癌基因组学的研究进展1. 基因突变鼻咽癌的基因突变是该疾病发生和发展的重要驱动力之一。
通过高通量测序技术，研究人员发现了多个与鼻咽癌发生相关的突变基因，如p53、EGFR、PTEN等。
这些基因的突变会导致细胞增殖、凋亡、侵袭和转移能力的改变，进而促进鼻咽癌的发展。
2. 基因组拷贝数变异基因组拷贝数变异是指染色体上基因拷贝数量的改变。
近年来的研究表明，鼻咽癌中存在着大量的基因组拷贝数变异。
这些变异不仅可以用于鼻咽癌的早期诊断和预测患者预后，还可以作为潜在的治疗靶点。
通过对这些变异的研究，研究人员可以筛选出与鼻咽癌发生和发展密切相关的关键基因。
3. 免疫相关基因免疫相关基因在鼻咽癌的发生和发展过程中起着重要作用。
研究发现，鼻咽癌患者的免疫系统功能异常，特别是抗肿瘤免疫应答的功能下降。
通过对免疫相关基因的研究，我们可以更好地理解免疫耐受机制的破坏和免疫治疗的潜力。
这对于开发新的免疫治疗策略和提高患者预后有着重要的意义。
二、鼻咽癌基因组学在临床应用中的意义1. 早期诊断和预测患者预后鼻咽癌的早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。
基因组学的研究可为鼻咽癌的早期诊断提供潜在的生物标志物。
通过检测特定基因的突变或拷贝数变异，我们可以提高对鼻咽癌的检测敏感性和特异性，从而实现早期诊断和预测患者预后的目标。
2. 个体化治疗个体化治疗是根据患者的基因组信息来选择最佳的治疗方案。
鼻咽癌的基因组学研究为个体化治疗提供了重要的依据。
通过分析鼻咽癌患者的基因组，我们可以了解其肿瘤的分子特征，从而为患者选择适当的靶向治疗或免疫治疗方案。
这种个体化治疗策略可以提高药物治疗的有效性，减少副作用，并且为患者提供更好的临床效果。
与鼻咽癌转移相关的生物因子------兰州大学第一医院生物肿瘤中心鼻咽癌（NPC），鼻咽部的恶性肿瘤，是高度相关的爱泼斯坦- 巴尔病毒（EBV）感染。
在东南亚具有比北美30倍的发生率。
那么，与鼻咽癌转移相关的生物因子有哪些呢？现本文就此具体分析如下。
其预后取决于诊断时病期。
而单纯放疗是有效的早期癌症，晚期疾病的结果仍然不理想，通常与化疗（带或不带照射）后的并发症有关。
不幸的是，患者约70％有转移的诊断，最常见的部位是局部浸润至颈部淋巴结或遥远到肺，骨，肝等新型细胞为基础的免疫疗法是目前正在开发以改善结果。
癌症转移涉及到肿瘤细胞两者的内在本质和肿瘤微环境提供外在因素导致的事件的极其复杂的级联。
迄今为止，很少有人知道癌细胞从原发肿瘤是如何分离，经淋巴或血循环，随后回家首选器官传播。
然而，肿瘤细胞扩散的非随机的，通常是器官选择性和这种调节多步骤的过程对癌细胞运动似乎类似地操作，对白细胞运输至炎症部位，这在很大程度上是协调的趋化因子/趋化因子受体对。
一个显着的例子是，乳腺癌细胞表达CXCR4。
当配体结合（SDF -1α也称为CXCL12）的信号转导通路介导的伪足形成和随后的趋化性和侵袭反应。
中和SDF-1α/CXCR4之间的相互作用削弱了乳腺癌细胞转移至局部淋巴结和肺的能力。
的确，CXCR4是迄今为止表达在大多数癌症和SDF-1α/CXCR4对已经证实与许多肿瘤，包括人大etastatic容量的最常见的趋化因子受体。
最近的证据也表明，对于炎症的诱导关键的额外分子途径也可增强肿瘤转移。
Toll样受体（TLRs）属于一个家庭细胞传感器识别来自国外的微生物衍生的分子。
他们最初在免疫细胞中发现，并为宿主先天的感应关键和适应性免疫。
最近的TLRs被发现在肿瘤细胞和ligandactivation可诱导肿瘤细胞的迁移。
甲肿瘤衍生的巨噬细胞活化剂，多功能蛋白聚糖，细胞外基质的成分，也可以激活TLR2和TLR6的肿瘤浸润性巨噬细胞（未肿瘤细胞本身），以产生炎性细胞因子可增强肺癌细胞的转移。
重磅！湖南科学家在鼻咽癌治疗方面获原创性发现，引起国际关注！近日，中南大学肿瘤研究所熊炜、曾朝阳教授作为共同通讯作者在国际肿瘤学期刊Molecular Cancer 在线发表了题为“Circular RNA circRNF13 inhibits proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma via SUMO2”的原创研究论文。
博士生莫勇真、博士后王裕民为共同第一作者。
鼻咽癌在世界上大部分地区发病率都低，但在东南亚及我国南方地区高发。
湖南是鼻咽癌的高发区之一。
鼻咽癌的发病与遗传背景、EB病毒感染及环境致癌物等密切相关，早期症状不明显，且极易发生侵袭转移；大量基因参与了鼻咽癌的发生发展，但其具体发病机制还远未被阐明。
筛选鉴定与鼻咽癌发病密切相关的基因，明晰它们的作用机制，对于鼻咽癌的防治具有重要价值。
环状RNA是一类新的非编码RNA（即不像经典的信使RNA用于指导蛋白质的编码和合成），因其特殊的环状结构比常规的RNA更稳定。
随着新一代测序技术的发展，越来越多的环状RNA被鉴定，且大量环状RNA与人类常见疾病密切相关，因此环状RNA已成为近年来生物医学研究的前沿和热点。
目前已发现的环状RNA已超过3万个，但绝大部分环状RNA的功能还不清楚，在鼻咽癌中有研究的就更少。
熊炜、曾朝阳教授团队通过高通量测序及生物信息学数据挖掘等策略，鉴定出了一批在鼻咽癌中表达明显改变的环状RNA并进行了深入的研究，获得了一系列原创性的发现。
发表在Molecular Cancer杂志的这篇论文中，他们发现环状RNA circRNF13在正常鼻咽上皮中表达水平较高，且可以结合并稳定SUMO2 mRNA，通过SUMO化和泛素化促进葡萄糖转运蛋白GLUT1的降解，抑制鼻咽上皮癌变；而在鼻咽癌中circRNF13的表达受到抑制，GLUT1表达上调，为肿瘤细胞大量摄取葡萄糖提供了条件，促进了鼻咽癌的增殖、侵袭和迁移。
人鼻咽上皮相对特异基因YH1真核表达质粒的构建和鉴定
的开题报告
一、研究背景和意义
人鼻咽上皮是一种具有特殊生物学功能的组织，具有温度调节、防御呼吸道感染、分泌黏液等功能。
近年来，研究发现人鼻咽癌的发生与某些特异基因的表达异常有关，因此，探讨人鼻咽上皮的特异基因表达特征和调控机制，对于防治人鼻咽癌具有重要
的理论和实际意义。
基因表达质粒是生物学研究的常用工具，通过构建特定的基因表达质粒，可以实现对特定基因的表达和调控。
因此，构建人鼻咽上皮相对特异基因YH1的真核表达质粒，可以为进一步研究该基因的功能和调控机制提供重要的实验工具。
二、研究内容和方法
本研究的主要内容是构建人鼻咽上皮相对特异基因YH1的真核表达质粒，其具
体方法如下：
1、从人鼻咽上皮组织中提取RNA，并通过反转录PCR合成YH1基因的cDNA；
2、设计引物，扩增YH1基因片段，并进行酶切后连接至真核表达质粒；
3、将构建好的真核表达质粒注射至哺乳动物细胞中，进行转染和蛋白表达鉴定。
三、研究进展和展望
目前，本研究已经完成了基因表达质粒的构建和测序鉴定，初步证实了该质粒可以在哺乳动物细胞中表达目标基因YH1。
未来，还需要进一步对该基因的表达特征和
调控机制进行深入研究，以期为人鼻咽癌的防治提供更有力的理论基础和治疗手段。
４６４生物化学与生物物理进展Ｐｍ昏Ｂｉｏｃｌｌ哪．Ｂｊｏｐｈｙｓ．２００４；３ｌ（５）鼻咽癌相关基因ＮＡＰｌ的克隆及鉴定＋李峰蒋卫红杨旭字尹志华冯湘玲刘卫东王磊周文姚开泰”（中南大学湘雅医学院肿瘤研究所，长沙４ｉ００７８摘要从ｕｎ，ｃｃｎｅ库中选取编号为Ｂ（；２３１１９７，来自人鼻咽组织的ＥｓＴ序列．利用Ｂ１ａｓ【检索ｃｅｎＢ蛐ｋ的ｎｒ数据库和ＥｓＴ数据库，构建ＥｓＴ重叠群利用人类基因组草图搜索法从成人正常鼻叫组织中ＰｃＲ扩增获得该基因全长ｃＤＮＡ，命名为ＮＡＰｌ．ＧｅｎＢａｎｋ臀录号为ＡＹｌ９０３２６ＮＡＰｌ基因ｃＤＮＡ序列全长为５７３ｂｐ，编码由８５个氨基酸组成，相对分了质量为９７００的多肽．用ａ一”Ｐ・ｄｃＴＰ标记ＮＡＰｌ基因片段，与含１５种正常成人组织的多组织ＲＮＡ印迹膜杂交，结果表明ＮＡＰｌ基因在淋巴结和气管中高表达，转录本大小约为０．６ｋｂ，在其他组织中小表达ＮＡＩ’ｌ蛋白质与滤泡树突状细胞（川ｌｉｃｕｌａｒｄｅｎｄ—ｔ・ｃｃｅｌｌ，ＦＤｃ）的一种分泌肽前体（ＦＤｃ—ｓＰ）（ＡＦ４３５０８０）同源．与其他已知蛋白质无明显同源性．ＮＡＰｌ基因定位在染色体４ｑ１３，基因组跨越９１７９ｂｐ，含５个外显子和４个内含子．采用差异ＲＴ—ＰｃＲ检测ｒ４０例经病理诊断为低分化鳞状Ｌ皮癌的鼻咽活检组织及其对侧相应部位的正伟鼻咽组织中该蕞周的表达差异在４（）例鼻咽癌中，ＮＡＰｌ基因表达下调的有１７例（４２５％），表达上调的有６例（１５％），无明显表达筹异的有１７倒（４２５％）原位杂交和免疫组化结果显示该基因在正常鼻咽和鼻ｕ困癌组织间质巾的树突状细胞中表达，在其他问质细胞和鼻咽上皮中均不表达以上结果表明，、ＡＰｌ为树突状细胞的一种新的多肽，该基因在鼻咽癌组织巾表达下调的原因，及其与鼻咽癌发生、发展的关系值得进一步探讨关键词鼻咽痹，ＮＡＰｌ基因，基因克隆，鉴定学科分类号。
７８６鼻咽癌（ｎａｓｏｐｈ８ｒｙｎ舭ａｌｃａⅣｊｎｏｍａ，ＮＰｃ）足我国南与‘及东南亚地区常见的肿瘤之一流行病学调查显示，鼻咽癌的发生涉及到遗传倾向性和环境致癌因素，很可能是遗传易感性个体．接受ｒ致癌物的作用而发生的．１９８２年，根据湖南省鼻咽癌死亡率的年龄分布，姚开泰教授提出鼻咽癌发病的三击多步假说”。
，认为ＥＢ病毒（ＥＢＶ）、化学致癌物和胚性击中（即遗传因素或自发突变）构成ＮＰｃ的主要病因，而发病阶段至少在二个以上．但迄今为止，鼻咽癌的具体发病机制仍不十分清楚．因此，鼻咽癌相关基因的克隆及其功能研究有着重要意义．最近，我们从Ｌｎｉｇｅｎｅ库中选取一条编号为Ｂｃ２３１１９７来自人鼻咽组织的ＥｓＴ序列．研究发现该ＥｓＴ序列是－个代表新基因的未知序列我们利用人类基因组草图搜索法”从成人正常鼻咽组织中ＰｃＲ扩增获得该基因全长ｃＤＮＡ，并对该基因进行了牛物信息学分析．采用差异ＲＴ—ＰｃＲ检测了该基囚在经病理诊断为低分化鳞状上皮癌的鼻咽活柃组织和列应的鼻咽癌变对侧正常鼻咽组织巾的表达差芹，并对该基因的表达特征进行了研究．１材料与方法１．１材料５０×Ａｄｖａｎｔ８９ｅ２ＤＮＡ聚合酶混合物购自ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司．ＰｃＲ扩增引物的合成和ＰｃＲ产物测序由上海博亚生物技术有限公司完成．电泳试剂、ＬＢ培养基、ｐｕｃｍ．Ｔ载体均购白上海生工生物技术服务有限公司．随机引物标记盒、ＤＮＡ纯化试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＴＲＩｚｏｌ。
”试剂盒（ＧＩＢｃ０Ｌ／ＢＲＬ公司）、ｄＮＴＰ为Ｐｍｍｅｇａ公刮产品．ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍ８９ａ公司）．鼠抗人ｓｌｏｏ、鼠抗人ｃＤ２０、鼠抗人ＣＤ６８、鼠抗人ｃＤ５７、鼠抗人ｃＤ３单克隆抗体为ｚｖｍｅｄ公司产品．Ｍｕｌ【ｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒ【ｈｅｍ（ＭＴＮｍ）Ｂ１０ｔｓ（Ｃａｔ．７７６０一１，Ｃａｔ．７７６７—１）．Ｄ咄１）ＮＡｂｂｅ儿ｉ“ｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ为ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｒｎｂＨ公司产品．’国家重点基础研究发展规＃４项日（９７３）（ｃ１９９８０５１２００”通讯联系人ｎｌ：０７３ｌ－４３６００９４．Ｅ－ｎｌａＩｌ：ｋｔｖａｏ＠‰叫ｌ¨删收稿口期：２００３一ｌｌ＿２４，接受日期：２００４旬ｌ一１８生物化学与生物物理进展Ｐｒ馏，Ｂｉｏｃｈ咖．Ｂｊｏｐｂ胯，４０例来自湘雅医院耳鼻喉科门诊，经病理诊断为低分化鳞状上皮癌的鼻咽活检组织及其财侧相应部位的正常鼻咽组蛰ｌ，组织石蜡块来自湘雅医院病理科．１．２方法Ｉ．２．１ＧｅｎＢａｎｋ数据库检索和ＥｓＴ序列拼接：将ＥｓＴ序列ＨＧ２３ｌＪ９７（种子序列）采用Ｂｌａｓｔ软件进行ＧｅｎＢａｎｋ的ｎｒ数据库和ＥｓＴ数据库检索．构建ＥｓＴ重叠群。
．１．２．２人类基网组草图搜索法扶得该基因全长ｃＤＮＡ：将该ＥｓＴ重叠群定位在人类基因组框架草图ｈ找到对应的大规模测序片段，在该ＥｓＴ重叠群５’端ｆ：游对应的大规模测序片段中，寻找与阅读框架起始密码＿Ｆ处ｒ同一阅读框架的终止密码子，在终止密码子附近及其上游设计２条引物ｐＦＲｗ—ｆ（外弓Ｉ物，５’ＧＡＴＩＴ丁ＴｃＧＴＡ７ｆ’１１ＢＧＴＡＧＴ一１’ｌ℃３’）和ｐＦＲｗ２（内弓Ｉ物，５７ｃＴｃｃＡＴｒｃ—ｃＡｌｖｒＡＴＡｃｃ，几Ｔ（：Ａｃ３ｍ在阅读框架起始密码子下游设计２条引物ｐＲＶｓ之（内引物，５’ＧＡＧＡｃＡ—ｃｒ１１ＧＧＧＡＡＡｃＣＡＡｃＡＧ３’）和ｐＲＶｓ一１（外弓『物，５’ＧＧＡＡ‘ｒｒｃＧＴＧＧＡＡｃＴ（：ＧＧｃＧＡ３７）．然后用上述引物，以ＪＥ常鼻咽组织ｃＤＮＡ为模板，进行ＰｃＲ扩增．１．２．３ＲＮＡ印迹确定基因的转录水大小：以正常鼻咽ｃＤＮＡ为模板，以基因特异性引物进行ＰｃＲ扩增．ＰｃＲ纯化试剂盒回收ＰｃＲ产物，以“。
”Ｐ．ｄｃＴＰ为标记物，用随机引物标记试剂盒标记该片段，探针的比放射活性是每微克ＤＮＡ的放射性活性大于ｌ×１０“．ｓ。
ｐｈａｄｅｘｃ一５０柱纯化探针．采用ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮｒⅥ）ＢｌｏＬｓ，Ｅ１ｐ舱ｓｓＨｙｂ…杂交液，６８℃预杂交３０ｍｉｎ，６８屯杂交２ｈ．２×ｓｓｃ、Ｏ．】％ｓＩ）ｓ，３７℃，１５ｍｉｎ洗膜３次；Ｏ，１×ｓｓｃ、０１％ｓＤｓ，５０℃，２０ｎｌｉｎ洗膜２次．一７０℃放射自显影２—４天，ｘ光片显影，定影．１．２．４ＮＡＰｌ基因的染色体定位和基因组结构分析：将ＮＡＰｌ基因ｃＤＮＡ序列与人类基因组草图进行相似性比较，进行基因的染色体定位和确定ｃＤＮＡ序列的内含子和外显子结构．１．２．ｓ差异ＲＴ—ＰｃＲ检测ＮＡＰｌ基因在鼻瞩活检组织及其对侧相应部位的正常鼻咽组织中的表达差异：Ｉ）ＮａｓｅＩ处理总ＲＮＡ，３７０ｃ，反应ｌｈ用ＤＥＰｃ水将上述反应物稀释至２００“ｌ，用等龟Ｔｉｚｏｌ抽提去除蛋白质，最新用ＤＥＰｃ水溶解ＲＮＡ，以ＧＡＰＤＨ引物进行ＰｃＲ扩增检测有无ｇＤＮＡ残留．采用两步法Ｒ’ｒ—Ｉ’ｃＲ．ＰＣＲ产物于１．０％琼脂糖凝胶电泳．１．２．６灰度扫描与数据处理：以ＧＡＰＤＨ为内对照，ＲＴ—ＰｃＲ产物条带用图像分析仪（Ｐｈａｍａｃｉａ公司产品）进行灰度扫描，ＩｍａｇｅｍａｓｔｅｒＶＤｓ图像分析软件测定产物条带的扫描积分吸光度值（肘）．Ⅳ（¨）为』下常鼻咽组织中日的片段Ｍ／（ｊＡＰＤＨ的Ｍ，ｒ（Ｍ）为鼻咽癌组织巾目的片段似／ｃＡＰＩ）Ｈ的似；Ⅳ（Ｈ）／ｒ（肼）大于２，表明ＮＡＰｌ基囚在鼻咽活检组织中表达下凋；，ｖ（ｍ）／７’（，Ａ）小于０５表明ＮＡＰｌ基因在鼻叫活检组织中表达上调．１．２．７原位杂交：采用ＰｃＲＤＩＧＰｍｂｅｓｖｌｌⅡ１ｅｓｉｓ方法标汜基因特异性ｃＤＮＡ探针．经顶杂交，杂交，杂交后处理，然后进行免疫检测，核固红复染、二甲苯透明、中性树胶封片，照相．１．２．８免疫组化：各种组织同定、包埋、切片后，脱蜡、抗原修复．免疫组化检测采用ＡｎｔｊｂｏｄｙＤｉ８９ｎｏｓｔｉｃａｌｎｃ，的“二步法”系统二甲苯透明，中性树胶封片．显微镜下观察，２结果２．１ＧｅｎＢ∞ｋ数据库检索和ＥｓＴ序列拼接以ＢＧ２３１１９７序列为种子序列，采用Ｂｌａｓｔ软件进行ＧｅｎＢａｎｋ的ｎｒ数据库和ＥｓＴ数据库检索．我”Ｊ得至０ｃＢｌ４００８２、Ａ１３３２５６０、Ｂｃ０５９０９３和Ａ１７０１５８９共４个具有高度相似件的Ｆｓｌｌ，并将其组装为５０２ｂｐ的ＥｓＴ重叠群，经与人类基因组草图进行序列校正，获得了全长为５０２ｂｐ的ｃＤＮＡ序列２．２全长ｃＤＮＡ序列的获得和阅读框架的确定利用ＮｃＢＩ的０ＲＦ６ｎｄｅｒ服务器，分析发现该序列具有完整的阅读框架．但在ｃＤＮＡ序列的５７端未见与阅读框架起始密码子处于同一蒯滇框架的终止密码子．根据ＥｓＴ序列拼接的ＥｓＴ再霍群，采用人类基因组草图搜索法获得的理论扩增产物应为（ｊ）１７６ｂｐ（ｐＦＲｗ＿２和ｐＲｖＳ＿２）、（２）２８２ｂｐ（ｐＦＲｗ＿２和ｐＲＶｓ—１）、（了）２９６ｂｐ（ｐＦＲｗ，１和ｐＲＶｓ，２）和（４）４０２ｂｐ（ｐＦＲｗ一１和ｐＲＶｓ一１）．实验结果显示，未扩增出（３）和（４）的目的条带，（Ｊ）和（２）的扩增条带大小与理论扩增产物大小基本一致（图１）．从而获得了基因的全长ｃＤＮＡ序列．在ｃＤＮＡ阅读框架的起始密码子和终止密码子段的两侧设计引物，进行ＰｃＲ扩增，将生物化学与生物物理进展Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００４；３１（５）ＰＣＲ产物（２９４ｂｐ）克降到ｐＵＣｍ—Ｔ载体，转化ＪＭｌ０９，进行ＰＣＲ扩增鉴定（图２），测序结果与利用ＮＣＢＩ的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ服务器分析结果一致Ｆｉｇ．１Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ５’ｅｎｄ’ｓＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔＮＡＰＩｂｙｕｓｉｎｇｄｒａｆｔｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｓｅａｒｃｈｉｎｇｌ：ｐＦＲＷ－２ａｎｄｐＨＶＳ－２（１７６ｂｐ）；２：ｐＦＲＷ－２ａｎｄｐＲＶＳ一（２８２ｂｐ）；３：∥ＲＷ一１ａｎｄｐＲＶＳ－２（ｎＯ）：４：ｐＦＲｒｘⅧＩｐＲＶＳ－１（ｎｏ）Ｍ：ＰＣＲｎｌａｌ＇ｋｅｒＦｉｇ．２ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｏｎｅｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｐＦＲＷ－３ａｎｄｐＲＶＳ－３（２９４ｂｐ），一９：Ｃ１０ｎｅｎｕｎｌｂｅｒＭ：ＰｃＲｍａｒｋｅｒ２．３确定转录本大小用ｄ３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记ＮＡＰｌ基因片段，与含１５种正常成人组织的多组织ＲＮＡ印迹膜杂交．结果表明该基因在淋巴结和气管中高表达，转录本大小约为０．６ｋｂ，与人类基因组草图搜索法获得的基因仝长ｅＤＮＡ大小一致．在大脑、心脏、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾、胰腺、胃、甲状腺、脊髓、肾Ｉ．腺和骨髓中未检测到表达（图３）．ｎ导３ＮｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮＡＰｌｉｎ１５ｋｉｎｄｓｏｆｔｉｓｓｕｅｓｏｆｈｕｍａｎ，：ｈｅａｄ；２：ｂｒｍｎ；３：ｐｌａｃｅｎｔａ；４：ｌｕｎｇ；５：ｌｉｖｅｒ；６：ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ：７：ｋｉｄｎｅｙ；８：ｐ衄ｃｌｅａｓ；９：ｓｔｏｍａｃｈ；Ｊ０：ｔｈｙｒｏｉｄ；Ｊ，：ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ：１２：ｌｙｍｐｈｎｏｄｅ；１３：ｔｒａｃｈｅａ；１４：ａｄｒｅｎ缸ｇｌａｎｄ；１５：ｂｏ…ｍ…２．４ＤＮＡ序列和基因组结构分析ＮＡＰＩ基因（ＧｅｎＢｍａｋ登录号为ＡＹｌ９０３２６）ｃＤＮＡ序列全长为５７３ｂｐ，可渎框架位于第１１３—３７０位之间，编码由８５个氨基酸组成，相对分子质量为９７００的蛋白质（图４）．ＮＡＰｌ基因定位在染色体４ｑ１３，基因组跨越９１７９ｂｐ，含５个外显子和４个内含子．内含子和外显子交界区符合ａｇ．射规则（表１）ｃｔｅｃａｔｔｃｃａＬｂａＬａｃｅ¨ｔｇａｇＬａｔａｔａａａａｃａｇｃＬ㈣ａｔａｔｔｃｃａｇｇｇｃｃａｇ［ｃａｃＬ｛ｇｃｃａｔｔｔｃｔｃａｔａａｃａｇｃｇＬｃａｇａｇａｇａａａｇａａｃｔｇａｃｔｇａａａｃｇＬＬＬｇａｇａｔｇａａｇａａａＭＫＫｇｔｔｃｔｃｅｔｃｃｔｇａｔｃａｃａｇｃｃａＬｃｔｔｇｇｃａｇｔｇｇｅｔｇｔｌｇｇｔＬＬｃｃｃａｇｔｃｔｃｔｅａａｇａｅＶＬＬＬＩ７ＩＡＴＡＶ＾ｖ０ＦＰＶＳ０ＤｃａＲｇａａｃｇｇｇａａａａａａｇａａｇｔａＬｃａｇＬｇ㈣ｇｃｇａｔｇａａｔｔａｇｃｔｔｃａｇｇｇＬｔｔｔｔｔｇｔｇｑＥＲＥＫＲＳｌＳＤＳＤＥＬＡＳＧＦＦＶｔｔｃｃｃＬｔａｃｃｃａｔａｔｃｃａｔｔｔｅｇｅｃｃａｃｔＬＣＣＯＣＧＨ｛ＩｔｔｃｃａｔｔｔｅｅａａｇａｔｔＬｃｃａＬｇｇＦＰＹＰＹＰＦＲＰＬＰＰＴＰＦＰＲＦＰＷｎｔａｇａｃｇｔａａＣｔ￡ｔｃｃｔａｔｔｃｃａａｔａｃｃｔｇａａｔｃｔｇｃｃｃｃｔａｃａａｃｔｃｃｃｃｔｔｃｅｔａｇｃＦＲＲＮＦＰＴＰＴＰＥＳＡＰＴＴＰＬＰＳ＊ａａａａＥｔａａａｃａａｇａａｇｇａａａａｇＬｃａｃＳａｔａａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｔｇａａａＬＬｇａａａｔｔｇａｇｃＦ１１｝ｃａｃＬｔｅｅＬＬｇａａｇａａｔｃａａａａｔｔｃｃｔｇｔ‘！§地ａｇａａａａａｃａａａｔｇｔａａｔｔｇａａａｔａｇｃａｃａｃａｇｃａｔｔｃｔｃｔａｇｔｃａａｔａＬｃｔＬｔａｇｔｇａｔｃｔｔｃｔｔｔ！型旦塑ｃＬｔｇａａａｇｃａａａｇａｔｔｔｔｇｇｔｔＬｃＬＬａａＬＬｔｃｃａｃ（ａ）１０¨昏４ｅＤＮＡａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＮＡＰＩＳｔｏｐｃｅｄｏｎｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙａｓｔｅｒｉｓｋ（十）Ｔａｂｌｅ１Ｅｘｏｎ－ｉｎｔｒｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎｏｆＮＡＰｌｇｅｎｅＵｐｐｅｒｃａｓｅａｎｄｌ【ｌ……Ｆｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｃｘｏｎａｎｄｉｎｈ＿０ｎ”ｑｕｅｎｃｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＣｏｎｓｅ］Ｔｅｄｓｐｌｉｃｅｄｏｎｏｒａｎｄａｃｃｒｐｔｍ＂ｄｉｎｕｃｌｅｏｌｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａ忡ｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｎｂｏｌｄ生物化学与生物物理进展Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４６７２．５ＮＡＰｌ基因的染色体定位将ＮＡＰｌ基因序列与人类基因组草图进行相似性比较（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ！ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／），发现该基因与人类４号染色体上的ＮＴ一０３０６４０．５序列高度相似，该序列定位于４ｑ｜３．２．６ＤＮＡ序列及蛋白质序列同源性分析ＥｘＰＡＳｙ服务器和ＮＣＢＩ的Ｂｌａｓｔ软件的分析结果表明，ＮＡＰｌ蛋白质与滤泡树突状细胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＦＩ）Ｃ）的一种分泌肽前体（ＦＤＣ—ＳＰ）（ＡＦ４３５０８０）同源（相似性为７７％）．与其他已知蛋白质无明显同源性．蛋白质的理论ｐ，为９．３０，为一种碱性蛋白质．蛋白质有１个亲水区和１个疏水区生物信息学ＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋｓ分析表明，该蛋白质为分泌型蛋白质，具有３个磷酸化和１个脯氨酸富聚区等功能位点．２．７ＮＡＰｌ基因的差异性表达采用ＮＡＰｌ基因序列特异性引物（ｐＦｌＲＷ－３和ｐＲＶＳ－３），４０例正常鼻咽组织及鼻咽癌组织ＲＴ．ＰＣＲ结果显示，在４０例鼻咽癌中，该基因表达下调的有１７例（４２．５％），表达上调的有６例（１５％），无明显表达差异的有１７例（４２．５％）（表２）．Ｔａｂｋ２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＮＰＣａｎｄＮＰｔｉｓｓｕｅｓｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＲＴ－ＰＣＲｉｎ４０ｃａｓｅｓ州：Ｉｎｔｅｇｒａ／ａｂｓｏｌｌＪｔｉⅢ】ｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ⅳ（／Ａ）＝“（Ⅳ）／儿（ＧＡＰＤＩＩ）；？’（／Ａ）＝／Ａ（ｒ）／／Ａ（ＧＡＰＤＨ）；Ｎ（ｔＡ）／ｒ（１．４）＞２：ｌｏｗｅ。
