食品安全-18创伤弧菌(5页)

创伤弧菌感染一例【摘要】我院今年收治1例创伤弧菌感染病患，65岁，肾内科病人，长期血透，并患有丙肝。

血培养鉴定为创伤弧菌，基因测序 Vibrio Vulnificus 1.954。

入院经头孢替安注射治疗好转出院。

【关键词】创伤弧菌血培养基因测序创伤弧菌 V. vulnificus为细菌域 Bacteria变形菌门Proteobacteria γ-变形菌纲Gammaproteobacteria弧菌目 Vibrionales弧菌科 Vibrionaceae弧菌属 Vibrio二名法Vibrio vulnificus(Reichelt et al. 1979) Farmer 1980 emend. West et al. 1986模式株324 = ATCC 27562 = CAIM 610 = BCRC (formerly CCRC) 12905 = CCUG 13448 = CCUG 16394 = CIP 75.4 = DSM 10143 = IFO (now NBRC) 15645 = JCM 3725 = LMG 13545创伤弧菌（Vibrio Vulnificus）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，自然生存于河口和海洋环境中，能够引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症。

通常人类感染是因为食用生或半生的受污染海产品，或是因为伤口接触了带菌的海水或海洋动物[1]我院今年收治1例创伤弧菌感染病患，65岁，肾内科病人，长期血透，并患有丙肝。

患者白天手指头遭到水潺刺伤，半夜手指头肿大并有淤青水泡红疹到我院就诊，第二三天溃烂蔓延至手腕。

连续高烧，血培养鉴定为创伤弧菌，药敏显示多数药都敏感。

医院制定治疗方案是使用抗生素治疗创伤弧菌，用点滴方式注入。

若短时间内是没有效果，就将其溃烂部份切除。

病人经治疗后好转，出院。

1材料血琼脂平板；BacT/ALERT SN培养瓶；BacT/ALERT FA培养瓶；仪器：BacT/ALERT 微生物监测系统；生物梅里埃ATB 细菌鉴定及药敏分析系统2细菌培养结果菌落形态：37℃培养扁平的、带黄色晕黄的嫩黄色菌落生化反应：AＰI20E生化鉴定试剂条，菌落初步分离后，仅培养24h即可进行鉴定[2]药敏结果：氨苄西林/舒巴坦 S；替卡西林 S；替卡西林/棒酸 S；哌拉西林 S；哌拉西林/他唑巴坦 S；头孢吡肟 S；亚胺培南 S；美洛培南 S;头孢他啶 S;阿米卡星 S；庆大霉素 S；妥布霉素S；环丙沙星S;多粘菌素E R；复方新诺明 S.基因分析: Vibrio Vulnificus 1.954.3 结果讨论创伤弧菌是普遍生存在海洋中的一种菌，感染创伤弧菌的途径有两种。

创伤弧菌知识点总结一、病原特性创伤弧菌是一种革兰氏阴性杆菌，形态呈弧状，具有多种抗原型。

创伤弧菌主要存在于海水和海产品中，尤其是在暖水季节，特别是夏季，创伤弧菌的浓度会显著增加。

创伤弧菌在适宜的温度和盐度条件下可以迅速生长和繁殖，因此海产品和海水成为创伤弧菌感染的主要来源。

此外，创伤弧菌也可以存在于淡水和淡水产品中，因此在温水鱼产品中也存在传播的可能。

二、感染途径创伤弧菌感染的主要途径包括：经口摄入、皮肤伤口接触和呼吸道感染。

其中，经口摄入主要是通过食用生或未煮熟的海产品，特别是贝类和鱼类，而感染率尤高。

皮肤伤口接触是指人体皮肤上面存在创口，当接触被污染的海水或海产品时就容易被创伤弧菌感染。

呼吸道感染则是通过受污染的海水或海产品进入呼吸道引发感染，不过这种途径相对较少见。

三、临床表现创伤弧菌感染的临床表现多种多样，轻者仅表现为皮肤局部红肿、疼痛、水疱或出血点等，重者则可能产生败血症、感染性休克、坏死性皮下炎、蜂窝织炎以及敗血症等严重并发症。

同时，由创伤弧菌引发的创伤感染还可能导致患者出现剧烈的腹泻和呕吐等消化系统症状。

四、诊断方法创伤弧菌的诊断主要依靠实验室检测。

可通过患者病情的临床表现、流行病学史、实验室检测等综合分析来确定创伤弧菌感染的可能性。

实验室检测通常包括对患者体液或组织样本（如血液、伤口渗液等）进行细菌培养和鉴定，通过高度革兰染色、专门的白金卢勒克斯琼脂、VP琼脂培养基等实验室检测方法可以对创伤弧菌进行明确识别。

五、治疗原则对于创伤弧菌感染的治疗，目前主要采用抗生素和手术清创。

一般情况下，应用第三代或四代头孢菌素类抗生素为首选，如头孢他啶、头孢曲松等。

对重症患者可根据药敏试验结果，联合应用大环内酯类或氟喹诺酮类抗生素。

由于创伤弧菌感染的发展较快，建议患者一旦出现感染症状，应及时就医，并在医生的指导下进行治疗。

六、预防措施预防创伤弧菌感染的措施主要包括：①正确处理和烹饪海产品：尽量避免食用生或未煮熟的海产品，特别是贝类和鱼类；②皮肤伤口的保护：在接触海水或海产品时，应保护好自己的皮肤，避免出现皮肤创口；③加强环境卫生管理：加强对生产和销售海产品的环境卫生管理，防止水产养殖场等场所的环境受到污染；④个人卫生：加强个人卫生，保持身体清洁，特别是在接触海产品后，要及时清洗双手。

创伤弧菌检测标准
一、样本采集和处理
1.采集样本时应选择无菌、无污染的部位，如伤口、脓液、血液等。

2.采集的样本应尽快送检，避免在室温下放置过久。

3.样本应妥善保存，避免污染和交叉感染。

二、培养基和培养条件
1.培养基应选择适宜创伤弧菌生长的培养基，如TSA培养基。

2.培养条件应选择适宜创伤弧菌生长的温度和湿度，一般选择30-35℃恒温培养，湿度保持在70%左右。

三、检测方法
1.涂片法：将采集的样本直接涂片或经过处理后涂片，用革兰氏染色法染色，然后在显微镜下观察细菌形态和染色情况。

2.分离培养法：将采集的样本接种到适宜的培养基上，在适宜的温度和湿度下培养，观察细菌的生长情况和菌落形态。

3.生物化学法：利用细菌的生物化学特性，通过测定细菌代谢产物的变化来判断细菌的种类和毒性。

4.免疫学法：利用抗体和抗原的特异性结合原理，通过检测细菌抗原或抗体来判断细菌的存在。

四、检测结果判断
1.如果涂片法或分离培养法阳性，说明样本中存在创伤弧菌。

2.如果生物化学法或免疫学法阳性，说明样本中存在创伤弧菌且
具有毒性。

3.如果以上方法均阳性，则可确定样本中存在创伤弧菌且具有毒性。

五、质量控制
1.实验室应建立严格的质量控制体系，确保检测结果的准确性和可靠性。

2.实验室应定期对检测方法进行验证和评估，确保其有效性。

3.实验室应定期对仪器设备进行校准和维护，确保其正常运行。

4.实验室应建立完善的记录系统，记录检测过程和结果，以便追溯和审查。

食品科技水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展彭钟琴，黄　璐（广东茂名农林科技职业学院，广东茂名 525000）摘　要：创伤弧菌引起的食物中毒多发生在6—10月，易受污染的食品主要是水产品。

水产品的微生物污染与食品安全有着密切的关系，为了较好地控制水产品的质量，确保消费者的饮食安全，水产品必须经过严格的微生物检验，达标后才能流进入市场。

本文简要综述了创伤弧菌的检测方法，为创伤弧菌感染的早期诊断和及时治疗提供参考。

关键词：创伤弧菌；检测方法；PCRResearch Progress on Detection Techniques of Vibrio Vulnificusin Aquatic ProductsPENG Zhongqin, HUANG Lu(Guangdong Maoming Agriculture & Forestry Technical College, Maoming 525000, China) Abstract: Food poisoning caused by Vibrio vulnificus mostly occurs in June to October, and the easily contaminated food is mainly aquatic products.Microbial pollution of aquatic products is closely related to food safety. In order to better control the quality of aquatic products and ensure the food safety of consumers, aquatic products must be strictly microbial tested to meet the standard before they can flow to the market.A brief review of the Vibrio vulnificus detection methods will provide references for the early diagnosis and timely treatment of Vibrio vulnificus infection.Keywords:Vibrio vulnificus; detection technology; polymerase chain reaction淡水和海水的水体中含有多种天然存在的微生物，水产品在捕获和加工过程中也会受到污染而携带致病菌。

食品安全事故常见致病因子的临床表现潜伏期及生物标本采集要求潜伏期主要临床表现致病因子生物标本送样保存条件（24小时内）一、主要或最初症状为上消化道症状（恶心，呕吐）一般为10-20 分钟由腌制不当或变质蔬菜引起的中毒一般为1-3 小时，最长可达20 小口唇、耳廓、舌及指(趾)甲、皮肤黏膜等出现不同程度发绀，可伴有头晕、头痛、乏力、恶心、呕吐；中毒明显者可出现心悸、胸闷、呼吸困难、视物模糊等症状；严重者可出现嗜睡、血压下降、心律失常，甚至休克、昏迷、亚硝酸盐血液必须立即采样，若现场不能检验，可带回实验室测定，采样量约10ml，抗凝剂以肝素为佳，禁用草酸盐，应冷藏保存，如长时间运输，可冷冻呕吐物胃内容物采样量50g-100g，使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶密闭盛放应冷藏保存，保存和运输条件同上潜伏期主要临床表现致病因子生物标本送样保存条件（24小时内）时抽搐、呼吸衰竭尿液采样量300ml-500ml，使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶盛放，保存和运输条件同上1-6 小时（平均2-4 小时）恶心，剧烈地反复呕吐，腹痛，腹泻金黄色葡萄球菌及其肠毒素粪便或肛拭子新鲜粪5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。

或采样拭子沾满粪便插入Cary—Blair运送培养基1，冷藏运送至实验室呕吐物采取呕吐物置无菌采样瓶或采样袋密封送检, 冷藏运送至实验室皮肤病变拭子鼻拭子采样拭子插入Cary—Blair运送培养基1内保存，冷藏运送至实验室潜伏期主要临床表现致病因子生物标本送样保存条件（24小时内）0.5-5小时以恶心、呕吐为主，并有头晕、四肢无力蜡样芽孢杆菌（呕吐型）粪便或肛拭子新鲜粪便5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。

或用采样拭子沾满粪便插入Cary—Blair运送培养基1内保存，冷藏运送至实验室4-24小时恶心、呕吐、轻微腹泻、头晕、全身无力，严重者出现黄疸、肝肿大、皮下出血、血尿、少尿、意识不清、烦躁不安、惊厥、抽搐、休克；一般无发热椰毒假单胞菌酵米面亚种（米酵菌酸）粪便或肛拭子新鲜粪便5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(１):１４７~１５５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０１.０２０收稿日期:２０２３－０４－０７基金项目:国家重点研发计划 食品安全关键技术研发 重点专项(２０１７ＹＦＣ１６０１４００)ꎻ山东省重点研发计划项目(２０２２ＴＺＸＤ００２２)ꎻ泰山学者工程专项经费资助(ｔｓｑｎ２０１９０９１６８)ꎻ山东省自然科学基金青年基金项目(ＺＲ２０２０ＱＣ２２６)ꎻ济南市 新高校２０条 项目(２０２２２８０６２)ꎻ山东省农业科学院国际科技合作专项(ＣＸＧＣ２０２２Ｆ０９)作者简介:袁玮(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为食品微生物检测技术研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:７９４３９３６１７＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:陈相艳(１９７３ )ꎬ女ꎬ研究员ꎬ研究方向为食源性病原微生物检测及标准物质研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:３１５４７８８４５＠ｑｑ.ｃｏｍ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用袁玮１ꎬ２ꎬ陈蕾蕾１ꎬ２ꎬ杨金玉１ꎬ周庆新１ꎬ２ꎬ裘纪莹１ꎬ赵双枝１ꎬ付恩君１ꎬ赵国琰２ꎬ陈相艳１(１.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ２.山东师范大学生命科学学院ꎬ山东济南㊀２５００１４)㊀㊀摘要:针对我国缺乏适用于创伤弧菌检测的质粒标准样品的现状ꎬ本研究开展了创伤弧菌鉴定即用型定性质粒标准样品的研制和应用工作ꎮ首先构建了创伤弧菌毒力基因ｖｖｈＡ的重组质粒ꎬ经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉ꎬ然后对其进行ＰＣＲ定性检测及紫外分光光度计法定量分析ꎮ均匀性检验结果表明ꎬ样品间无显著差异ꎬ均匀性良好ꎬ符合预期目标ꎻ短期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在４ħ㊁３７ħ条件下稳定保存１４天ꎻ长期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ研究结果表明ꎬ创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求ꎬ为创伤弧菌的快速㊁高通量的定性鉴定分析提供了可靠的参考物质ꎮ将标准样品应用于鱼类㊁贝类等１０份海鲜类食品样品的检测中ꎬ经传统培养法验证ꎬ检测结果准确无误ꎮ本研究所研制的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力ꎬ为其在食品检测领域的推广应用奠定了重要基础ꎮ关键词:创伤弧菌ꎻ质粒定性标准样品ꎻ水产品ꎻ检测中图分类号:Ｓ８５２.６１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０１－０１４７－０９ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｅｒｔｉｆｉｅｄＰｌａｓｍｉｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｔｅｒｉａｌｆｏｒＨｅｍｏｌｙｓｉｎＧｅｎｅｖｖｈＡｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓａｎｄＩｔ ｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＡｑｕａｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＹｕａｎＷｅｉ１ꎬ２ꎬＣｈｅｎＬｅｉｌｅｉ１ꎬ２ꎬＹａｎｇＪｉｎｙｕ１ꎬＺｈｏｕＱｉｎｇｘｉｎ１ꎬ２ꎬＱｉｕＪｉｙｉｎｇ１ꎬＺｈａｏＳｈｕａｎｇｚｈｉ１ꎬＦｕＥｎｊｕｎ１ꎬＺｈａｏＧｕｏｙａｎ２ꎬＣｈｅｎＸｉａｎｇｙａｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄ＆ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｏｖｅｌＦｏｏｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＤｕｅｔｏｌａｃｋｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎＣｈｉｎａꎬａｒｅａｄｙ￣ｔｏ￣ｕｓｅｃｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｈｅｒｅｉｎ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｉｒｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｐｏｗｄｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎ￣ｃｉｎｇｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｅｉｎｇｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＵＶｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ.Ｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓａｍｐｌｅｓꎬａｎｄｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｗａｓａｓｅｘｐｅｃｔｅｄ.Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｅ￣ｐａｒｅｄｐｌａｓｍｉｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｂｅｓｔａｂｌｙｐｒｅｓｅｒｖｅｄｆｏｒ１４ｄａｙｓａｔ４ħｏｒ３７ħꎬａｎｄｆｏｒａｔｌｅａｓｔ１２ｍｏｎｔｈｓａｔ－２０ħ.ＴｈｅｏｖｅｒａｌｌｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｎａｔｉｏｎａｌｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏ￣ｖｉｄｅｄｒｅｌｉａｂｌｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ.Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ１０ｓｅａｆｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｓｕｃｈａｓｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈ.ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｏｂｅａｃｃｕｒａｔｅｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ.ＡｂｏｖｅａｌｌꎬｔｈｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｄｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｌａｙｉｎｇａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｏｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓꎻＣｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌꎻＡｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓꎻＤｅｔｅｃｔｉｏｎ㊀㊀创伤弧菌(Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ)是一种革兰氏阴性菌ꎬ主要特性为嗜盐㊁喜温ꎬ自然分布于世界各地沿海和河口水域[１－２]ꎬ是一种人畜共患病原菌ꎬ容易感染鱼㊁虾㊁牡蛎㊁蛤㊁螃蟹等海产品ꎬ人类通过生食或食用未完全煮熟的海产品㊁破损皮肤直接接触被其污染的海水或海产品而患病[３]ꎮ创伤弧菌与霍乱弧菌㊁副溶血弧菌并称为人类三大致病弧菌[４]ꎬ弧菌感染病例具有明显的季节性ꎬ大多数发生在夏季和初秋气温较高的时期[５]ꎮ随着全球气候变暖㊁海洋温度升高等自然条件的变化ꎬ创伤弧菌的感染率也逐年增加ꎮ在全世界范围内创伤弧菌感染的死亡率高达６０％ꎬ在美国约为３３％ꎬ使其成为严重的公共卫生和食品安全问题[６－７]ꎮ创伤弧菌感染的主要症状包括肠胃炎㊁原发创伤性感染㊁败血症和坏死性筋膜炎等ꎬ免疫力低下或患有糖尿病㊁肝脏疾病等慢性基础病的患者属于易感人群[８]ꎮ创伤弧菌伤口感染通常以肿胀㊁红斑和剧烈疼痛为特征ꎬ潜伏期短ꎬ发病迅速ꎬ病变经常演变为可坏死的囊泡或充满液体的大泡ꎬ最终引起多脏器衰竭[９]ꎮ创伤弧菌菌体产生的创伤弧菌外毒素通过特定的毒力机制引发疾病ꎮ创伤弧菌毒力因子主要包括溶细胞素㊁铁载体㊁金属蛋白酶㊁荚膜多糖等[１０]ꎬ由ｖｖｈＡ基因编码的创伤弧菌溶细胞素是唯一分泌到细胞外的外毒素ꎬ具有创伤弧菌种属特异性ꎬ可作为鉴定创伤弧菌的指标[１１]ꎮ当前ꎬ对创伤弧菌进行定量检测主要通过平板计数㊁ＭＰＮ法等传统培养法ꎬ这些方法需要进行过夜培养㊁选择性平板分离㊁生化鉴定㊁血清学检测等繁琐的试验步骤ꎬ不仅耗时费力ꎬ同时样本中杂菌的过量繁殖也会对鉴别结果产生影响ꎮ另外ꎬ由于水产品中的创伤弧菌通常处于 活的且不可培养 的状态[１２－１３]ꎬ传统的培养方法很难对该部分创伤弧菌进行有效鉴定ꎬ严重降低了检测结果的准确度ꎮ作为最危险的食源性细菌之一ꎬ创伤弧菌造成了９５％的海鲜相关死亡ꎬ已成为一个主要的食品安全问题[１４]ꎮ随着食品供应链的全球化ꎬ创伤弧菌的定期监测变得更加重要ꎮ为了满足当下快速㊁高通量检测的需求ꎬ分子生物学方法在食品微生物的检测中得到了越来越广泛的应用ꎬ但相关的参考物质相对匮乏ꎮ食源性微生物检测即用型标准样品的研制ꎬ有助于解决目前国内食品微生物检测中存在的参考物质不足的难题ꎬ使具有自主知识产权的标准样品在相关领域得到更好的推广和应用ꎬ从而摆脱对国外标准样品的依赖ꎮ因此ꎬ建立创伤弧菌鉴定检测即用型质粒定性标准样品用于其快速㊁高通量鉴定ꎬ对提高水产品的质量安全㊁保证人类健康具有重要意义ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料１.１.１㊀菌株来源㊀创伤弧菌(ＣＩＣＣ２１６１５)来源于中国工业微生物保藏中心ꎮ１.１.２㊀主要试剂㊀琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司ꎻＰＮＣＣ增菌液基础培养基㊁ＰＮＣＣ添加剂㊁ｍＣＰＣ琼脂基础培养基㊁多粘菌素Ｅ㊁多粘菌素Ｂ购自北京陆桥技术股份有限公司ꎻ核酸染料ＧｅｌＳｔａｉｎ㊁Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒ㊁Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋ￣ｅｒ㊁质粒大提试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司ꎻ５０ˑＴＡＥ缓冲溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司ꎻ２ˑＴａｑＰＣＲＭｉｘ㊁琼脂糖８４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀凝胶ＤＮＡ回收试剂盒㊁ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司ꎮ１.１.３㊀仪器和设备㊀ＺＨＷＹ－２００Ｈ恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司ꎻＳＷ－ＣＪ－２Ｄ双人净化工作台购自苏州净化设备有限公司ꎻＣ１０００ＴｏｕｃｈＰＣＲ仪㊁ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司ꎻＪＹ６００Ｃ水平电泳仪㊁ＪＹ０４Ｓ－３Ｃ凝胶成像系统购于北京君意东方电泳设备有限公司ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀重组质粒的获取与验证㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎬ获得重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ并保存于大肠埃希氏菌Ｔｏｐ１０菌株中ꎮ依据ＧＢ４７８９.４４ ２０２０«食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验»[１５]中创伤弧菌ＰＣＲ检测的引物序列ꎬ由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(表１)ꎮ以重组质粒为模板ꎬ利用创伤弧菌鉴定引物ꎬ对目的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析ꎬ使用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒对ＰＣＲ产物进行胶回收ꎬ使用ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒将ＰＣＲ纯化产物连接至ｐＬＢ－ｓｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ上ꎬ并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ置于３７ħ培养箱培养１２ｈꎮ从平板上挑取单菌落ꎬ经ＰＣＲ反应鉴定为阳性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定ꎬ测序结果与预期一致的ꎬ即为验证正确的重组质粒ꎮ将携带正确重组质粒的大肠埃希氏菌于－８０ħ超低温冰箱中甘油管保存ꎮ㊀㊀表１㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因的引物序列引物名称引物序列(５ᶄң３ᶄ)片段大小/ｂｐｖｖｈＡ－ＦＣＣＧＣＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＡｖｖｈＡ－ＲＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＧＧＧＣＣ５１９１.２.２㊀重组质粒的提取㊀将携带重组质粒的大肠埃希氏菌甘油管解冻ꎬ接入４ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ放入２００ｒ/ｍｉｎ的振荡摇床中３７ħ培养１２ｈꎬ取２ｍＬ种子液转接于２００ｍＬ的ＬＢ液体培养基中扩大培养ꎬ获取大量携带重组质粒大肠埃希氏菌的培养液ꎬ利用细菌质粒大提试剂盒提取质粒ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析质粒完整性ꎬＰＣＲ验证目的基因ꎬ紫外分光光度计检测质粒的浓度和纯度ꎮ１.２.３㊀重组质粒的含量检测㊀取重组质粒样品１μＬꎬ于ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计中检测浓度ꎬ每管检测两次ꎮ１.２.４㊀重组质粒的分装㊀将大提的质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ每管１００μＬ分装至螺口冻存管中ꎬ贴上标签ꎮ１.２.５㊀重组质粒的冷冻干燥㊀由于质粒样品较为稳定ꎬ分装后可直接冻干ꎮ在－２５ħ㊁真空度为５０Ｐａ条件下冻干２０ｈꎮ１.２.６㊀质粒定性标准样品的均匀性分析㊀按照随机抽号系统抽取的号码ꎬ抽取质粒定性标准样品１２管ꎬ用１００μＬ无菌水溶解质粒冻干粉ꎮ取０.５μＬ溶解的质粒样品作为ＰＣＲ模板ꎬ按照１.２.１方法进行基因定性检测ꎻ取质粒样品２μＬꎬ按照１.２.１方法琼脂糖凝胶电泳分析质粒样品的完整性ꎻ取质粒样品１μＬꎬ采用紫外分光光度计法进行复溶质粒样品的定量试验ꎬ检测样品的浓度ꎬ每管测两次ꎬ核酸含量＝核酸浓度ˑ水化体积ꎬ核酸含量结果统计分析采用方差分析法ꎮ１.２.７㊀质粒定性标准样品的稳定性分析㊀稳定性检验方法同均匀性检验ꎬ核酸含量结果统计分析采用单因素方差分析法ꎮ短期稳定性检验:采取两种短期稳定性试验ꎮ第一种模拟冰袋运输:在４ħ条件下的短期储存稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于４ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎻ第二种模拟高温运输:在３７ħ条件下稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于３７ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天时每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎮ长期稳定性检验:质粒样品经冷冻干燥后ꎬ需要在－２０ħ条件下长期冷冻保存ꎮ为了测定质粒样品长期保存时间及其稳定性ꎬ每次检测时ꎬ从冷冻样品中随机取出３管样品ꎬ每管重复２次ꎮ抽样时间点遵循先密后疏的原则ꎬ分别在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月共７个时间点抽样检测ꎮ１.２.８㊀创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测中的应用㊀食品样本的前处理:将购买的食品样本按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求处理ꎬ在无菌条件９４１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用下ꎬ称取鲫鱼㊁偏口鱼㊁银鲳鱼㊁鲤鱼㊁鲅鱼㊁黄花鱼６种鱼类样品的表面组织㊁肠和腮各２５ｇꎬ花蛤㊁海蛎子和生蚝３种贝类样品内容物各２５ｇꎬ明虾的头足部组织２５ｇꎬ分别放入含２２５ｍＬＰＮＣＣ增菌液的无菌均质袋ꎬ用拍打式无菌均质器拍打２ｍｉｎ制成样品匀液ꎻ将均质袋放入培养箱３７ħ培养１８ｈ获得增菌液ꎬ取距液面１ｃｍ深处菌液１ｍＬ放入离心管中ꎬ９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎻ用１ｍＬＰＢＳ磷酸盐缓冲液悬浮清洗后９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎬ重复２次ꎻ加入１ｍＬ无菌去离子水ꎬ煮沸１０ｍｉｎꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ吸取上清液ꎮＰＣＲ分析:将上清液用作ＰＣＲ反应的ＤＮＡ模板ꎻ随机抽取１管创伤弧菌重组质粒定性标准样品ꎬ加入１００μＬ无菌去离子水溶解ꎬ作为阳性对照ꎻ将大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３基因组ＤＮＡ冻干粉用３００μＬ无菌水溶解(终浓度为２０ｎｇ/μＬ)后作为阴性对照ꎻ无菌去离子水为空白对照ꎬ按照１.２.１的方法进行ＰＣＲ分析ꎮ创伤弧菌的分离验证:取检测为阳性的食品样本的增菌液ꎬ用接种环将其划线接种于ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ验证菌落形态是否符合创伤弧菌菌落形态特征ꎬ即圆形㊁扁平ꎬ光照下透明但中心不透明的黄色或橘黄色菌落ꎬ直径１~２ｍｍꎮ创伤弧菌的生化鉴定:按照ＧＢ４７８９.４４２０２０进行创伤弧菌的培养和生化特性鉴定ꎮ１.３㊀数据统计与分析使用ＳＰＳＳ２６.０软件的ＡＮＯＶＡ法进行单因素方差分析ꎬ统计各处理组之间的差异性ꎬ数据用平均值ʃ标准误 表示ꎬＰ<０.０５表示差异显著ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀创伤弧菌重组质粒的验证以创伤弧菌重组质粒为模板ꎬ对其进行目的基因ＰＣＲ扩增验证ꎬ以大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３为阴性对照ꎬ无菌去离子水为空白对照ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ扩增结果(图１Ａ)显示ꎬ创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ基因为阳性ꎬ条带清晰ꎬ片段大小为５１９ｂｐꎬ符合目的条带大小ꎬ说明成功构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ重组质粒ꎬ质粒图谱如图１Ｂ所示ꎮＭ:Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋｅｒꎻ１:ｖｖｈＡ质粒ꎻ２:阴性对照ꎻ３:空白对照ꎮ图１㊀创伤弧菌重组质粒ＰＣＲ扩增(Ａ)及ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ重组质粒图谱(Ｂ)２.２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度及纯度分析取重组质粒１μＬꎬ利用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００测定其浓度和纯度ꎬ结果如表２所示ꎬＡ２６０/２８０㊁Ａ２６０/２３０均超过１.８ꎬ说明所提取的质粒纯度高ꎬ无蛋白质和有机物污染ꎻ对其携带的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图２Ａ)显示ꎬ目的基因ｖｖｈＡ条带单一且片段大小符合预期ꎬ质粒完整性分析(图２Ｂ)显示质粒条带完整ꎬ说明所制备的质粒符合预期ꎮ㊀㊀表２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度与纯度样品管号浓度/(ｎｇ/μＬ)Ａ２６０/Ａ２８０Ａ２６０/Ａ２３０ＶＡ１１６７.０１.８６２.２１ＶＡ２１８９.５１.８８２.２９ＶＡ３１７３.６１.８８２.２６ＶＡ４８２.１１.８９２.５３０５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀Ｍ:Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒꎻ１~８:ｖｖｈＡ质粒样品ꎮ图２㊀创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ的ＰＣＲ扩增(Ａ)及质粒完整性(Ｂ)分析㊀㊀将４管大提的创伤弧菌重组质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ取１００μＬ分装至２ｍＬ螺口冻存管中ꎬ所有质粒溶液分装４５０管后ꎬ置于真空冷冻干燥机中按照冷冻程序真空冷冻干燥ꎬ获得白色粉末状的冻干质粒样品ꎬ设计创伤弧菌重组质粒定性标准样品标签纸ꎬ打印并贴在管外(图３)ꎮ质粒定性标准样品置于－２０ħ冰箱冻存ꎮ２.３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的均匀性分析从４５０管质粒标准样品中随机抽取１２管进行ＰＣＲ定性试验ꎬ结果如图４Ａ所示ꎬ各管ＰＣＲ扩增目的基因均为阳性ꎬ条带单一且清晰ꎬ图４Ｂ显示质粒完整无降解ꎮ使用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计进行质粒标准样品的浓度㊁纯度分析ꎬ对所测数据进行单因素方差分析ꎬ结果如表３所示ꎬ在９５％的置信概率下ꎬＦ值小于Ｆ临界值ꎬ各管间质粒含量无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品均匀性良好ꎮ图３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~１２:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎮ图４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ)及均匀性(Ｂ)分析㊀㊀表３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品均匀性试验方差分析平方和ＳＳ自由度均方ＭＳＦ值Ｆ临界值置信概率Ｐ值组间０.０２１１１０.０２２.７００２.７２０.９５０.０５１组内０.００８１２０.０１２.４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的稳定性分析温度是运输过程中影响质粒定性标准样品质量的主要因素ꎬ因此设计不同温度模拟质粒样品运输条件ꎬ以质粒标准样品目的基因阳性检出㊁质粒完整性及核酸含量变化确定其短期稳定性(运输稳定性)ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品分别在４ħ和３７ħ条件下保存１４ｄꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图５㊁图６)显示第１天和第１４天目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小ꎬ质粒无降解ꎻ质粒含量统计学分析结果如图７所示ꎬ各时间点间无显著性差异ꎬ表明质粒含量无明显变化ꎬ说明质粒定性标准样品在上述条件下是稳定的ꎮ因此创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品可与冰袋(４ħ)一起运输ꎬ也可在温度较高(３７ħ)且无降温装置条件下运输ꎮ１５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~６:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎻ７:阴性对照ꎻ８:空白对照ꎬ下同ꎮ图５㊀４ħ条件下保存１天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图６㊀３７ħ条件下保存１４天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图７㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准㊀㊀样品短期稳定性定量分析为了分析创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的长期稳定性ꎬ在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月随机抽取３管样品进行定性和定量分析ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在－２０ħ条件下保存１２个月ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果显示第１个月和第１２个月目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小(图８Ａ㊁Ｂ)ꎬ质粒无降解(图８Ｃ㊁Ｄ)ꎮ质粒含量统计学分析结果如图９所示ꎬ各时２５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀间点间无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品在－２０ħ条件下稳定ꎬ说明创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ图８－２０ħ条件下保存１㊁１２个月创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图９－２０ħ条件下创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒㊀㊀定性标准样品长期稳定性定量分析２.５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用为了验证创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用效果ꎬ将其作为阳性对照ꎬ参照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０的方法ꎬ利用ＰＣＲ对１０种水产品中的创伤弧菌基因ｖｖｈＡ进行检测ꎬ每种样品取样７次ꎬ每个样品７个重复ꎮ结果如表４所示ꎬ在１０种水产品样本中检测出１例ｖｖｈＡ基因阳性ꎮ将阳性样本的增菌液划线至创伤弧菌鉴定平板ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板中ꎬ每种平板重复划线３次ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ平板菌落为黄色㊁圆形且扁平(图１０)ꎮ挑取菌落按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求进行生化鉴定(图１１㊁表５)ꎬ验证此阳性样本感染创伤弧菌ꎮ㊀㊀表４㊀海鲜样品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ检出结果海鲜类型检测份数检出阳性次数鱼类６０贝类３１虾类１０总计１０１㊀㊀表５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本生化鉴定结果项目结果赖氨酸紫色氨基酸对照黄色无盐胰胨水微弱生长６％氯化钠胰胨水生长旺盛８％氯化钠胰胨水不生长１０％氯化钠胰胨水不生长Ｖ－Ｐ半固体穿刺周围扩散增长３５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用图１０㊀ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板创伤弧菌菌落特征图１１㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本菌体的生化鉴定结果３㊀讨论与结论本研究构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ经测序验证后ꎬ将质粒样品真空冷冻干燥制成创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品冻干粉ꎮ对其进行均匀性和稳定性分析ꎬ检测结果均为阳性且符合目的基因片段的大小ꎬ质粒样品无降解ꎻ均匀性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品无管间差异ꎬ均匀性良好ꎻ稳定性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品在低温(４ħ)或高温(３７ħ)下可稳定保存１４天ꎻ在－２０ħ下长期存储１２个月ꎬ亦未观测到不稳定性ꎮ将所研制的创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品应用于１０种海鲜产品的检测ꎬ检出１份阳性样本ꎬ经传统培养法和生化鉴定验证ꎬ证实阳性样本确为创伤弧菌污染ꎬ表明质粒定性标准样品能够满足水产品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的快速㊁精确检测ꎮ该研究填补了我国创伤弧菌鉴定即用型质粒定性标准样品的空白ꎬ为创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测领域的应用研究打下了良好的基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＹｕｎＮＲꎬＫｉｍＤＭ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ:ａｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｔｈｒｅａｔｔｏｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ[Ｊ].ＫｏｒｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉ￣ｃｉｎｅꎬ２０１８ꎬ３３(６):１０７０－１０７８.[２]㊀Ｈｅｒｎáｎｄｅ￣ＣａｂａｎｙｅｒｏＣꎬＡｍａｒｏＣ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｙａｎｄｌｉｆｅｃｙｃｌｅｏｆｔｈｅｚｏｏｎｏｔｉｃｐａｔｈｏｇｅｎＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ[Ｊ].ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ２２(１０):４１３３－４１４８.[３]㊀彭钟琴ꎬ黄璐.水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展[Ｊ].食品安全导刊ꎬ２０２１(３６):１９０－１９２.[４]㊀ＷａｎｇＭＹꎬＨｕＣＪ.ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｏｆＶｉｂ￣ｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅｓ[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏ￣ｅｃｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２９(１２):１４７０－１４７３.[５]㊀ＩｗａｍｏｔｏＭꎬＡｙｅｒｓＴꎬＭａｈｏｎＢＥꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｓｅａ￣ｆｏｏｄ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ[Ｊ].ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉ￣ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓꎬ２０１０ꎬ２３(２):３９９－４１１.[６]㊀ＪｏｎｅｓＭＫꎬＯｌｉｖｅｒＪＤ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｄｉｓｅａｓｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｅｓｉｓ[Ｊ].ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙꎬ２００９ꎬ７７(５):１７２３－１７３３.[７]㊀ＨｅｎｇＳＰꎬＬｅｔｃｈｕｍａｎａｎＶꎬＤｅｎｇＣＹꎬｅｔａｌ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｂｕｒｄｅｎ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:９９７.[８]㊀ＨｏｒｓｅｍａｎＭＡꎬＳｕｒａｎｉＳ.ＡｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｏｆｓｅｖｅｒｅｓｅｐｓｉｓａｎｄｓｋｉｎａｎｄｓｏｆｔ￣ｔｉｓｓｕｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓ￣ｅａｓｅｓꎬ２０１１ꎬ１５(３):ｅ１５７－ｅ１６６.４５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀[９]㊀Ｂａｋｅｒ￣ＡｕｓｔｉｎＣꎬＴｒｉｎａｎｅｓＪꎬＧｏｎｚａｌｅｚ￣ＥｓｃａｌｏｎａＮꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｃｈｏｌｅｒａｖｉｂｒｉｏｓ:ｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｂａｒｏｍｅｔｅｒｏｆｃｌｉｍａｔｅｃｈａｎｇｅ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２５(１):７６－８４.[１０]ＬｉＧꎬＷａｎｇＭＹ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎｉｔｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｐｓｉｓ[Ｊ].ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０２０ꎬ６５(２):２６５－２７４.[１１]ＧａｖｉｎＨＥꎬＢｅｕｂｉｅｒＮＴꎬＳａｔｃｈｅｌｌＫＪ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒｄｏｍａｉｎｒｅ￣ｇｉｏｎｏｆｔｈｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓＭＡＲＴＸｔｏｘｉｎｃｏｎｆｅｒｓｂｉｐｈａｓｉｃｅｐｉ￣ｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎａｎｄｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｓｙｓｔｅｍｉｃｓｐｒｅａｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１７ꎬ１３(１):ｅ１００６１１９.[１２]ＲａｏＮＶꎬＳｈａｓｈｉｄｈａｒＲꎬＢａｎｄｅｋａｒＪＲ.Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎬｒｅｓｕｓｃｉｔａ￣ｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｅｓｏｆｖｉａｂｌｅｂｕｔｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｅａｗａｔｅｒ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ３０(８):２２０５－２２１２.[１３]包秋华ꎬ刘倩宇.基于ＷｅｂｏｆＳｃｉｅｎｃｅ细菌活的非可培养状态研究文献的可视化分析[Ｊ].食品科学ꎬ２０２３ꎬ４４(５):２４８－２５６.[１４]ＺｈａｎｇＸꎬＧｕｏＢꎬＹａｎｇＬＨꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ１２ａｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉ￣ｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｏｎｅｔｕｂｅ[Ｊ].ＡｃｔａＢｉｏ￣ｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＳｉｎｉｃａꎬ２０２３ꎬ５５(２):３２２. [１５]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准:食品微生物学检验创伤弧菌检验:ＧＢ４７８９.４４２０２０[Ｓ].北京:中国标准出版社ꎬ２０２０.５５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种用于分子生物学检测的快速、敏感和特异的方法。

本文将介绍RPA技术在创伤弧菌检测中的应用，并探讨其在临床和实验室诊断中的潜在作用。

创伤弧菌是一种常见的水生细菌，广泛分布于海水、淡水和土壤中。

它可以引起人类和动物的感染，导致创伤性溶血性水疱病和脓肿等疾病。

尤其在温暖的海洋环境中，创伤弧菌的感染率较高，给渔民、游泳者和海产品加工者带来了潜在的危险。

对创伤弧菌的快速、准确检测显得尤为重要。

传统的创伤弧菌检测方法主要包括培养和PCR技术。

这些方法存在一些限制，比如需要复杂的实验操作、长时间的分析过程和对设备和培养条件的严格要求。

为了更好地应对创伤弧菌感染的检测需求，研究人员开始探索新的检测方法，其中RPA技术便成为了备受关注的一种选择。

RPA技术是一种新型的核酸扩增技术，能够在较短的时间内快速放大细菌DNA，并具有高度的特异性和敏感性。

其操作步骤相对简单，无需复杂的温度循环装置，仅需要在一定的恒温条件下进行反应即可。

在RPA反应中还可以添加引物和探针，使得该技术更具多样性和灵活性。

利用RPA技术进行创伤弧菌的检测有许多优势。

RPA技术能够在短时间内迅速扩增创伤弧菌的DNA序列，从而提供快速的检测结果。

RPA技术对环境条件的要求较低，能够在简单的恒温设备下进行反应，适用于野外环境或简易实验室条件下的快速检测。

RPA技术具有高度的特异性和敏感性，能够准确鉴定创伤弧菌的存在，并且不易受到其他杂质的干扰。

除了以上的优势外，RPA技术在创伤弧菌检测中还具有一些潜在的应用价值。

RPA技术可以作为快速诊断创伤弧菌感染的辅助手段，在临床急救和医疗救护中起到关键作用。

RPA技术还可以用于海产品和水产养殖场的监测，帮助及时发现潜在的创伤弧菌污染，保障食品安全和养殖环境的卫生。

在实际的应用中，RPA技术也需要一定的配套设备和试剂。

目前市面上已经有不少公司推出了相关的RPA检测试剂盒和便携式检测设备，为RPA技术在创伤弧菌检测中的应用提供了便利的条件。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，简称RPA）是一种新型的核酸扩增技术，可在低温（25-42°C）下高效、快速地扩增特定DNA序列。

相对于传统的PCR技术，RPA技术具有更高的特异性、更快的反应速度和更低的温度要求。

RPA技术在环境监测、食品安全、医学诊断等领域具有广阔的应用前景。

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）是一种属于弧菌科的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于温暖海水和海产产品中。

创伤弧菌感染可引起人类剧烈腹泻，甚至导致败血症和全身性感染，对人类健康造成严重威胁。

快速、准确地检测创伤弧菌具有重要的意义。

利用RPA技术检测创伤弧菌主要包括以下几个步骤：1. 样品处理：将待测样品（如海水、海产品等）采集并进行预处理。

可以通过简单的过滤或离心沉淀的方法去除悬浮固体颗粒，提取样品中的目标DNA。

2. RPA反应体系的制备：根据不同的实验要求和检测平台，配置合适的RPA反应体系。

反应体系主要包括RPA酶、引物、盐和共振能量传递剂（降低pH值、增强RPA反应效率）。

为了提高检测灵敏度和特异性，可以添加有选择性的抑制剂或添加剂。

3. RPA反应进行：将待测样品DNA溶液加入反应管中，与RPA反应体系混合均匀。

然后将反应管置于恒温器中，在适当的温度下进行反应。

由于RPA反应在低温下进行，可有效避免了传统PCR反应中高温引起的非特异性扩增。

4. 结果分析：通过不同的检测方法，可以判断RPA反应是否成功扩增出目标DNA序列。

常见的方法包括凝胶电泳、实时荧光检测、便携式PCR仪器等。

根据实验需求和设备条件，选择合适的方法进行结果分析。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种用于快速检测病原微生物的新型分子生物学方法。

它具有快速、高灵敏度、高特异性和简便操作的特点，因此在医学、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。

本文将重点介绍RPA技术在检测创伤弧菌中的应用。

创伤弧菌是一种常见的致病菌，它可以引起人类和动物的创伤性感染。

在海产品加工和贮藏过程中，创伤弧菌也可能引起食品安全问题。

对创伤弧菌的快速检测具有重要的意义。

传统的创伤弧菌检测方法主要包括细菌培养、PCR等，这些方法需要较长的时间和复杂的实验操作，限制了其在实际应用中的效果。

在RPA技术的检测过程中，选择合适的靶标基因至关重要。

通过文献调研和实验验证，发现创伤弧菌的16S rRNA基因是一种理想的靶标基因。

这一基因在不同菌株中具有高度的保守性，可以有效地区分创伤弧菌与其他细菌，在RPA技术中得到了广泛的应用。

在RPA技术中，关键的试剂是RPA核酸酶和RPA聚合酶。

RPA核酸酶能够在低温下识别和结合靶标DNA的特定区域，并在其3'-5'方向上具有核酸内切酶活性，用于切割DNA链。

RPA聚合酶则具有DNA合成酶的活性，能够在RPA核酸酶的辅助下完成对目标DNA的等温扩增。

这些试剂的优异性能使得RPA技术在创伤弧菌的快速检测中得到了成功的应用。

RPA技术还可以与便携式核酸检测设备结合，实现真正的快速检测。

这些设备体积小巧，操作简单，能够在不同的实验场景中实现对创伤弧菌的快速检测，尤其适合于海产品加工环节和食品安全监测等领域。

RPA技术在创伤弧菌的快速检测中具有重要的应用前景。

它能够快速、高效地实现对创伤弧菌的检测，具有较高的特异性和灵敏度。

随着RPA技术的不断发展和完善，相信它将在创伤弧菌的快速检测领域发挥出更大的作用，为食品安全和公共卫生做出更大的贡献。

【2000字】。

1例创伤弧菌感染致坏死性筋膜炎的诊疗实践并文献分析陶春;范昔庚;周琳;石敏;胡功利;田塬;王仲书【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2024(33)12【摘要】目的提高创伤弧菌感染的治疗效果。

方法回顾性分析1例创伤弧菌感染致坏死性筋膜炎的诊疗过程。

该患者因“烹饪生蚝时被刺伤致右手肿胀、疼痛1 d”入院,予注射用头孢呋辛钠抗感染及降血糖等对症支持治疗3 d,感染仍呈加重趋势,请临床药师会诊。

临床药师通过查阅文献,并根据患者的流行病学史、糖尿病史、临床表现、病程特点,考虑为创伤弧菌感染,建议使用注射用头孢曲松钠+左氧氟沙星氯化钠注射液静脉滴注,联合外科手术清创进行抢先治疗,医师采纳。

入院第5天,患者脓液细菌培养结果示创伤弧菌,且头孢曲松和左氧氟沙星对其敏感。

入院第18天,患者感染症状及体征明显好转,血糖控制稳定,疗程足够,临床药师建议停用抗菌药物,医师采纳。

结果入院第30天,患者伤口完全愈合,未诉特殊不适,治愈出院;随访6个月,未见复发。

结论创伤弧菌感染致坏死性筋膜炎进展迅速,死亡率高,医务工作者应加强对创伤弧菌感染的认识,及时进行针对性治疗。

采用政策干预,对大众进行预防性宣教,可减少创伤弧菌感染的发病率。

【总页数】5页(P115-119)【作者】陶春;范昔庚;周琳;石敏;胡功利;田塬;王仲书【作者单位】四川省自贡市第四人民医院【正文语种】中文【中图分类】R969.4【相关文献】1.真菌感染致四肢坏死性筋膜炎一例并文献复习2.创伤弧菌感染引起的坏死性筋膜炎2例3.创伤弧菌感染2例的护理分析并文献复习4.创伤弧菌坏死性筋膜炎5例报告并文献复习5.创伤弧菌感染所致坏死性筋膜炎1例因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。