《食品安全国家标准 食品微生物学检验+创伤弧菌检验(征求意见稿)》

产气荚膜梭菌国标检测方法
《产气荚膜梭菌国标检测方法》
产气荚膜梭菌是一种在自然界中广泛分布的细菌，在土壤、水体和动植物表面等环境中都可能存在，同时也是人和动物的肠道正常菌群。

然而，产气荚膜梭菌也会引起食物中毒，对人体健康造成威胁。

因此，及时、准确地检测产气荚膜梭菌成为了食品安全监管的重要内容之一。

为了规范产气荚膜梭菌的国家标准检测方法，中国国家标准化管理委员会发布了《食品安全国家标准食品微生物检验鲜肉和肉制品、水产品及蛋品中产气荚膜梭菌检验》（GB 4789.9-2016）。

该标准规定了在食品中产气荚膜梭菌的检测方法及技术要求，其内容包括了样品制备、检测方法、结果判读和报告等方面。

在该标准中，样品制备包括了样品采集、致病菌分离培养和纯化等步骤；检测方法主要采用分子生物学技术和培养方法相结合的策略；结果判读则依据标准规定的指标和标准质控程序进行判定；报告部分则要求对检测结果进行详细的描述和解释。

此外，随着检测技术的不断更新和完善，国家标准化管理委员会也会不断修订和完善相关标准，以确保检测方法的准确性和适用性。

同时，食品生产企业也应当严格按照国家标准要求，对生产过程中的食品样品进行产气荚膜梭菌的检测，以保障食品的安全和质量。

总之，《产气荚膜梭菌国标检测方法》作为国家标准的一部分，对食品安全监管起着重要的作用，通过该标准的执行，可以有效避免食品中产气荚膜梭菌的污染，保障食品安全，保护消费者的健康。

新实施：GB 4789.4-2024沙门氏菌——的预增菌变化G B4789.420242024年3月，国家卫健委、市场监管总局联合发布了47项食品安全国家标准和6项修改单，其中包含《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》（G B 4789.4-2024）检验方法标准。

这一新标准对实验设备、材料和试剂、检验程序与操作步骤进行了修改，并将于2024年8月8日实施。

本文就该标准主要修订内容、操作注意事项进行解读。

主要变化及原因分析变化1：在“预增菌”步骤中新增了在检验乳粉样品时，须将样品倒入225m L B P W 培养基表面，静置60m i n后再进行预增菌。

乳粉类样品经过高温喷雾干燥，其中的沙门氏菌大多处于受损状态；乳粉相对干燥且水活度低，其中受损的沙门氏菌适应了干燥的环境。

在这种情况下，如果受损的沙门氏菌在B P W中快速混匀水化，受损的沙门氏菌会出现渗透压休克；采用浸泡法在室温条件下静置一段时间后再进行预增菌，可以促进受损沙门氏菌的复苏，提高检出率。

变化2：选择性增菌培养基由氯化镁孔雀绿大豆胨（R V S）增菌液代替亚硒酸盐胱氨酸（S C）增菌液，并且B P W接种量改为0.1m L到10m L R V S中，选择性增菌温度为42℃±1℃。

S C增菌液主要适用于伤寒沙门氏菌的选择性增菌，但通过近几年疾病监测发现，我国伤寒、副伤寒沙门氏菌的发病率从10例/10万下降到0.8例/10万左右，而非伤寒沙门氏菌近年来发病率达到560例/10万，在微生物引发的食源性疾病中排前2位。

从培养基成分上看，R V S中含有孔雀绿，能够抑制非沙门氏菌的生长，大豆蛋白胨有利于沙门氏菌的复苏；S C增菌液配置需要的亚硒酸氢钠具有一定毒性，在健康环保方面也存在安全风险，且原料不稳定，过度加热培养基容易变性导致功能失效。

变化3：T T B四硫磺酸钠煌绿增菌液（T T B）选择性增菌改为：低背景菌培养温度为36℃±1℃，高背景菌培养温度为42℃±1℃。

《非预包装即食食品微生物限量》标准编制说明目录1.工作简况0矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔。

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1.1 任务来源、起草单位、起草人0聞創沟燴鐺險爱氇谴净祸測。

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1.2 简要起草过程0残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟婭骒。

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2.目的和意义0酽锕极額閉镇桧猪訣锥顧荭。

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2.1 急需制定标准以指导生产经营、开展监督管理、促进贸易交换和规范质量仲裁0彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑诒尔。

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2.2 当前可参照的国家标准不适用非预包装即食食品的监管，并带来一系列问题0謀荞抟箧飆鐸怼类蒋薔點鉍。

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2.3 我省开展地方标准研制工作有利于完善标准体系1厦礴恳蹒骈時盡继價骚卺癩。

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3. 标准制订的必要性1茕桢广鳓鯡选块网羈泪镀齐。

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3.1 即食食品定义1鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴縈诘。

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3.2 微生物指标意义1籟丛妈羥为贍偾蛏练淨槠挞。

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3.2.1 菌落总数1預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴買闥。

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3.2.2 指示微生物1渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦鋇絨。

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3.2.3 食源性致病菌1铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡缝勵。

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3.3 国内外标准对即食食品微生物限量要求2擁締凤袜备訊顎轮烂蔷報赢。

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3.4 我国大陆地区对食品微生物限量要求2贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷鯛汉。

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3.5 国外和部分发达地区标准比较分析2坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚跻馱。

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3.6 我国即食食品标准缺失2蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘籜葦。

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3.7非预包装即食食品的监测数据3買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄届嬌。

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4. 编制过程7綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴飙钪。

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食品科技水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展彭钟琴，黄　璐（广东茂名农林科技职业学院，广东茂名 525000）摘　要：创伤弧菌引起的食物中毒多发生在6—10月，易受污染的食品主要是水产品。

水产品的微生物污染与食品安全有着密切的关系，为了较好地控制水产品的质量，确保消费者的饮食安全，水产品必须经过严格的微生物检验，达标后才能流进入市场。

本文简要综述了创伤弧菌的检测方法，为创伤弧菌感染的早期诊断和及时治疗提供参考。

关键词：创伤弧菌；检测方法；PCRResearch Progress on Detection Techniques of Vibrio Vulnificusin Aquatic ProductsPENG Zhongqin, HUANG Lu(Guangdong Maoming Agriculture & Forestry Technical College, Maoming 525000, China) Abstract: Food poisoning caused by Vibrio vulnificus mostly occurs in June to October, and the easily contaminated food is mainly aquatic products.Microbial pollution of aquatic products is closely related to food safety. In order to better control the quality of aquatic products and ensure the food safety of consumers, aquatic products must be strictly microbial tested to meet the standard before they can flow to the market.A brief review of the Vibrio vulnificus detection methods will provide references for the early diagnosis and timely treatment of Vibrio vulnificus infection.Keywords:Vibrio vulnificus; detection technology; polymerase chain reaction淡水和海水的水体中含有多种天然存在的微生物，水产品在捕获和加工过程中也会受到污染而携带致病菌。

国家质量监督检验检疫总局关于发布《出口食品微生物学检验通则》等215项出入境检验检疫行业标准的
通知
文章属性
•【制定机关】国家质量监督检验检疫总局(已撤销)
•【公布日期】2012.05.07
•【文号】国质检认[2012]237号
•【施行日期】2012.06.01
•【效力等级】部门规范性文件
•【时效性】现行有效
•【主题分类】通关,标准化
正文
国家质量监督检验检疫总局关于发布《出口食品微生物学检验通则》等215项出入境检验检疫行业标准的通知（国质检认〔2012〕237号2012年5月7日）各直属检验检疫局，中国检验检疫科学研究院、国家质检总局国际检验检疫标准与技术法规研究中心：
经审查，现将《出口食品微生物学检验通则》等215项出入境检验检疫行业标准予以发布。

标准编号、标准名称、代替标准及实施日期见附件。

代替标准自本批标准实施之日起废止。

附件：出入境检验检疫行业标准目录
附件：。

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(１):１４７~１５５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０１.０２０收稿日期:２０２３－０４－０７基金项目:国家重点研发计划 食品安全关键技术研发 重点专项(２０１７ＹＦＣ１６０１４００)ꎻ山东省重点研发计划项目(２０２２ＴＺＸＤ００２２)ꎻ泰山学者工程专项经费资助(ｔｓｑｎ２０１９０９１６８)ꎻ山东省自然科学基金青年基金项目(ＺＲ２０２０ＱＣ２２６)ꎻ济南市 新高校２０条 项目(２０２２２８０６２)ꎻ山东省农业科学院国际科技合作专项(ＣＸＧＣ２０２２Ｆ０９)作者简介:袁玮(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为食品微生物检测技术研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:７９４３９３６１７＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:陈相艳(１９７３ )ꎬ女ꎬ研究员ꎬ研究方向为食源性病原微生物检测及标准物质研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:３１５４７８８４５＠ｑｑ.ｃｏｍ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用袁玮１ꎬ２ꎬ陈蕾蕾１ꎬ２ꎬ杨金玉１ꎬ周庆新１ꎬ２ꎬ裘纪莹１ꎬ赵双枝１ꎬ付恩君１ꎬ赵国琰２ꎬ陈相艳１(１.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室/农业农村部新食品资源加工重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ２.山东师范大学生命科学学院ꎬ山东济南㊀２５００１４)㊀㊀摘要:针对我国缺乏适用于创伤弧菌检测的质粒标准样品的现状ꎬ本研究开展了创伤弧菌鉴定即用型定性质粒标准样品的研制和应用工作ꎮ首先构建了创伤弧菌毒力基因ｖｖｈＡ的重组质粒ꎬ经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉ꎬ然后对其进行ＰＣＲ定性检测及紫外分光光度计法定量分析ꎮ均匀性检验结果表明ꎬ样品间无显著差异ꎬ均匀性良好ꎬ符合预期目标ꎻ短期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在４ħ㊁３７ħ条件下稳定保存１４天ꎻ长期稳定性检验结果表明ꎬ样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ研究结果表明ꎬ创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求ꎬ为创伤弧菌的快速㊁高通量的定性鉴定分析提供了可靠的参考物质ꎮ将标准样品应用于鱼类㊁贝类等１０份海鲜类食品样品的检测中ꎬ经传统培养法验证ꎬ检测结果准确无误ꎮ本研究所研制的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力ꎬ为其在食品检测领域的推广应用奠定了重要基础ꎮ关键词:创伤弧菌ꎻ质粒定性标准样品ꎻ水产品ꎻ检测中图分类号:Ｓ８５２.６１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０１－０１４７－０９ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｅｒｔｉｆｉｅｄＰｌａｓｍｉｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｔｅｒｉａｌｆｏｒＨｅｍｏｌｙｓｉｎＧｅｎｅｖｖｈＡｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓａｎｄＩｔ ｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＡｑｕａｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＹｕａｎＷｅｉ１ꎬ２ꎬＣｈｅｎＬｅｉｌｅｉ１ꎬ２ꎬＹａｎｇＪｉｎｙｕ１ꎬＺｈｏｕＱｉｎｇｘｉｎ１ꎬ２ꎬＱｉｕＪｉｙｉｎｇ１ꎬＺｈａｏＳｈｕａｎｇｚｈｉ１ꎬＦｕＥｎｊｕｎ１ꎬＺｈａｏＧｕｏｙａｎ２ꎬＣｈｅｎＸｉａｎｇｙａｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄ＆ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏ￣ｐｒｏｄｕｃｔｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｏｖｅｌＦｏｏｄＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＤｕｅｔｏｌａｃｋｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎＣｈｉｎａꎬａｒｅａｄｙ￣ｔｏ￣ｕｓｅｃｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｈｅｒｅｉｎ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｉｒｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｐｏｗｄｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎ￣ｃｉｎｇｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｅｉｎｇｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＵＶｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ.Ｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓａｍｐｌｅｓꎬａｎｄｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙｗａｓａｓｅｘｐｅｃｔｅｄ.Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｅ￣ｐａｒｅｄｐｌａｓｍｉｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｂｅｓｔａｂｌｙｐｒｅｓｅｒｖｅｄｆｏｒ１４ｄａｙｓａｔ４ħｏｒ３７ħꎬａｎｄｆｏｒａｔｌｅａｓｔ１２ｍｏｎｔｈｓａｔ－２０ħ.ＴｈｅｏｖｅｒａｌｌｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｃｏｕｌｄｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｎａｔｉｏｎａｌｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏ￣ｖｉｄｅｄｒｅｌｉａｂｌｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶ.ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ.Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ１０ｓｅａｆｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｓｕｃｈａｓｆｉｓｈａｎｄｓｈｅｌｌｆｉｓｈ.ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｏｂｅａｃｃｕｒａｔｅｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ.ＡｂｏｖｅａｌｌꎬｔｈｅｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｓｏｆｖｖｈＡｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｄｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｌａｙｉｎｇａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｏｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓꎻＣｅｒｔｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌꎻＡｑｕａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓꎻＤｅｔｅｃｔｉｏｎ㊀㊀创伤弧菌(Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ)是一种革兰氏阴性菌ꎬ主要特性为嗜盐㊁喜温ꎬ自然分布于世界各地沿海和河口水域[１－２]ꎬ是一种人畜共患病原菌ꎬ容易感染鱼㊁虾㊁牡蛎㊁蛤㊁螃蟹等海产品ꎬ人类通过生食或食用未完全煮熟的海产品㊁破损皮肤直接接触被其污染的海水或海产品而患病[３]ꎮ创伤弧菌与霍乱弧菌㊁副溶血弧菌并称为人类三大致病弧菌[４]ꎬ弧菌感染病例具有明显的季节性ꎬ大多数发生在夏季和初秋气温较高的时期[５]ꎮ随着全球气候变暖㊁海洋温度升高等自然条件的变化ꎬ创伤弧菌的感染率也逐年增加ꎮ在全世界范围内创伤弧菌感染的死亡率高达６０％ꎬ在美国约为３３％ꎬ使其成为严重的公共卫生和食品安全问题[６－７]ꎮ创伤弧菌感染的主要症状包括肠胃炎㊁原发创伤性感染㊁败血症和坏死性筋膜炎等ꎬ免疫力低下或患有糖尿病㊁肝脏疾病等慢性基础病的患者属于易感人群[８]ꎮ创伤弧菌伤口感染通常以肿胀㊁红斑和剧烈疼痛为特征ꎬ潜伏期短ꎬ发病迅速ꎬ病变经常演变为可坏死的囊泡或充满液体的大泡ꎬ最终引起多脏器衰竭[９]ꎮ创伤弧菌菌体产生的创伤弧菌外毒素通过特定的毒力机制引发疾病ꎮ创伤弧菌毒力因子主要包括溶细胞素㊁铁载体㊁金属蛋白酶㊁荚膜多糖等[１０]ꎬ由ｖｖｈＡ基因编码的创伤弧菌溶细胞素是唯一分泌到细胞外的外毒素ꎬ具有创伤弧菌种属特异性ꎬ可作为鉴定创伤弧菌的指标[１１]ꎮ当前ꎬ对创伤弧菌进行定量检测主要通过平板计数㊁ＭＰＮ法等传统培养法ꎬ这些方法需要进行过夜培养㊁选择性平板分离㊁生化鉴定㊁血清学检测等繁琐的试验步骤ꎬ不仅耗时费力ꎬ同时样本中杂菌的过量繁殖也会对鉴别结果产生影响ꎮ另外ꎬ由于水产品中的创伤弧菌通常处于 活的且不可培养 的状态[１２－１３]ꎬ传统的培养方法很难对该部分创伤弧菌进行有效鉴定ꎬ严重降低了检测结果的准确度ꎮ作为最危险的食源性细菌之一ꎬ创伤弧菌造成了９５％的海鲜相关死亡ꎬ已成为一个主要的食品安全问题[１４]ꎮ随着食品供应链的全球化ꎬ创伤弧菌的定期监测变得更加重要ꎮ为了满足当下快速㊁高通量检测的需求ꎬ分子生物学方法在食品微生物的检测中得到了越来越广泛的应用ꎬ但相关的参考物质相对匮乏ꎮ食源性微生物检测即用型标准样品的研制ꎬ有助于解决目前国内食品微生物检测中存在的参考物质不足的难题ꎬ使具有自主知识产权的标准样品在相关领域得到更好的推广和应用ꎬ从而摆脱对国外标准样品的依赖ꎮ因此ꎬ建立创伤弧菌鉴定检测即用型质粒定性标准样品用于其快速㊁高通量鉴定ꎬ对提高水产品的质量安全㊁保证人类健康具有重要意义ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料１.１.１㊀菌株来源㊀创伤弧菌(ＣＩＣＣ２１６１５)来源于中国工业微生物保藏中心ꎮ１.１.２㊀主要试剂㊀琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司ꎻＰＮＣＣ增菌液基础培养基㊁ＰＮＣＣ添加剂㊁ｍＣＰＣ琼脂基础培养基㊁多粘菌素Ｅ㊁多粘菌素Ｂ购自北京陆桥技术股份有限公司ꎻ核酸染料ＧｅｌＳｔａｉｎ㊁Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒ㊁Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋ￣ｅｒ㊁质粒大提试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司ꎻ５０ˑＴＡＥ缓冲溶液购自生工生物工程(上海)股份有限公司ꎻ２ˑＴａｑＰＣＲＭｉｘ㊁琼脂糖８４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀凝胶ＤＮＡ回收试剂盒㊁ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司ꎮ１.１.３㊀仪器和设备㊀ＺＨＷＹ－２００Ｈ恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司ꎻＳＷ－ＣＪ－２Ｄ双人净化工作台购自苏州净化设备有限公司ꎻＣ１０００ＴｏｕｃｈＰＣＲ仪㊁ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司ꎻＪＹ６００Ｃ水平电泳仪㊁ＪＹ０４Ｓ－３Ｃ凝胶成像系统购于北京君意东方电泳设备有限公司ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀重组质粒的获取与验证㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎬ获得重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ并保存于大肠埃希氏菌Ｔｏｐ１０菌株中ꎮ依据ＧＢ４７８９.４４ ２０２０«食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验»[１５]中创伤弧菌ＰＣＲ检测的引物序列ꎬ由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(表１)ꎮ以重组质粒为模板ꎬ利用创伤弧菌鉴定引物ꎬ对目的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析ꎬ使用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒对ＰＣＲ产物进行胶回收ꎬ使用ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒将ＰＣＲ纯化产物连接至ｐＬＢ－ｓｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ上ꎬ并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ置于３７ħ培养箱培养１２ｈꎮ从平板上挑取单菌落ꎬ经ＰＣＲ反应鉴定为阳性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定ꎬ测序结果与预期一致的ꎬ即为验证正确的重组质粒ꎮ将携带正确重组质粒的大肠埃希氏菌于－８０ħ超低温冰箱中甘油管保存ꎮ㊀㊀表１㊀创伤弧菌ｖｖｈＡ基因的引物序列引物名称引物序列(５ᶄң３ᶄ)片段大小/ｂｐｖｖｈＡ－ＦＣＣＧＣＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＡｖｖｈＡ－ＲＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＧＧＧＣＣ５１９１.２.２㊀重组质粒的提取㊀将携带重组质粒的大肠埃希氏菌甘油管解冻ꎬ接入４ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ放入２００ｒ/ｍｉｎ的振荡摇床中３７ħ培养１２ｈꎬ取２ｍＬ种子液转接于２００ｍＬ的ＬＢ液体培养基中扩大培养ꎬ获取大量携带重组质粒大肠埃希氏菌的培养液ꎬ利用细菌质粒大提试剂盒提取质粒ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析质粒完整性ꎬＰＣＲ验证目的基因ꎬ紫外分光光度计检测质粒的浓度和纯度ꎮ１.２.３㊀重组质粒的含量检测㊀取重组质粒样品１μＬꎬ于ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计中检测浓度ꎬ每管检测两次ꎮ１.２.４㊀重组质粒的分装㊀将大提的质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ每管１００μＬ分装至螺口冻存管中ꎬ贴上标签ꎮ１.２.５㊀重组质粒的冷冻干燥㊀由于质粒样品较为稳定ꎬ分装后可直接冻干ꎮ在－２５ħ㊁真空度为５０Ｐａ条件下冻干２０ｈꎮ１.２.６㊀质粒定性标准样品的均匀性分析㊀按照随机抽号系统抽取的号码ꎬ抽取质粒定性标准样品１２管ꎬ用１００μＬ无菌水溶解质粒冻干粉ꎮ取０.５μＬ溶解的质粒样品作为ＰＣＲ模板ꎬ按照１.２.１方法进行基因定性检测ꎻ取质粒样品２μＬꎬ按照１.２.１方法琼脂糖凝胶电泳分析质粒样品的完整性ꎻ取质粒样品１μＬꎬ采用紫外分光光度计法进行复溶质粒样品的定量试验ꎬ检测样品的浓度ꎬ每管测两次ꎬ核酸含量＝核酸浓度ˑ水化体积ꎬ核酸含量结果统计分析采用方差分析法ꎮ１.２.７㊀质粒定性标准样品的稳定性分析㊀稳定性检验方法同均匀性检验ꎬ核酸含量结果统计分析采用单因素方差分析法ꎮ短期稳定性检验:采取两种短期稳定性试验ꎮ第一种模拟冰袋运输:在４ħ条件下的短期储存稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于４ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎻ第二种模拟高温运输:在３７ħ条件下稳定性试验ꎬ随机取样２１管置于３７ħ保温箱ꎬ分别在第１㊁３㊁５㊁７㊁９㊁１１㊁１４天时每天检测３管ꎬ每管２个重复ꎮ长期稳定性检验:质粒样品经冷冻干燥后ꎬ需要在－２０ħ条件下长期冷冻保存ꎮ为了测定质粒样品长期保存时间及其稳定性ꎬ每次检测时ꎬ从冷冻样品中随机取出３管样品ꎬ每管重复２次ꎮ抽样时间点遵循先密后疏的原则ꎬ分别在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月共７个时间点抽样检测ꎮ１.２.８㊀创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测中的应用㊀食品样本的前处理:将购买的食品样本按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求处理ꎬ在无菌条件９４１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用下ꎬ称取鲫鱼㊁偏口鱼㊁银鲳鱼㊁鲤鱼㊁鲅鱼㊁黄花鱼６种鱼类样品的表面组织㊁肠和腮各２５ｇꎬ花蛤㊁海蛎子和生蚝３种贝类样品内容物各２５ｇꎬ明虾的头足部组织２５ｇꎬ分别放入含２２５ｍＬＰＮＣＣ增菌液的无菌均质袋ꎬ用拍打式无菌均质器拍打２ｍｉｎ制成样品匀液ꎻ将均质袋放入培养箱３７ħ培养１８ｈ获得增菌液ꎬ取距液面１ｃｍ深处菌液１ｍＬ放入离心管中ꎬ９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎻ用１ｍＬＰＢＳ磷酸盐缓冲液悬浮清洗后９０００ｒ/ｍｉｎ离心３ｍｉｎꎬ去上清ꎬ重复２次ꎻ加入１ｍＬ无菌去离子水ꎬ煮沸１０ｍｉｎꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ吸取上清液ꎮＰＣＲ分析:将上清液用作ＰＣＲ反应的ＤＮＡ模板ꎻ随机抽取１管创伤弧菌重组质粒定性标准样品ꎬ加入１００μＬ无菌去离子水溶解ꎬ作为阳性对照ꎻ将大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３基因组ＤＮＡ冻干粉用３００μＬ无菌水溶解(终浓度为２０ｎｇ/μＬ)后作为阴性对照ꎻ无菌去离子水为空白对照ꎬ按照１.２.１的方法进行ＰＣＲ分析ꎮ创伤弧菌的分离验证:取检测为阳性的食品样本的增菌液ꎬ用接种环将其划线接种于ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ验证菌落形态是否符合创伤弧菌菌落形态特征ꎬ即圆形㊁扁平ꎬ光照下透明但中心不透明的黄色或橘黄色菌落ꎬ直径１~２ｍｍꎮ创伤弧菌的生化鉴定:按照ＧＢ４７８９.４４２０２０进行创伤弧菌的培养和生化特性鉴定ꎮ１.３㊀数据统计与分析使用ＳＰＳＳ２６.０软件的ＡＮＯＶＡ法进行单因素方差分析ꎬ统计各处理组之间的差异性ꎬ数据用平均值ʃ标准误 表示ꎬＰ<０.０５表示差异显著ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀创伤弧菌重组质粒的验证以创伤弧菌重组质粒为模板ꎬ对其进行目的基因ＰＣＲ扩增验证ꎬ以大肠埃希氏菌ＣＩＣＣ１０００３为阴性对照ꎬ无菌去离子水为空白对照ꎮ琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ扩增结果(图１Ａ)显示ꎬ创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ基因为阳性ꎬ条带清晰ꎬ片段大小为５１９ｂｐꎬ符合目的条带大小ꎬ说明成功构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ重组质粒ꎬ质粒图谱如图１Ｂ所示ꎮＭ:Ｔｒａｎｓ２０００ｍａｒｋｅｒꎻ１:ｖｖｈＡ质粒ꎻ２:阴性对照ꎻ３:空白对照ꎮ图１㊀创伤弧菌重组质粒ＰＣＲ扩增(Ａ)及ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ重组质粒图谱(Ｂ)２.２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度及纯度分析取重组质粒１μＬꎬ利用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００测定其浓度和纯度ꎬ结果如表２所示ꎬＡ２６０/２８０㊁Ａ２６０/２３０均超过１.８ꎬ说明所提取的质粒纯度高ꎬ无蛋白质和有机物污染ꎻ对其携带的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图２Ａ)显示ꎬ目的基因ｖｖｈＡ条带单一且片段大小符合预期ꎬ质粒完整性分析(图２Ｂ)显示质粒条带完整ꎬ说明所制备的质粒符合预期ꎮ㊀㊀表２㊀创伤弧菌重组质粒的浓度与纯度样品管号浓度/(ｎｇ/μＬ)Ａ２６０/Ａ２８０Ａ２６０/Ａ２３０ＶＡ１１６７.０１.８６２.２１ＶＡ２１８９.５１.８８２.２９ＶＡ３１７３.６１.８８２.２６ＶＡ４８２.１１.８９２.５３０５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀Ｍ:Ｔｒａｎｓ１５０００ｍａｒｋｅｒꎻ１~８:ｖｖｈＡ质粒样品ꎮ图２㊀创伤弧菌重组质粒ｖｖｈＡ的ＰＣＲ扩增(Ａ)及质粒完整性(Ｂ)分析㊀㊀将４管大提的创伤弧菌重组质粒样品混合至１管中ꎬ采用紫外分光光度计测定浓度ꎬ然后用无菌去离子水稀释至２０ｎｇ/μＬꎬ取１００μＬ分装至２ｍＬ螺口冻存管中ꎬ所有质粒溶液分装４５０管后ꎬ置于真空冷冻干燥机中按照冷冻程序真空冷冻干燥ꎬ获得白色粉末状的冻干质粒样品ꎬ设计创伤弧菌重组质粒定性标准样品标签纸ꎬ打印并贴在管外(图３)ꎮ质粒定性标准样品置于－２０ħ冰箱冻存ꎮ２.３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的均匀性分析从４５０管质粒标准样品中随机抽取１２管进行ＰＣＲ定性试验ꎬ结果如图４Ａ所示ꎬ各管ＰＣＲ扩增目的基因均为阳性ꎬ条带单一且清晰ꎬ图４Ｂ显示质粒完整无降解ꎮ使用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００超微量分光光度计进行质粒标准样品的浓度㊁纯度分析ꎬ对所测数据进行单因素方差分析ꎬ结果如表３所示ꎬ在９５％的置信概率下ꎬＦ值小于Ｆ临界值ꎬ各管间质粒含量无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品均匀性良好ꎮ图３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~１２:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎮ图４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ)及均匀性(Ｂ)分析㊀㊀表３㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品均匀性试验方差分析平方和ＳＳ自由度均方ＭＳＦ值Ｆ临界值置信概率Ｐ值组间０.０２１１１０.０２２.７００２.７２０.９５０.０５１组内０.００８１２０.０１２.４㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的稳定性分析温度是运输过程中影响质粒定性标准样品质量的主要因素ꎬ因此设计不同温度模拟质粒样品运输条件ꎬ以质粒标准样品目的基因阳性检出㊁质粒完整性及核酸含量变化确定其短期稳定性(运输稳定性)ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品分别在４ħ和３７ħ条件下保存１４ｄꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果(图５㊁图６)显示第１天和第１４天目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小ꎬ质粒无降解ꎻ质粒含量统计学分析结果如图７所示ꎬ各时间点间无显著性差异ꎬ表明质粒含量无明显变化ꎬ说明质粒定性标准样品在上述条件下是稳定的ꎮ因此创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品可与冰袋(４ħ)一起运输ꎬ也可在温度较高(３７ħ)且无降温装置条件下运输ꎮ１５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用Ｍ:ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ１~６:ｖｖｈＡ质粒标准样品ꎻ７:阴性对照ꎻ８:空白对照ꎬ下同ꎮ图５㊀４ħ条件下保存１天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图６㊀３７ħ条件下保存１４天创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图７㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准㊀㊀样品短期稳定性定量分析为了分析创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的长期稳定性ꎬ在第１㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１０㊁１２个月随机抽取３管样品进行定性和定量分析ꎮ创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在－２０ħ条件下保存１２个月ꎬ琼脂糖凝胶电泳分析结果显示第１个月和第１２个月目的基因均为阳性ꎬ电泳条带单一ꎬ符合预期条带大小(图８Ａ㊁Ｂ)ꎬ质粒无降解(图８Ｃ㊁Ｄ)ꎮ质粒含量统计学分析结果如图９所示ꎬ各时２５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀间点间无显著性差异ꎬ表明质粒定性标准样品在－２０ħ条件下稳定ꎬ说明创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品能在－２０ħ条件下稳定保存至少１２个月ꎮ图８－２０ħ条件下保存１㊁１２个月创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品ＰＣＲ扩增(Ａ㊁Ｂ)及完整性(Ｃ㊁Ｄ)分析图９－２０ħ条件下创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒㊀㊀定性标准样品长期稳定性定量分析２.５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用为了验证创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品在水产品检测中的应用效果ꎬ将其作为阳性对照ꎬ参照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０的方法ꎬ利用ＰＣＲ对１０种水产品中的创伤弧菌基因ｖｖｈＡ进行检测ꎬ每种样品取样７次ꎬ每个样品７个重复ꎮ结果如表４所示ꎬ在１０种水产品样本中检测出１例ｖｖｈＡ基因阳性ꎮ将阳性样本的增菌液划线至创伤弧菌鉴定平板ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板中ꎬ每种平板重复划线３次ꎬ３７ħ培养１８ｈꎬ平板菌落为黄色㊁圆形且扁平(图１０)ꎮ挑取菌落按照ＧＢ４７８９.４４ ２０２０要求进行生化鉴定(图１１㊁表５)ꎬ验证此阳性样本感染创伤弧菌ꎮ㊀㊀表４㊀海鲜样品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ检出结果海鲜类型检测份数检出阳性次数鱼类６０贝类３１虾类１０总计１０１㊀㊀表５㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本生化鉴定结果项目结果赖氨酸紫色氨基酸对照黄色无盐胰胨水微弱生长６％氯化钠胰胨水生长旺盛８％氯化钠胰胨水不生长１０％氯化钠胰胨水不生长Ｖ－Ｐ半固体穿刺周围扩散增长３５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用图１０㊀ＣＣ平板和ｍＣＰＣ平板创伤弧菌菌落特征图１１㊀创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ阳性样本菌体的生化鉴定结果３㊀讨论与结论本研究构建了创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的重组质粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡꎬ经测序验证后ꎬ将质粒样品真空冷冻干燥制成创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品冻干粉ꎮ对其进行均匀性和稳定性分析ꎬ检测结果均为阳性且符合目的基因片段的大小ꎬ质粒样品无降解ꎻ均匀性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品无管间差异ꎬ均匀性良好ꎻ稳定性分析定量检测结果表明ꎬ质粒定性标准样品在低温(４ħ)或高温(３７ħ)下可稳定保存１４天ꎻ在－２０ħ下长期存储１２个月ꎬ亦未观测到不稳定性ꎮ将所研制的创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品应用于１０种海鲜产品的检测ꎬ检出１份阳性样本ꎬ经传统培养法和生化鉴定验证ꎬ证实阳性样本确为创伤弧菌污染ꎬ表明质粒定性标准样品能够满足水产品中创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ的快速㊁精确检测ꎮ该研究填补了我国创伤弧菌鉴定即用型质粒定性标准样品的空白ꎬ为创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测领域的应用研究打下了良好的基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＹｕｎＮＲꎬＫｉｍＤＭ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ:ａｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｔｈｒｅａｔｔｏｐｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ[Ｊ].ＫｏｒｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉ￣ｃｉｎｅꎬ２０１８ꎬ３３(６):１０７０－１０７８.[２]㊀Ｈｅｒｎáｎｄｅ￣ＣａｂａｎｙｅｒｏＣꎬＡｍａｒｏＣ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｙａｎｄｌｉｆｅｃｙｃｌｅｏｆｔｈｅｚｏｏｎｏｔｉｃｐａｔｈｏｇｅｎＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ[Ｊ].ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ２２(１０):４１３３－４１４８.[３]㊀彭钟琴ꎬ黄璐.水产品中创伤弧菌检测方法的研究进展[Ｊ].食品安全导刊ꎬ２０２１(３６):１９０－１９２.[４]㊀ＷａｎｇＭＹꎬＨｕＣＪ.ＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｏｆＶｉｂ￣ｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅｓ[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏ￣ｅｃｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２９(１２):１４７０－１４７３.[５]㊀ＩｗａｍｏｔｏＭꎬＡｙｅｒｓＴꎬＭａｈｏｎＢＥꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｓｅａ￣ｆｏｏｄ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ[Ｊ].ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉ￣ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓꎬ２０１０ꎬ２３(２):３９９－４１１.[６]㊀ＪｏｎｅｓＭＫꎬＯｌｉｖｅｒＪＤ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ｄｉｓｅａｓｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｅｓｉｓ[Ｊ].ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙꎬ２００９ꎬ７７(５):１７２３－１７３３.[７]㊀ＨｅｎｇＳＰꎬＬｅｔｃｈｕｍａｎａｎＶꎬＤｅｎｇＣＹꎬｅｔａｌ.Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｂｕｒｄｅｎ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:９９７.[８]㊀ＨｏｒｓｅｍａｎＭＡꎬＳｕｒａｎｉＳ.ＡｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ:ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃａｕｓｅｏｆｓｅｖｅｒｅｓｅｐｓｉｓａｎｄｓｋｉｎａｎｄｓｏｆｔ￣ｔｉｓｓｕｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓ￣ｅａｓｅｓꎬ２０１１ꎬ１５(３):ｅ１５７－ｅ１６６.４５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀[９]㊀Ｂａｋｅｒ￣ＡｕｓｔｉｎＣꎬＴｒｉｎａｎｅｓＪꎬＧｏｎｚａｌｅｚ￣ＥｓｃａｌｏｎａＮꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｃｈｏｌｅｒａｖｉｂｒｉｏｓ:ｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｂａｒｏｍｅｔｅｒｏｆｃｌｉｍａｔｅｃｈａｎｇｅ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２５(１):７６－８４.[１０]ＬｉＧꎬＷａｎｇＭＹ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎｉｔｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｓｅｐｓｉｓ[Ｊ].ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０２０ꎬ６５(２):２６５－２７４.[１１]ＧａｖｉｎＨＥꎬＢｅｕｂｉｅｒＮＴꎬＳａｔｃｈｅｌｌＫＪ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒｄｏｍａｉｎｒｅ￣ｇｉｏｎｏｆｔｈｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓＭＡＲＴＸｔｏｘｉｎｃｏｎｆｅｒｓｂｉｐｈａｓｉｃｅｐｉ￣ｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎａｎｄｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｓｙｓｔｅｍｉｃｓｐｒｅａｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１７ꎬ１３(１):ｅ１００６１１９.[１２]ＲａｏＮＶꎬＳｈａｓｈｉｄｈａｒＲꎬＢａｎｄｅｋａｒＪＲ.Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎬｒｅｓｕｓｃｉｔａ￣ｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｅｓｏｆｖｉａｂｌｅｂｕｔｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｓｅａｗａｔｅｒ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ３０(８):２２０５－２２１２.[１３]包秋华ꎬ刘倩宇.基于ＷｅｂｏｆＳｃｉｅｎｃｅ细菌活的非可培养状态研究文献的可视化分析[Ｊ].食品科学ꎬ２０２３ꎬ４４(５):２４８－２５６.[１４]ＺｈａｎｇＸꎬＧｕｏＢꎬＹａｎｇＬＨꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ１２ａｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉ￣ｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓｉｎｏｎｅｔｕｂｅ[Ｊ].ＡｃｔａＢｉｏ￣ｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＳｉｎｉｃａꎬ２０２３ꎬ５５(２):３２２. [１５]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准:食品微生物学检验创伤弧菌检验:ＧＢ４７８９.４４２０２０[Ｓ].北京:中国标准出版社ꎬ２０２０.５５１㊀第１期㊀㊀㊀㊀袁玮ꎬ等:创伤弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ质粒定性标准样品的研制及其在水产品检测中的应用。

11
黄曲霉毒素B1
GB 2761
GB/T 18979
12
过氧化苯甲酰
卫生部公告〔2011〕4号
GB/T 18415
GB/T 22325
13
溴酸钾
食品整治办〔2009〕5号
GB/T 20188
14
甲醛次硫酸氢钠（以甲醛计）
食品整治办〔2008〕3号
GB/T 21126
15
玉米赤霉烯酮
GB 2761
GB/T 5009.209
所抽样品分成2份，1/2作为检验样品，1/2用于复检的备份样品（由承检机构保管）。在生产企业抽取大包装样品时，同时抽取两个空包装袋，分别与检验样品和备份样品一起封样。
抽样完成后由抽样人与被抽样单位在抽样单和封条上签字、盖章，当场封样，为保证样品的真实性，要有相应的防拆封措施，并保证封条在运输过程中不会破损。样品运输、贮存过程中应采取有效的防护措施，确保样品不被污染，不发生腐败变质，不影响后续检验。对温度等环境条件有特殊要求的产品的运输、贮存，应符合产品明示要求或产品实际需要的条件要求。
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇
GB 2761
GB/T 23503
17
二氧化钛
GB 2760
GB/T 21912
18
滑石粉
GB 2760
GB/T 21913
19
铝的残留量（以干基计）
GB 2760
GB/T 5009.182
GB/T 23374
1.5.2检验应注意的问题
1.5.2.1对总汞、总砷的检测，2016年3月21日之前分别采用GB/T 5009.17 -2003、GB/T 5009.11-2003检测；自2016年3月21日开始分别采用GB 5009.17-2014、GB 5009.11-2014检测。

国内外 标准动态
捍卫生活品质 推动产业升级
24 GB 1903.47-2020
食品安全国家标准 食品营养强化剂 乳酸亚铁
2020-09-11 2021-03-11
25 GB 1903.48-2020
食品安全国家标准 食品营养强化剂 磷酸氢镁
2020-09-11 2021-03-11
26 GB 1903.49-2020
实施日期 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11 2021-03-11
2020-09-11 2021-03-11
来源：国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局
17 GB 1886.313-2020 食品安全国家标准 食品添加剂 联苯醚（又名二苯醚）
18 GB 1886.314-2020 食品安全国家标准 食品添加剂 乙二胺四乙酸二钠钙
19 GB 1903.42-2020
食品安全国家标准 食品营养强化剂 肌醇（环己六醇）
20 GB 1903.43-2020 21 GB 1903.44-2020 22 GB 1903.45-2020 23 GB 1903.46-2020
29 GB 4789.29-2020
食品安全国家标准 食品微生物学检验 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞 菌酵米面亚种）检验
2020-09-11
2021-03-11
30 GB 4789.44-2020
食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验

《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）及《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB 2762-2017)解读发布时间：2017-04-14为不断完善我国食品中真菌毒素限量及污染物限量标准，GB 2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》及GB2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》已于2017年3月17日发布，将于2017年9月17日正式施行。

一、主要修订内容此次GB 2761及GB 2762两项污染物通用标准的修订，主要新增了葡萄酒和咖啡中赭曲霉毒素A限量、新增了螺旋藻及其制品中铅限量要求、删除了植物性食品中稀土限量要求。

此外，结合《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2011）及《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762-2012）发布实施后遇到的一些问题，兼顾与其他相关标准相协调，对两项标准文本内容做了进一步修订完善。

二、关于污染物的定义食品污染物是食品从生产（包括农作物种植、动物饲养和兽医用药）、加工、包装、贮存、运输、销售、直至食用等过程中产生的或由环境污染带入的、非有意加入的化学性危害物质。

GB2761中规定了我国食品中真菌毒素的限量要求，GB2762中规定了除农药残留、兽药残留、生物毒素和放射性物质以外的化学污染物限量要求。

我国对食品中农药残留限量、兽药残留限量、放射性物质限量另行制定相关食品安全国家标准。

三、修订原则GB2761及GB2762是食品安全通用标准，对保障食品安全、规范食品生产经营、维护公众健康具有重要意义。

标准修订工作遵照《食品安全法》及其实施条例规定，以风险评估为依据，科学合理设置污染物指标及限量，体现了以下工作原则：一是坚持《食品安全法》立法宗旨，以保障公众健康为基础，重点对我国居民健康构成较大风险的食品污染物和对居民膳食暴露量有较大影响的食品种类设置限量规定，突出安全性要求。

二是坚持以风险评估为基础，遵循国际食品法典委员会（CAC）食品中污染物标准制定原则，结合污染物监测和暴露评估，确定污染物及其在相关食品中的限量，确保科学性。

中毒
2024/9/29
现代食品微生物学
26
真菌毒素引起的食物中毒
真菌毒素一般是真菌的次级代谢产物 目前已知的毒素类型有200多种 有些毒素可以诱导基因突变和致癌， 主要是在各种农作物中污染，直接或通过动物的饲
料带到各种食品中。
黄曲霉毒素受到世界各国的广泛关注，有时还影响 到国际贸易。
全球范围内受到毒素污染的主要农作物是花生和玉 米。
现代食品微生物学
21
沙门氏菌及胃肠炎
沙门氏菌在水中能存活2-3周，粪便中可活1-2个月。 肠热症：即伤寒、副伤寒，病原体是伤寒或副伤寒杆菌。 胃肠炎（食物中毒）：是当前最常见的沙门氏菌病。主
要由于摄入被大量鼠伤寒沙门氏菌、肠炎杆菌，猪霍乱 沙门氏菌等污染的食物而引起。 败血症：多由猪霍乱沙门氏菌及丙型副伤寒杆菌引起。
现代食品微生物学
第四章 食品质量安全和 微生物的关系
可以说，微生物与人类关系的重 要性，你怎么强调都不过分，微生物 是一把十分锋利的双刃剑，它们在给 人类带来巨大利益的同时也带来"残 忍"的破坏。它给人类带来的利益不 仅是享受，而且实际上涉及到人类的 生存。
2024/9/29
现代食品微生物学
2
？ 如何保证食品的安全性
1999年收91.84％的反倾销税 。 国内40家中10家聘请了有丰富反倾销办案经验的美国律师，积极
应诉。 2000年4月,美国商务部作出终裁,我国10家应诉企业的反倾销税税
率等级分别为 ：0、8.98％ 、9.69％ 、12.03％ 、25.55％、 27.57％； 应诉企业加权平均税率为14.88％；而未应诉企业高达51.74％ 200年有4家企业获得0关税资格
产气荚膜梭菌肠毒素也是一种超级抗原，这种毒素可 以改变肠膜细胞的通透性，并使细胞具有自溶，它还 能抑制大分子的合成

40
GB 4789.43-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验微生物源酶制剂抗菌活性的测定
41
GB 4789.44-2020
食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验
第二部分其他
42
GB/T 27405-2008
实验室质量控制规范食品微生物检测
43
GB/T 23784-2009
食品微生物指标制定和应用的原则
食品卫生微生物学检验冷食菜、豆制品检验
24
GB/T 4789.24-2003
食品卫生微生物学检验糖果、糕点、蜜饯检验
25
GB/T 4789.25-2003
食品卫生微生物学检验酒类检验
26
GB 4789.26-2013
食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验
27
GB/T 4789.27-2008
食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验
15
GB 4789.15-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数
16
GB 4789.16-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定
17
GB/T 4789.17-2003
食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验
18
GB 4789.18-2010
食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验
7
GB 4789.7-2013
食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验
8
GB 4789.8-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
9
GB 4789.9-2014
食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验

其他主治系列-临床医学检验【代码：352】-微生物学和微生物学检验（二）弧菌科[单选题]1.拟态弧菌与霍乱弧菌生化特性上最重要的区别在于()A.不发酵乳糖B.不发（江南博哥）酵蔗糖C.尿素酶阴性D.不发酵L-阿拉伯糖E.硝酸盐还原阳性正确答案：B[单选题]2.O1群霍乱弧菌含A、B抗原者称为()A.小川型B.稻叶型C.彦岛型D.埃尔托生物型E.古典生物型正确答案：A参考解析：O1群霍乱弧菌，根据其菌体抗原不同，分为三个血清型：含有A、B 者为小川型，含有A、C者为稻叶型，含有A、B、C者为彦岛型。

[单选题]3.不产生肠毒素的细菌是()A.霍乱弧菌B.产毒性大肠杆菌C.幽门螺杆菌D.沙门菌E.金黄色葡萄球菌正确答案：C参考解析：霍乱弧菌、产毒性大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌都可产生肠毒素，导致消化道症状。

幽门螺杆菌不产生肠毒素，主要导致胃组织损伤。

故正确答案为C。

[单选题]4.对于O139群霍乱弧菌与O1群的比较，下述不正确的是()A.O139群的一般生物学特征与O1群ELTor型是比较相似的B.两者O抗原不同，对O抗原的免疫血清两者无交叉凝集C.O139群霍乱弧菌无鞭毛D.O139群有荚膜多糖E.O139群菌株含有与O1群相同的霍乱毒素基因正确答案：C参考解析：根据霍乱弧菌O抗原的不同，可分为156个血清群，其中O139群与O1群ELTor型很相似，但有荚膜，无O1群的脂多糖抗原，无鞭毛；两者都能与O1群血清发生凝集；霍乱肠毒素可分为两种，O1群主要产生CT1，O139型主要产生CT2。

故正确答案为C。

[单选题]5.霍乱弧菌经人工培养传代后，显微镜下观察是()A.杆状B.球形C.椭圆形D.弧形E.纤丝状正确答案：A参考解析：霍乱弧菌的形态在人工培养基上保存稍久，可失去典型弧形成为直杆状，甚至出现多形性。

[单选题]6.霍乱弧菌培养常用的选择培养基为A.中国蓝平皿B.SS平皿C.XLD平皿D.TCBS琼脂平板E.血平皿正确答案：D参考解析：霍乱弧菌培养常用的选择培养基为硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂平板。

编译说明1、2005年11月15日，欧盟委员会发布了2073/2005/EC《食品微生物标准》，并在2006年1月1日正式实施，该规章规定了严格的食品微生物指标要求，并取代了93/51/EEC规章。

适用产品范围为：肉及可食用肉类内脏、鱼及甲壳类、软体动物及其他水生无脊椎动物（但不包括活鱼）、乳制品、禽蛋、天然蜂蜜、可食用动物源性产品、可食用蔬菜、可食用水果和坚果、人造黄油、鱼类、甲壳类、软体类或其他水生无脊椎动物的肉类半成品、粮谷、面粉、淀粉或乳类半成品、蔬菜、水果、坚果半成品、软体动物可食用半成品。

2、为帮助我检验检疫人员和食品加工企业了解该技术法规，本局应对技术措施小组动植物产品及食品专业组组织编译了本规章，以供参考，但因能力有限，不到之处在所难免，请读者尽可能对照原文使用。

3、编译人员：顿玉慧、李大春、吴海、董晓慧、王忠才、宋宜国审校：顿玉慧、李大春、吴海2007年7月I（强制性法令）欧盟第2005/2073/EC号规章2005年11月15日食品微生物学标准（本文已经EEA批准）欧盟委员会：根据欧共体成立条约，根据欧洲议会、欧盟理事会第2004 / 852 / EC号规章（2004年4月29日）中关于食品卫生的规定(1)，特别是第4条第4款和第12条。

鉴于：(1) 如欧洲议会和欧盟理事会第178/2002号规章（2002年1月28日）所指出的，追求高标准地保护公众健康是食品法的基本目的之一。

该规章还确立了制定食品法、成立欧洲食品安全局以及处理食品安全事宜程序的一般原则和要求(2)。

食品中的微生物危害是人类食源性疾病的重要源头。

(2)食品中含有的微生物、微生物毒素或其代谢物的量不应给人类健康带来不能接受的危害。

(3)欧盟第2002/178 /EC号规章制定了食品安全的一般要求，依照此规章，食品若不安全就不能投放市场；万一投放，食品经营者有收回的义务。

为保护公众健康和防止误解，有必要对食品的可接受性制订统一的安全标准，尤其是针对食品中存在的某些致病菌。

食品安全及其风险分析目录一、食品安全概述 (2)1. 食品安全定义与重要性 (3)2. 食品安全现状分析 (3)3. 食品安全相关法规与标准 (4)二、食品安全风险分析 (5)1. 风险识别与评估 (7)1.1 风险识别 (7)1.2 风险评估方法及流程 (9)2. 风险预警与防范 (10)2.1 风险预警机制建立 (11)2.2 风险防范措施 (13)3. 风险管理与控制 (14)3.1 风险管理策略 (16)3.2 风险控制措施及实施效果评估 (17)三、食品安全风险领域分析 (19)1. 原料采购与加工过程风险分析 (20)2. 食品添加剂使用风险分析 (21)3. 微生物污染风险分析 (22)4. 化学性污染风险分析 (24)5. 物理性污染风险分析 (25)四、食品安全风险评估技术应用 (26)1. 风险评估技术概述 (28)2. 风险评估技术在食品安全领域的应用实例 (29)3. 风险评估技术的发展趋势 (31)五、食品安全风险应对措施与建议 (32)1. 加强食品安全法规建设 (33)2. 提高食品安全监管力度 (34)3. 加强食品安全宣传教育，提高公众食品安全意识 (35)4. 鼓励科技创新，提高食品安全水平 (36)六、总结与展望 (37)1. 当前食品安全风险总结 (38)2. 食品安全风险分析的挑战与机遇 (40)3. 未来食品安全风险分析发展趋势预测 (41)一、食品安全概述食品安全是全球公众健康的重要组成部分，关乎每个人的生命安全和身体健康。

随着食品生产和供应链的日益复杂化，以及消费者对食品来源、成分、加工方式等方面的关注度不断提高，食品安全问题已成为公众关注的焦点。

食品安全涉及到食品在生产、加工、储存、运输及销售的各个环节中可能产生的各类危害，这些危害可能源自生物因素、化学因素或物理因素。

为了保障公众的食品安全权益，我们需要全面概述食品安全及其相关风险，并进行深入的分析。

微生物检验技术中级《专业实践能力》（题库）模拟试卷一[单选题]1.普通水平电泳常用于分离()（江南博哥）。

A.大分子蛋白质B.小分子多肽C.大分子染色体DNAD.小片段染色体DNAE.脂多糖参考答案：C参考解析：大分子染色体DNA多用琼脂糖水平平板凝胶电泳进行分离。

[单选题]3.生活饮用水水质微生物检测样品的保存方法为()。

A.4℃B.37℃C.8℃D.室温E.20℃参考答案：A参考解析：生活饮用水水质微生物检测样品4℃保存，4小时内进行检验。

[单选题]4.凝胶电泳中，要使＞2kb的DNA片段分辨率最大，其电压应()。

A.＜2V/cmB.＜5V/cmC.＞5V/cmD.＜10V/cmE.＞10V/cm参考答案：B参考解析：凝胶电泳在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。

但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

要使＞2kb的DNA片段的分辨率达到最大，其电压＜5V/cm。

[单选题]5.按照我国《化妆品卫生规范》的规定，测定化妆品菌落总数时，为了便于区别化妆品中的颗粒和菌落，可在培养基中加入()。

A.DMEMB.SDSC.DTTD.TTCE.卵磷脂参考答案：D参考解析：无色的TTC（氯化三苯甲基四氮唑）作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲臜（TTF）使菌落呈现红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。

[单选题]6.按照我国《化妆品卫生规范》的规定，检测化妆品粪大肠菌群使用的培养基是()。

A.营养琼脂B.卵磷脂吐温-80营养琼脂C.伊红亚甲蓝琼脂平板D.虎红培养基E.Baird-Parker平板参考答案：C参考解析：检测化妆品粪大肠菌群使用的培养基有伊红美兰琼脂培养基、乳糖胆盐培养基、双倍浓度乳糖胆盐培养基、蛋白胨水、革兰氏染色法等。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测创伤弧菌重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种用于快速检测病原微生物的新型分子生物学方法。

它具有快速、高灵敏度、高特异性和简便操作的特点，因此在医学、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。

本文将重点介绍RPA技术在检测创伤弧菌中的应用。

创伤弧菌是一种常见的致病菌，它可以引起人类和动物的创伤性感染。

在海产品加工和贮藏过程中，创伤弧菌也可能引起食品安全问题。

对创伤弧菌的快速检测具有重要的意义。

传统的创伤弧菌检测方法主要包括细菌培养、PCR等，这些方法需要较长的时间和复杂的实验操作，限制了其在实际应用中的效果。

在RPA技术的检测过程中，选择合适的靶标基因至关重要。

通过文献调研和实验验证，发现创伤弧菌的16S rRNA基因是一种理想的靶标基因。

这一基因在不同菌株中具有高度的保守性，可以有效地区分创伤弧菌与其他细菌，在RPA技术中得到了广泛的应用。

在RPA技术中，关键的试剂是RPA核酸酶和RPA聚合酶。

RPA核酸酶能够在低温下识别和结合靶标DNA的特定区域，并在其3'-5'方向上具有核酸内切酶活性，用于切割DNA链。

RPA聚合酶则具有DNA合成酶的活性，能够在RPA核酸酶的辅助下完成对目标DNA的等温扩增。

这些试剂的优异性能使得RPA技术在创伤弧菌的快速检测中得到了成功的应用。

RPA技术还可以与便携式核酸检测设备结合，实现真正的快速检测。

这些设备体积小巧，操作简单，能够在不同的实验场景中实现对创伤弧菌的快速检测，尤其适合于海产品加工环节和食品安全监测等领域。

RPA技术在创伤弧菌的快速检测中具有重要的应用前景。

它能够快速、高效地实现对创伤弧菌的检测，具有较高的特异性和灵敏度。

随着RPA技术的不断发展和完善，相信它将在创伤弧菌的快速检测领域发挥出更大的作用，为食品安全和公共卫生做出更大的贡献。

【2000字】。

创伤弧菌快速检测法的建立徐宸;王鑫;钟江【摘要】[目的]针对创伤孤菌(Vibrio vulnificus)采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,基于单克隆斑点杂交技术进行改良,建立一种创伤弧茵快速检测方法.[方法]由水产品牡蛎中分离获得一株创伤弧菌FD-1,以其灭活全菌为抗原免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体.在此基础上,对传统斑点杂交技术进行优化改进,以化学发光试剂ECL替代传统TMB底物,进一步提高其灵敏度、缩短检测时间和简化操作步骤.[结果]与传统斑点杂交法相比,改良斑点杂交法的检测时间可缩短至2h,检测限可达1×105 CFU/mL.[结论]改良斑点杂交法比传统TMB底物斑点杂交法(1×107 CFU/mL)灵敏度提高了100倍,操作过程简单,在水产品检验和医疗诊断方面具有良好的开发应用前景.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2018(046)019【总页数】3页(P114-116)【关键词】创伤弧菌;杂交瘤技术;单克隆抗体;斑点杂交;ECL【作者】徐宸;王鑫;钟江【作者单位】复旦大学生命科学学院,上海200433;默克化工技术(上海)有限公司,上海201203;复旦大学生命科学学院,上海200433【正文语种】中文【中图分类】Q93-331创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种革兰氏阴性杆菌，是广泛存在于海洋和盐湖中的嗜盐病原菌。

它是一种重要的水产品污染病原，可造成养殖水产品的病害。

同时也是一种致命的人类机会致病菌，与全世界大部分食用污染海鲜致死的案例有关[1]。

创伤弧菌感染最致命的后果是原发性败血症，其死亡率在免疫功能低下的人群中可达50%以上[2]。

由于创伤弧菌感染的高死亡率，创伤弧菌污染严重地区海鲜食品(尤其是生蚝)的安全问题是常见的。

创伤弧菌的感染不仅给水产养殖业带来经济损失，而且也对人类健康造成危害。

我国水产品品种丰富多样，每年因食用水产品而引起食物中毒、急性胃肠炎或腹泻等疾病屡有报道。