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RP_HPLC法测定发酵液中纳他霉素含量

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文章编号:1001-8689(2004)11-0653-04RP -HPLC 法测定发酵液中纳他霉素含量骆健美1,2　金志华1,2　岑沛霖1* (1浙江大学化学工程与生物工程学系,　杭州310027;2浙江大学宁波理工学院生物与制药工程系,　宁波315100) 摘要:　目的　建立测定发酵液中纳他霉素含量的反相高效液相色谱法。

方法　发酵样品用甲醇萃取后进样。

用Hy per sil BDS C 18(5 m,4.6mm ×200mm )色谱柱分离,流动相为甲醇-水-冰乙酸(60∶40∶5,体积比),流速为1.00ml /min ,紫外检测波长302nm 。

结果　该方法的日内R SD 为0.15%(n =6),日间RSD 为0.90%(n =6);对照品浓度为92、184、368 g/ml 时,加样回收率分别为:99.84%,101.18%,101.41%。

结论　本法具有操作简单、快速测定、灵敏度高、专属性好和准确性好等优点,可有效地控制纳他霉素的质量。

关键词:　纳他霉素;　发酵液;　反相高效液相色谱法中图分类号:R 917 文献标识码:A收稿日期:2004-05-25 修回日期:2004-06-10作者简介:骆健美,女,生于1978年,在读博士研究生。

从事抗生素方面的研究。

*通讯联系人,E-mail:cenpl@ 纳他霉素(natamy cin ,又称pim ar icin )为多烯烃大环内酯类抗真菌抗生素,系褐黄孢链霉菌发酵产生[1～3]。

由于纳他霉素对真菌性角膜炎有较好的疗效,因此,国外早已将此药作为真菌性角膜炎一线治疗药物,国内该药使用很少[4]。

在纳他霉素产生菌的菌种选育和发酵工艺研究过程中,需要建立一种对纳他霉素组分和含量的快速检测方法。

目前,已报道的检测方法中,生物检定法[5]对环境因素(温度、无菌条件等)、材料因素(菌种、培养基等)、操作技术要求较高,测试过程较繁杂,并且在发酵异常时误差很大;薄层层析法[5]主要用于定性分析;紫外分光光度法多作为常规对照,若用于定量分析,对条件要求较高[5,6];HPLC 法[6～8]多集中于食品中纳他霉素残留量及高纯度纳他霉素产品的检测分析。

本文利用反相高效液相色谱法对发酵液中纳他霉素的定量测定进行了研究,获得了较为满意的结果,可作为纳他霉素的质量控制方法。

1　仪器与试药1.1　仪器UV -365紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);Ag ilent 1100高效液相色谱仪系列,包括四元泵、可变波长检测器、自动进样器和Chem Station 工作站;pH S-25数显pH 计(0.01级,上海雷磁精密仪器厂);电子天平(BP 190S M ax 200g ,d =0.1mg );0.45 m 微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂);台式离心机TDL80-2B(上海安亭科学仪器厂)。

1.2　试药 纳他霉素对照品(Sigm a 公司,纯度为95%以上)、甲醇(色谱纯,上海化学试剂研究所)、异丙醇和冰乙酸(分析纯,上海试剂一厂)、超纯水(自制)。

2　实验方法与结果2.1　色谱分析条件色谱柱:大连依利特科学仪器有限公司Hyper sil BDS C 18(5 m,4.6mm ×200mm);流动相:甲醇-水-冰乙酸(60∶40∶5,体积比);流速:1.00ml /m in ;检测波长:302nm;进样量:10 l;灵敏度:0.02AU FS;柱温:室温。

2.2　溶液的制备(1)对照品溶液　精确称取100.00mg 的纳他霉素对照品,用甲醇溶解,定容至200ml,配成浓度为500mg /L 的纳他霉素贮备液(4℃避光保存,2周后使用)。

临用时用甲醇稀释到所需浓度即得纳他霉素对照溶液,经0.45 m 微孔滤膜过滤后,滤液用于HPLC 测定。

(2)发酵液样品溶液　取1ml 纳他霉素发酵液,加入一定量的甲醇,充分振荡后,4000r /m in 离心20m in 除去链霉菌丝体,取上清液用0.45 m 微孔滤膜过滤,即得到待测液。

2.3　检测波长的确定将纳他霉素的对照品溶解于甲醇中,制备成浓度约5m g/L 的溶液,在200～400nm 的波长范围进行紫外光全波扫描(图1),从光谱图中看出,纳他霉素的最大吸收波长为302nm ,故选择302nm 作为检测波长。

图1 纳他霉素吸收光谱2.4　流动相和流速的确定文献[8]中采用乙腈-30m mol/L 高氯酸(35∶65,体积比),pH1.6作为流动相。

考虑到乙腈价格较高,流动相pH 过低,且高氯酸具有强腐蚀性等缺点,参考其他文献[6～8],分别配制不同组成的流动相进行试验,经过多次筛选,结果表明,甲醇-水-冰乙酸(60∶40∶5,体积比)的系统效果最好。

同时,对不同流速(0.80、1.00、1.20m l /min )条件下的分离情况进行研究。

与1.00ml/min 相比较,流速为0.80ml/m in 时保留时间增加,分离效果较差;流速为1.20m l/min 时保留时间缩短,但不明显,且分离效果与1.00ml /min 相差不大。

考虑到柱压的因素,因此最终选用流速为1.00ml/min 。

2.5　标准曲线的绘制用甲醇将纳他霉素对照储备液分别稀释为50.00、100.00、150.00、200.00、250.00和300.00mg /L,在上述优化的色谱条件下进样10 l 测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标作标准曲线,结果见图2。

线性回归方程为:Y =75.16X -474.07　(r =0.9998)结果表明,纳他霉素在50.00～300.00m g/L 范围内线性关系良好。

图2 纳他霉素标准曲线2.6　精密度实验同一样品,按相同进样量分别于同一天内的不同时间和不同日间(6d)进行测定,计算其日内RSD 和日间RSD,结果分别为0.15%(n =6)和0.90%(n =6)。

2.7　加样回收率实验精密量取已测知含量的发酵液样品12份,分成3组,每组添加已知量的对照品溶液,取相同体积进样(n =4)后,计算回收率和相对标准偏差,结果见表1。

表1 回收率实验浓度( g/m l)加入检出回收率(%)平均回收率(%)RSD (%)9292.1100.1191.098.91191.499.3592.9100.9899.840.91184182.999.40185.9101.03186.3101.25189.6103.04101.181.47368374.5101.77372.6101.25380.2103.32365.499.29101.411.642.8　发酵液样品测定(1)发酵液中纳他霉素提取条件的确定　分别考察了提取溶剂、提取液pH 和提取时间对发酵液中纳他霉素提取效果的影响。

根据文献报道,分别选用异丙醇[9]、甲醇[10]、甲醇-水[8](3∶1,体积比)、冰乙酸[7]、冰乙酸-水[7](5∶40,体积比)和甲醇-水-冰乙酸[7](60∶40∶5,体积比)作提取溶剂,在pH3.0～12.0,提取时间0.5～24h 的条件下进行试验,结果表明,甲醇作为提取剂时,纳他霉素的活性保存时间最长,损失最小;提取液的pH 和提取时间对提取效果影响不大。

在提取过程中,提取配比也是重要的影响因素。

从图3可知,当甲醇对发酵液的体积比从2增大到8时,提取效果显著增强,之后继续增大配比,提取效果变化不大。

故选择甲醇-发酵液=8∶1(体积比)的提取配比。

(2)标样及样品的分离色谱图　在上述优化的色谱条件下,对照品和经过处理后的发酵液样品得到充分的洗脱和分离,保留时间分别为13.898和13.903m in ,色谱图见图4。

从图中可知,在本色谱条件下,发酵液中的纳他霉素能得到很好的分离,保留时间与对照品基本一致,且无明显的干扰峰。

图3 提取配比的影响3　讨论文献[9,10]报道,当发酵液中纳他霉素的含量超过4g/L时,其在甲醇中的溶解度与提取液的pH有关。

但由于目前实验得到的摇瓶发酵水平太低,远远小于4g/L,所以,提取液pH对提取效果并无明显影响。

本实验也曾采用了美国药典[11]中测定眼药水内纳他霉素含量的RP-HPLC方法,其流动相的制备是将3.0g乙酸铵和1.0g氯化铵溶于760ml水中,混合摇匀后再加入5ml四氢呋喃和240ml乙腈。

经过对比,本法的测定结果与美国药典基本一致,实验数据见图4 对照品(a)和样品(b)色谱图表2。

但本法的色谱系统简单,操作简便、快速、试剂易得、费用低廉,适合于发酵液中纳他霉素的常规检测。

在纳他霉素产生菌的菌种选育和发酵工艺研究中,采用本法,可有效的对菌株生产能力和发酵条件进行评价,为菌株改良,发酵与分离工艺的优化,提高单位发酵液的抗生素产率和分离提取的收率提供了有效的分析分离手段。

表2 发酵液样品测定结果样品本法( g/ml)美国药典法( g/ml)167.2362.252148.09156.083218.67214.614302.54291.685449.61452.95参考文献[1]P eder sen J C.N atamy cin as a fung icide in ag ar media[J].A pp l Environ M icr obiol,1992,58:1064[2]Kiedmeier F.Z um einsat z von pima ricin zur ver hinder ungder schimmelpilz entw icklung auf lebensmit teln[J].ZL ebensm Unter s For sch,1973,151:179[3]Dav idson P M,D oan C H.N at amycin[A].In:A ntim icro bials in fo ods[M].N ew Yo r k:Basel and Ho ngK o ng.M arcel Dekker,Inc.1993:395[4]卢奕,高巧云.角膜炎诊治新概念[J].中国实用眼科杂志,1998,16:7[5]Har r y Br ik.I n A naly tical Pr ofiles of Dr ug Subst ances[M].N ew Yo rk:Academic Pr ess,1994,(10):514[6]袁亦丞.纳他霉素[J].中国食品应用化学,1997,1(3):37[7]王克利,张宣义,刘醇,等.HPL C法测定沙拉酱和干酪中纳他霉素含量方法的研究[J].中国卫生检验杂志,1998,8(6):38[8]V allv ey C.R apid ult rav iolet spectr ophot ometr ic and liquidchr omato gr aphic methods for the deter minatio n of N ata-my cin in lacto ser um mat rix[J].J A OA C I nter,2000,83(4):802[9]Bo rden G W,M aher J M,Sklavo uno s C,et al.P ro cessfo r natamycin r eco ver y[P].U S Pat:5,942,611,1999-08-24[10]Oison P T,M ills J R,Reimer M H.N atamy cin recov ery[P].U S Pat:5,591,438,1997-01-07[11]T he U nited States Pharm aco poeial Co nventio n Inc.T heU nited States P har macopo eia.X X III.[S].N at amycinDetermination of natamycin in fermentation broth by RP-HPLCLuo Jian-mei1,2,　Jin Zhi-hua1,2　and　Cen Pei-lin1 (1D epar tment o f Chemical and Biochemical Eng ineering,Z hejiang U niver sity,　Hanghzhou310027;2D epar tment o f Biolog ical a nd Phar maceutical Eng ineering,Ning bo Instit ut e of T echnolog y,Z hejiang U niver sity,　N ing bo315100)ABSTRACT　Objective　An RP-HPLC metho d fo r the determ inatio n of natamy cin in fermentation broth w as developed.　M ethods　The fermentation bro th w as extracted by m ethano l and the ex traction was analysed by HPLC.The sam ple w as separated at ro om temperature o n a Hyper sil BDS C18column(5 m, 4.6mm×200mm)eluted at a flo w r ate of1.00m l/min w ith a mobile phase of m ethanol-w ater-acetic acid(60∶40∶5, V/V/).Natam ycin w as detected and quantified by the absor bance at302nm.　Results　T he intra-day RSD and inter-day RSD were0.15%(n=6)and0.90%(n=6),respectively.T he mean recov er ies w ere99.84%, 101.18%and101.41%versus the added authentic sample at the co ncentratio ns o f92,184and368 g/m l, respectiv ely.　Co nclusion　T his method is simple,accurate,hig hly specific and reliable fo r the determination of natam ycin.KEY WORDS　Natamy cin;　Fermentation broth;　RP-HPLC(上接第644页)The effect of fish peptone and fish oil on the productivityof teicoplanin by Actinoplanes teichom yceticusXu Bo1,　Wang Ming-r ong1,　Jiang Shi-ping1,Wang Jia-w ei1,　Jiang Jin1　and　Yu Neng2 (1Sichuan Industr ial Institute of A ntibiotics,Sino-phar m Gr oup,　Chengdu610051;2Depar tment of P harmaceutics,Sichuan U niv ersit y,　Cheng du610041)ABSTRACT　T he effect o f the fish pepto ne and fish o il on the productiv ity of teicoplanin w as investigated during its batch cultivation.Addition w ith fish peptone2#and fish o il increased the y ields o f teicoplanin by 15.8%and21.0%,respectively.Orthog onal desig n method o ptimized the fermentation pared w ith the control,the productivity of teicoplanin w as incr eased by35%,up to o ver3000u/m l on the optimum medium co ntaining0.5%of fish peptone2#as w ell as0.8%of fish oil.Fur ther studies w ere observed that the increase in the productio n fro m the peptone w as corr espo nded to the higher amount of teicoplanin amino pr ecur sors w hereas the increased titer and o ptimized content ratio of teicoplanin fro m the o il w ere caused by supply ing w ith mo re saturated fatty acids.The results sugg ested that the bio synthesis of teicoplanin can be directional contr olled by adding different kinds of co rresponding structure of chemical substances.KEY WORDS　Teicoplanin;　Fish peptone;　Fish o il;　Productivity;　Content ratio。

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应用HPLC法测定果汁饮料中的纳他霉素含量

应用HPLC法测定果汁饮料中的纳他霉素含量

应用HPLC法测定果汁饮料中的纳他霉素含量作者：李夏林覃晓来源：《食品安全导刊》2012年第06期纳他霉素（Natamycin）又称游链霉素（Pimaricin），是一种多烯烃大环内酯类抗生素，能有效抑制霉菌和酵母菌的生长，阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成。

1996年我国食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准。

根据我国《食品添加剂使用标准》的规定，果蔬汁（浆）中纳他霉素的最大使用量为0.3g/kg。

本文参照《食品中纳他霉素的测定液相色谱法》，对果汁饮料中纳他霉素的测定进行了方法学考察，以供相关检测人员参考。

SHIMADZU LC-20A全自动液相色谱仪（岛津制作所），METTLER XS105DU电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；纳他霉素对照品（批号：00105、含量：89.0%，以无水物计97.0%、德国Dr、上海安普科学仪器有限公司）；统一鲜橙多（批号：2011-10-17，广州统一企业有限公司）；甲醇为色谱纯；冰乙酸为优级纯。

备溶液，备用。

（2）样品溶液的制备：精密量取鲜橙多供试样10mL,置50mL锥形瓶中，加入甲醇30mL,超声提取30min，提取液依次过0.45μm和0.22μm的滤膜，取滤液备用。

3.方法的专属性取溶剂甲醇、样品溶液、加标样品溶液与对照品溶液，按上述色谱条件，分别依法注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果：溶剂甲醇对纳他霉素测定无干扰，样品未检出纳他霉素，其内源性物质对纳他霉素测定无干扰，加标样品与对照品在相同时间位置上检出纳他霉素峰（见图1）。

4.校准曲线和检出限、定量限取2（1）项的标准储备液，甲醇分别稀释制成纳他霉素质量浓度为10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL的系列标准溶液，各取10μL，按上述色谱条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标（Y），与其对应的浓度为横坐标（X）绘制校准曲线，计算回归方程为：Y=58962X-5640，相关系数r=0.99998。

HPLC_测定食品中纳他霉素前处理条件优化

HPLC_测定食品中纳他霉素前处理条件优化

第52卷第8期 辽 宁 化 工 Vol.52，No. 8 2023年8月 Liaoning Chemical Industry August，2023HPLC测定食品中纳他霉素前处理条件优化王韵，郁蕉竹，李巧莲，刘瀛，林洋，张宏宏（沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110122）摘 要： 采用两种不同的前处理方法分别提取酸奶、糕点、果汁等食品中的纳他霉素，并使用高效液相色谱法（HPLC）测定食品中纳他霉素的含量，并对其测定结果进行分析，保证检验结果的准确性，提高检验效率。

分别按照《食品中纳他霉素的测定 液相色谱法》（GB/T 21915—2008）中标准的前处理方法和优化的前处理方法检测食品中纳他霉素的含量。

结果表明：采用两种前处理方法提取纳他霉素所得液相色谱峰均可与杂质峰完全分离，不影响准确定量，且优化的前处理方法操作简单，数据重现性更好。

关 键 词：高效液相色谱；食品；纳他霉素；前处理方法中图分类号：O657.7+2 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2023）08-1237-04纳他霉素，别名游霉素、匹马霉素，是由纳他链霉菌受控发酵制得的一种近白色或奶油黄色的结晶粉末，通常以烯醇式结构存在[1]。

它是一种无臭、无味、低剂量且安全性高的食品防腐剂，可有效延长食品的保质期，防止酵母和霉菌引起的变质。

目前在世界范围内约有30多个国家将其作为天然安全的食品防腐剂或抗菌剂使用[2-3]。

尤其是在焙烤食品中使用纳他霉素，对面团进行表面处理，延长保质期效果非常明显[4-5]。

纳他霉素是一种天然防腐剂，具有安全、健康的特点，是备受人们的青睐的微生物防腐剂[6-8]。

目前，食品中纳他霉素的检测方法为单一法检测，主要为高效液相色谱法[9-10]。

国家标准GB/T 21915—2008中规定了酸奶、糕点、果汁等不同食品的标准的前处理方法。

但是，在使用高效液相色谱法测定食品中纳他霉素含量时，发现使用标准的前处理方法处理样品时，需要对不同的食品类别，分别进行不同的处理，操作步骤较多，过程较为繁琐。

高效液相色谱法测定糕点和果汁中纳他霉素的方法学验证

高效液相色谱法测定糕点和果汁中纳他霉素的方法学验证

高效液相色谱法测定糕点和果汁中纳他霉素的方法学验证作者：卢薇周美丽来源：《食品安全导刊》2024年第03期摘要：为了验证宝鸡市食品药品检验检测中心是否有能力开展纳他霉素新方法《食品安全国家标准食品中纳他霉素的测定》（GB 5009.286—2022）的检测项目。

本文使用高效液相色谱仪，对糕点和果汁中纳他霉素进行分析，外标法定量，验证了本方法的线性关系、方法检出限、精密度和回收率。

结果表明，纳他霉素在0.5～10.0 μg·mL-1呈现良好的线性关系，方法检出限、精密度和回收率均能达到标准方法要求。

因此，本实验室具备检测纳他霉素的能力。

关键词：纳他霉素；外标法；高效液相色谱仪；方法学验证Methodological Validation of High Performance Liquid Chromatography for the Determination of Natamycin in Pastries and Fruit JuiceLU Wei， ZHOU Meili（Baoji Food and Drug Inspection and Testing Center， Baoji 721000， China）Abstract： In order to verify whether the Baoji Food and Drug Inspection and Testing Center has the ability to carry out the testing project of the new method GB 5009.286—2022 for natamycin. This article uses a high-performance liquid chromatography to analyze natamycin in pastries and fruit juice. The external standard method is used for quantification to verify the linear relationship， detection limit， precision， and recovery rate of this method. The results showed that natamycin exhibited a good linear relationship within the range from 0.5 μg·mL-1 to10 μg·mL-1， and the detection limit，precision， and recovery rate of the method can meet the requirements of the standard method. Therefore， our laboratory has the ability to detect natamycin.Keywords： natamycin; external standard method; high-performance liquid chromatography; methodology validation納他霉素，又名匹马霉素，是一种外观呈近白色或奶油黄色，无臭无味的结晶粉末，它是天然的多烯大环内酯类物质，对大部分的霉菌和酵母菌都具有极强的抑制作用[1]。

简述纳他霉素生产菌种摇瓶液的两种检测方法

简述纳他霉素生产菌种摇瓶液的两种检测方法

山　东　化　工 收稿日期：２０１９－０３－２７作者简介：李梅（１９７３—），女，福建浦城人，助理工程师，主要从事菌种的培育工作。

简述纳他霉素生产菌种摇瓶液的两种检测方法李　梅（浦城县投资开发公司，福建浦城　３５３４００）摘要：在大生产中，纳他霉素生产菌种摇瓶液的检测方法主要有生物分析法和高效液相色谱法。

纳他霉素分析干扰因素较多，生物分析法较为直观，操作不复杂，较适用于生产菌种大批量的筛选；高压液相色谱法测定的结果较为准确，一次性设备投资较大。

关键词：纳他霉素；生物分析法；高效液相色谱法中图分类号：ＴＱ４６５．９；Ｏ６５７．７＋２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０１９）１２－００７２－０１ 纳他霉素是一种无臭、无味、低剂量且安全性高的食品防腐剂。

既可以广泛有效的抑制各种霉菌，酵母菌的生长，又能抑制真菌毒素的产生，可广泛用于食品防腐保鲜以及抗真菌治疗［１－２］。

在纳他霉素产生菌的菌种选育中，需要建立一种对纳他霉素组分和含量的快速检测方法。

由于干扰纳他霉素分析的因素较多，本文主要选择生物分析法和色谱分析法。

１　纳他霉素生产菌种摇瓶液的制备（１）摇瓶种子瓶配方：玉米淀粉２％，Ｇ糖０．８％，黄豆饼粉１％；酵母粉０．８％，蛋白胨０．５％，碳酸钙０．２％。

（２）摇瓶发酵瓶配方：玉米淀粉６％，Ｇ糖０．７５％，黄豆饼粉１．７％；酵母粉１．０％，碳酸钙０．２％。

（３）纳他霉素生产斜面菌种接种入种子瓶培养１６ｈ至摇瓶液无染菌种子液颜色变黄，有挂壁菌丝后，转接入摇瓶发酵瓶培养２天下摇床进行检测。

２　纳他霉素生产菌种摇瓶液生物分析法和色谱分析法２．１　纳他霉素效价的生物检测法２．．１．１　含有摇瓶液的琼脂培养基制备吸取不同的菌号的１ｍＬ摇瓶液到琼脂培养基中倒平皿备用。

每个菌号３～５个重复。

２．１．２　制备酵母菌肉汤培养液２ｇ的酵母粉倒入２５ｍＬ的肉汤培养液中４０℃培养３０ｍｉｎ，肉眼可看肉汤培养中产生大量的气泡，肉汤变浑浊。