生物工程专业神经生物学实验指导
实验内容一：大鼠脑立体定位及帕金森病（PD）模型制作
目的要求：掌握大鼠脑立体定位仪的设计原理、基本结构、用途和正确使用；PD 模型制作要点和注意事项。
实验分组：4人/组
实验课时：5学时
实验用动物、器械和药品：
健康成年SD大鼠，体重200-250g，雌雄不拘；脑立体定位仪、水平仪、电吹风；麻醉药（0.4%戊巴比妥钠：戊巴比妥钠0.4 g，生理盐水100 ml）；碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水；5或10ul微量注射器；手术器械，如手术刀、镊、止血钳等；大鼠脑立体定位图谱；6-羟基多巴胺（6-OHDA）溶液（按3ug/ul 配制，加Vc，即6-OHDA溶液1ml：将6-OHDA3mg，VitC0.2mg，溶于灭菌生理盐水，在1.5ml离心管中定容至1ml，分装后-20℃保存）。实验操作及注意点：
1．根据老师的讲解和指导，认识脑立体定位仪主要部件，即主框、电极移动架及动物头部固定装置（即固定上颌的结构和耳杆与耳杆固定柱）及用途。
2．脑立体定位仪的调试:摆稳定位仪，用水平仪测水平。检验电极移动架上各个轴向滑尺是否保持互相垂直，微量注射器针尖是否光滑垂直。检查定
位仪各衔接部位的螺丝有无松动。检查头部固定装置两侧是否对称。检查
耳杆使两耳杆尖端相对,以此判定耳杆固定的准确程度。然后,使两耳杆尖
端相对间隔1～2 mm ,前后移动固定有注射器的注射装置纵轴,使注射器的
针体向后移时,恰好通过两耳杆尖端之间的1～2 mm 间隙; 向前移时,恰
好与切牙固定架的正中刻线在一条直线上。
3．大鼠称重并麻醉（腹腔注射戊巴比妥钠，40mg/kg），动物麻醉不可过深或过浅，注意呼吸情况。抓取大鼠时要轻柔，防止抓咬伤。
4．鼠颅的固定:将麻醉大鼠置于脑立体定位仪上，鼠颅依靠两耳杆及切牙钩三点固定。在向外耳道内插入耳杆时,鼠眼球向外凸出。一旦进入鼓膜环
沟内,穿破鼓膜,则会发出轻微的“嘭”声,同时出现眨眼反射,眼球不再凸出,
说明耳杆进位正确。固定左、右侧耳杆,拧紧耳杆固定旋钮。接着,用定位仪上的切牙钩,钩住大鼠的切牙,要钩至切牙根部,并固定之。鼠颅前固定点的正确与否,决定着鼠颅固定是否合适。脑立体定位仪坐标“0”点的测得:按照Paxinos 大鼠脑立体定位图谱，以颅骨前囟即冠矢点作为前后方向的“0”参照点，当微量注射器的针尖对准冠矢点时,读取立体定位仪三维坐标上标尺的数值，此数值即是“0”点坐标。
6．选定靶点:在大鼠颅顶剪毛备皮，置洞巾，碘酒、酒精消毒，纵向切开头皮,用止血钳将皮肤左右分开，暴露手术视野，以刀片刮去颅盖骨膜，注意止血。将冠矢点定为“0”点，对照大鼠脑立体定位图谱，计算出所定位AP、ML、DV三个方向的坐标值(零点坐标值与靶位坐标值相加)。
7．根据所选定制作PD模型注射靶点，用记号笔在颅骨表面作好标记，用手术刀尖旋转钻孔。用微量注射器向一侧黑质致密部（SNC：AP-4.8；ML1.8；DV8.3）；和中脑腹侧被盖区（VTA：AP-4.8；ML1.0；DV8.3；DV注意加上颅骨、脑膜及其之间间隙的厚度，一般在1mm）各注射9ug/3ul6-OHDA 溶液（6-OHDA溶液最好新鲜配制，并加入抗氧化剂，如Vc）。注意推药时用指头轻轻缓慢触推（0.5ul / min，停留1分钟），约10分钟将药推完，缓慢退针0.5 mm，留针1min，然后按 2.0mm／min速度缓慢拔针，退出微量注射器，并将微量注射器用蒸馏水冲洗干净凉干。
7．用手术线缝合皮肤，并用酒精棉球擦拭消毒。松动并退出耳杆和门齿杆，轻轻取下动物置于鼠笼内，单独放置，侧卧，观察呼吸，注意保温。8．认真记录实验全过程。
实验内容二：大鼠灌流取脑及鼠脑大体解剖学观察
目的要求：掌握大鼠灌流取脑的基本程序和要求、操作要点和注意事项；正确辨别鼠脑的分部及各部分形态结构特点。
实验分组：4人/组
实验课时：5学时
实验用动物器械和药品：
大鼠200-250g，雌雄不拘；阿朴吗啡（APO）溶液100ml（APO2.5mg，灭菌生理盐水100ml，4℃保存）；麻醉药，如戊巴比妥钠（配制及剂量同前）；生理盐水；4%多聚甲醛溶液（PFA）或30%福尔马林；蒸馏水；输液架；灌流用方盘；灌流胶管及针头；手术器械，如手术刀、镊、止血钳、小型咬骨钳等；广口玻璃瓶（容积50或100ml，用于盛放后固定脑）。
实验操作及注意点：
1．将上周制作的PD模型大鼠腹腔内注射阿朴吗啡（APO）溶液（0.25mg/kg），诱导动物向健侧旋转，筛选出30分钟内旋转超过210次（7圈/分）者为
成功PD大鼠模型。
2．将PD模型大鼠或正常大鼠称重并深麻（麻醉方法同前，但剂量加大），抓取大鼠时要轻柔，防止抓咬伤。
3．将深麻大鼠仰面朝天平放在灌流用方盘内，用刀沿左侧肋弓下缘、胸骨右缘外侧及左侧腋前线纵行切开，除去皮肤和肌肉等并剪断肋骨，暴露心脏。
4．在心尖部剪一小口，将灌流用针头自心尖小口处插入（稍偏右，针尖要钝而光滑），一直插入升主动脉，注意不要用力过猛而刺破主动脉壁，并在
动脉外用丝线结扎固定，防止针头滑脱。
5．放开灌流夹，紧接着在右心房剪一小口放流静脉血，快速灌流150ml生理盐水（约3-5分钟）。
6．注意观察大鼠唇部变苍白，即可改灌10%福尔马林400ml，先快后慢（约40-60分钟），头部位置稍低，一旦大鼠出现抽搐，用手轻轻固定拉伸头尾，以防动物躯体变形，不利于取脑。
7．断头，前入路或后入路（按老师示范的方法操作）取脑并用蒸馏水冲洗干
净，置于装有灌流固定液的50或100ml广口玻璃瓶内。
8．将脑从固定液中取出，用蒸馏水冲洗干净，置于方盘中，脑下面垫一干净白纱布。用眼科镊小心剔除脑表面脑膜及血管等，从不同的面观察脑的全貌及各部分。
9．逐一解剖分离脑的各部分（按老师示范的方法操作），并仔细观察各部分结构特点。
10．认真记录实验全过程。
