内毒素含量测定方法

1 细菌内毒素检查SOP（动态浊度法）

1．目的

为规范细菌内毒素含量测定的操作，特制定本SOP。

2． 范围

本SOP适用于细菌内毒素含量测定的操作。

3． 定义

3.1.动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

3.2.细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

3.3.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

3.4.细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015 EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。

4． 职责

4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。

4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。

4.3.质量负责人/质量受权人负责本规程的批准。

4.4.QA负责本规程执行的监督。

5．引用标准

《中华人民共和国药典》2020年版三部。

6．材料

6.1.仪器设备

细菌内毒素测定仪、漩涡混合器、干烤箱

6.2.试剂及溶液

6.2.1.鲎试剂

6.2.2.细菌内毒素工作标准品：国家标准品或经过国家标准品标定的工作标准品。

6.2.3.细菌内毒素检查用水：内毒素含量应小于0.005EU/ml。

6.3.使用的器具

移液器、无热原稀释管和反应管、无热原枪头。

7．流程图

无

8．程序

8.1.原理

细菌内毒素能激活鲎试剂(TAL)中的酶系统，使凝固酶原变成凝固酶，进而凝固酶再激活其中的凝固蛋白原变成凝固蛋白，呈现凝胶反应，动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，计算内毒素浓度与反应时间关系的双对数标准曲线，利用标准曲线对供试品的内毒素含量进行定量测定。

8.2.试验前准备

硝酸盐测定

1 原理

样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，或加入镉粉，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N－1萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。

2 试剂

2.1 氯化铵缓冲溶液(pH9.6～9.7)：同2.1。

2.2 硫酸镉溶液(0.14mol/L)：称取37g硫酸镉(CdSO4·8H2O)，用水溶解，定容至1L。

2.3 盐酸溶液(0.1mol/L)：吸取8.4mL盐酸，用水稀释至1L。

2.4 硝酸钠标准溶液：准确称取500.0mg于110～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于500mL容量瓶中，加50mL氯化铵缓冲液，用水稀释至刻度，混匀，在4℃冰箱中避光保存。此溶液每毫升相当于1mg硝酸钠。

2.5 硝酸钠标准使用液：临用时吸取硝酸钠标准溶液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，临用时现配。此溶液每毫升相当于10μg硝酸钠。

2.6 亚硝酸钠标准使用液同2.8。

2.7 镉柱：

2.7.1 镉粉还原效率的测定：镉粉使用前，经盐酸浸泡活化处理，再以水洗两次，用水浸没待用。用牛角勺将镉粉加入25mL带塞刻度试管中，至5mL刻度；用少量水封住。吸取2.0mL硝酸钠标准使用液，加入5mL氯化铵缓冲液。盖上试管塞，振摇2min，静止5min，用漏斗颈部塞有少量脱脂棉的小漏斗过滤，滤液定量收集于50mL容量瓶中，用15mL水少量多次地洗涤镉粉，洗液与滤液合并。加5mL乙酸(60%)后，立即加10mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，暗处置25min。用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于550nm波长处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率。

2.7.2 计算

式中：X2——还原效率，%；

20——硝酸盐的质量，μg；

铁含量的测定方法

铁含量的测定采用邻菲啰啉比色法。

一、原理

在一定酸度条件下，试液中亚铁离子（Fe2+）与1,10-邻菲啰啉生成红色配合物，于波长为506nm处，测定其吸光度，即可计算出铁含量。

二、试剂和仪器

柠檬酸三钠水溶液，150g/L；盐酸羟胺溶液，50 g/L；盐酸溶液，3mol/L；氨水溶液，2.5%；

1,1 0-邻菲啰啉溶液，2.5 g/L：称量2.5g1, 10-邻菲啰啉溶于80℃的约l00ml水中，加lml浓盐酸，冷却后加水稀释至1000ml，储于阴凉处备用；

醋酸-醋酸钠缓冲溶液：称量272g醋酸钠（NaCH3·CO2·3H2O）于约500m1水中，加入冰醋酸240ml，加水稀释至1000ml；

Fe2+标准溶液，lmg/ml：称量7.024g硫酸亚铁铵于约500ml水中，加入浓盐酸10ml，移入l000ml容量瓶中，稀释至刻度；

Fe2+标准溶液，20ųg/ml：吸取lmg/ml的亚铁标准溶液20ml于1000ml容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，临用前配制。

仪器：分光光度计；1cm比色皿。

三、测定步骤

（一）工作曲线的绘制

量取20ųg/ml的亚铁标准溶液0.00m1、2 .50m1、5 .00ml、10.00ml、20.00ml(相当于分别含0、50、100、200、400ųg/ Fe2+)分别加入l00ml烧杯中，用水稀释至50ml，加入150g/L柠檬酸三钠溶液5m1，用3mol/L盐酸或2.5%氨水溶液调节溶液pH为2.4~2.6，加入50 g/L盐酸羟胺溶液5ml混匀，加入 1,10-邻菲罗琳溶液5m1，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液l0ml，将溶液移入到l00 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀放置60min。

用分光光度计在波长506nm处用lcm比色皿，以水为参比溶液测定该标准系列的吸光度，以Fe2+标准溶液浓度（ųg/100ml）为横坐标，以其对应吸光度作纵坐标绘制工作曲线。

咨询回答：（一）

二氧化氯含量测定方法

目前国内外有关二氧化氯（以下均简称为“ClO2”）含量测定方法的研究及应用种类较多，如碘量法、电流滴定法、紫线一分光光度、色谱法……等，但国内应用较多的仍然以碘量法及改进碘量法为主，如美国《水及废水检验标准方法》，丙二酸碘量法，五步碘量法，三步碘量法等。

现将碘量法简介如下：

1、一般碘量法：是国际早期根据美国《水及废水检验标准方法》规定作为二氧化氯有效含量测定方法，其操作方法与有效氯测定方法完全相同，只是在是在计算时，将有效氯计算系数换成ClO2系数而已，因此该法所测量的是Cl2、ClO2、ClO2－、ClO3－……等各种成分氧化能力的总和，不能证明其产品真正ClO2含量。

2、丙二酸碘量法：是卫生部《消毒技术规范》2001年版规定，目的是将ClO2样品中的Cl2用丙二酸掩蔽，消除Cl2对ClO2有效含量测定时的干扰，然后用碘量法进行测定，其结果ClO2含量中仍为ClO2、ClO2－、ClO3－三种成分的总和，也不能完全证明ClO2真正含量。

3、五步碘量法：是卫生部《消毒技术规范》2002年修订版规定法，也是目前国际公认及通用的一种方法，其原理是根据ClO2产出的ClO2、 Cl2、 ClO2－、 ClO3－等成分在不同酸碱条件下形成不同状态而设计的一种方法，例如字PH=7时，有1/5

ClO2及ClO2—存在，而在PH=2-3时，ClO2及Cl2则可完全转为Cl－状态存在。ClO2溶液中的ClO2可用高纯氮气或空气可以完全吹脱等原理进行的，因此通过此法可将产品中的ClO2、 Cl2、ClO2－、ClO3－完全分开，所测结果才能真正反映ClO2实际含量。（其操作方法请参考卫生部《消毒技术规范》2002版）

但经近几年各地实际应用经验有以下几点操作注意事项：

A．工业ClO2产品的ClO2溶液中，除ClO2外，常伴有一定数量的Cl2，是难以完全避免的。因活化时，多采用过量酸而引起的，否则不能迅速完全活化。