内毒素检测方法

医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法

中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布

一、 定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。

二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。

三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。

2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。

3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。

4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。

四、试验前准备

1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。

2、鲎试剂灵敏度测定

（1） 试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。

（2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。

五、试验方法

1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。

2、浸提介质:无热原水。

3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。

医疗用品中内毒素检测标准

一、检测方法

医疗用品中的内毒素检测应采用鲎试剂法。鲎试剂法是一种利用鲎血变形细胞溶解物与内毒素产生凝集反应的检测方法，具有灵敏度高、特异性强的特点。

二、灵敏度要求

内毒素检测的灵敏度要求应达到0.1 EU/ml或更低。这意味着在每毫升医疗用品中，内毒素的含量应不超过0.1 EU。

三、准确性要求

内毒素检测的准确性要求较高，误差率应不超过±20%。同时，应采用已知浓度的标准品对检测方法进行校正，以保证检测结果的准确性。

四、特异性要求

内毒素检测应具有良好的特异性，避免与其他物质发生交叉反应。对于医疗用品中可能存在的其他成分，应在检测时进行特异性验证，以确保结果的可靠性。

五、重复性要求

内毒素检测的重复性要求较高，应采用多份样品进行平行试验，并计算变异系数（CV）。CV值应不超过20%，以保证检测结果的稳定性和可重复性。

六、线性范围

内毒素检测的线性范围应满足医疗用品中内毒素含量的要求。线性范围的下限应达到灵敏度要求，上限应根据实际需要确定，一般可达到10 EU/ml或更高。

七、稳定性要求

内毒素检测试剂的稳定性要求较高，应在规定的有效期内使用。同时，应定期对试剂进行质量检查，以保证检测结果的可靠性。

八、操作简便性

内毒素检测的操作应简便易行，不需要特殊设备和技能。在操作过程中，应严格按照说明书进行操作，避免误差和偏差。

九、试剂安全性

内毒素检测试剂应安全可靠，不会对操作者和环境造成危害。同时，试剂的储存和运输也应注意安全问题，防止意外事故的发生。

十、符合国家相关法规和标准

医疗用品中内毒素检测标准应符合国家相关法规和标准的要求。具体来说，应遵循国家食品药品监督管理总局发布的《医疗器械注册管理办法》、《医疗器械监督管理条例》等法规的要求，以及国家标准化管理委员会发布的相关标准。同时，还应关注国际上的相关法规和标准，以便与国际接轨。

中国药典内毒素检测方法

内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖组分，只有在细菌死亡裂解后才被释放出来。内毒素对人体细胞产生的危害较小，但可刺激机体产生非特异性炎症反应，如微循环障碍、寒战、发热、血栓形成等。因此，内毒素的检测对于药品质量控制具有重要意义。本文将介绍中国药典中规定的内毒素检测方法，包括凝胶法、动态浊度法和终点显色法等。

一、凝胶法

凝胶法是一种经典的内毒素检测方法，具有操作简便、快速、经济等优点。该方法的基本原理是根据内毒素与限量革兰阴性菌细胞中的脂多糖抗原起反应而产生凝集现象。

操作步骤如下：

1.将稀释的内毒素样品与标准品同时加入凝胶反应管中，摇匀。

2.将反应管放入37℃恒温器中，保温30分钟。

3.观察反应结果，记录凝集情况。

凝胶法适用于注射剂、滴眼剂等药品的内毒素检测，但不适用于供局部用药的制剂。该方法的准确性和灵敏度相对较低，但可满足一般药品制剂的质量控制要求。

二、动态浊度法

动态浊度法是一种较灵敏的内毒素检测方法，适用于各类注射剂、输液等药品的内毒素检测。该方法的基本原理是根据内毒素在试管中产生的浊度变化来计算内毒素含量。

操作步骤如下：

1.将稀释的内毒素样品与标准品分别加入动态浊度反应管中。

2.将反应管放入37℃恒温器中，保温30分钟。

3.观察浊度变化情况，记录反应终点时的时间和吸光度值。

4.根据吸光度值计算内毒素含量。

动态浊度法具有操作简便、快速、准确性和灵敏度高等优点，可满足高精度内毒素检测的需求。但需要注意的是，该方法易受到杂质、样品颜色等因素的影响，因此需进行空白校正和标准曲线绘制等操作以提高准确性。

三、终点显色法

终点显色法是一种高灵敏度的内毒素检测方法，适用于各类药品制剂的内毒素检测。该方法的基本原理是根据内毒素与限量革兰阴性菌细胞中的脂多糖抗原起反应而产生颜色变化来计算内毒素含量。

操作步骤如下：

1.将稀释的内毒素样品与标准品分别加入终点显色反应管中。

2005年版中国药典 《细菌内毒素检查法》

来源--中华人民共和国药典2005年版 附录Ⅺ E

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。

凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。定量测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分钟，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。

供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0-8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

内毒素限值的建立 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

L=K/M