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酵母双杂交系统及其应用研究进展作者：崔红军魏玉清来源：《安徽农业科学》2015年第13期摘要酵母双杂交系统作为一种有效研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，具有真实、高效、敏感、广泛的特点，被广泛应用于诸如蛋白质组学、基因组学等领域。
主要对酵母双杂交技术的原理、特点及应用现状进行了综述。
关键词酵母双杂交系统；蛋白质相互作用；应用中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-045-03Abstract The yeast two hybrid system， as a kind of effective molecular biology method for studies of protein interactions， is real， effective， sensitive， and popular， which is widely used in proteomics， genomics and other fields. The principle， characteristics and application status of yeast two hybrid technology were reviewed.Key words Yeast two hybrid system； Proteinprotein interaction； Application蛋白质是细胞中的实际功能分子，具有负责细胞生物化学活性的功能，随着生物化学和分子生物学研究技术和手段的不断深入，蛋白质分子间的相互作用作为蛋白质组学研究的主要内容之一已成为近年来的研究热点。
蛋白质互作不但能够提供蛋白质本身功能的信息，而且能够提供蛋白质在代谢调控、信号传导和复合体中起作用的信息[1]。
筛选、分析蛋白质互作的方法有很多种，主要包括生物化学法，如共纯化、亲和纯化和免疫共沉淀，质谱技术，离子体共振技术，生物物理技术，噬菌体展示技术和酵母双杂交技术等[2]。
㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(３１３７０２０７)㊀作者简介:王磊㊀男ꎬ硕士ꎬ副主任技师ꎮ主要从事医学检验工作ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓ＿ｗａｎｇｌｅｉ＠１６３.ｃｏｍ㊀∗通讯作者ꎮ男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ硕士生导师ꎮ主要从事病原体的致病性和致病机制研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｅｎｇｙｉｈｕａ２１ｃｎ＠１２６.ｃｏｍ㊀收稿日期:２０１８￣１０￣０４利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)相互作用的宿主蛋白王㊀磊１ꎬ２ꎬ李冉辉１ꎬ邓湘赢１ꎬ戴㊀佩１ꎬ李玲玲１ꎬ罗㊀丹１ꎬ曾焱华１∗(１.南华大学病原生物学研究所特殊病原体防控湖南省重点实验室湖南省分子靶标新药研究协同创新中心ꎬ湖南衡阳㊀４２１００１ꎻ２.邵阳市中心医院ꎬ湖南邵阳㊀４２２０００)摘㊀要㊀从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库中筛选生殖支原体(Ｍｇ)黏附蛋白(ＭｇＰａ)的互作蛋白ꎮ以ｐＥＴ３０ａ￣ＭｇＰａ为模板ꎬ经ＰＣＲ扩增ＭｇＰａ基因ꎬ将其分别连接到ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ载体以构建诱饵质粒ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ和ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａꎻ将诱饵质粒分别转化到酵母菌株ＮＭＹ３２内ꎬ检测其毒性和自激活活性ꎻ将人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库质粒ｐＰＲ３￣Ｎ￣２０７￣Ｚｅｎｇ转入到含ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ诱饵质粒的酵母菌株中ꎬ筛选阳性克隆ꎮ检测阳性克隆ＬａｃＺ报告基因的活性ꎮ提取阳性克隆质粒进行ＤＮＡ测序与ＢＬＡＳＴ分析ꎮ结果显示ꎬ成功构建的诱饵质粒ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ和ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ两者都没有自激活功能ꎬ且ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的活性强于ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａꎮ用ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ转化ＮＭＹ３２酵母作为受体酵母细胞ꎮ经ＤＮＡ测序与ＢＬＡＳＴ分析结果表明筛选到的２８个阳性克隆归属于２３个不同的蛋白ꎮ从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库中筛选到２３个与ＭｇＰａ相互作用的蛋白ꎬ为阐明ＭｇＰａ的功能及Ｍｇ可能的致病机制提供参考ꎮ关键词㊀生殖支原体ꎻ黏附蛋白ꎻ酵母双杂交ꎻｃＤＮＡ文库中图分类号㊀Ｑ９３－３ꎻＲ３７５＋３㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀１００５－７０２１(２０１９)０２－００３８－０６ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００５－７０２１.２０１９.０２.００６ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＨｏｓｔＰｒｏｔｅｉｎｓＩｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍＡｄｈｅｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎｏｆＵｓｉｎｇＹｅａｓｔＤｏｕｂｌｅ￣ＨｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍＷＡＮＧＬｅｉ１ꎬ２ꎬＬＩＲａｎ￣ｈｕｉ１ꎬＤＥＮＧＸｉａｎｇ￣ｙｉｎｇ１ꎬＤＡＩＰｅｉ１ꎬＬＩＬｉｎｇ￣ｌｉｎｇ１ꎬＬＵＯＤａｎ１ꎬＺＥＮＧＹａｎ￣ｈｕａ１(１.Ｉｎｓｔ.ｏｆＰａｔｈｏｇ.ＢｉｏｌｏｇｙꎬＵｎｉ.ｏｆＳ.ＣｈｉｎａꎬＨｕｎａｎＰｒｏｖ.ＫｅｙＬａｂ.ｆｏｒＳｐｅｃｉａｌＰａｔｈｏｇ.Ｐｒｅｖｅｎｔ.＆Ｃｔｒｌ.ꎬＨｕｎａｎＰｒｏｖ.Ｃｏｏｐｅｒａｔ.ＩｎｎｏｖａｔᶄｎＣｔｒ.ｏｆＭｏｌ.ＴａｒｇｅｔＮｅｗＤｒｕｇＳｔｕｄｙꎬＨｅｎｇｙａｎｇ４２１００１ꎻ２.ＳｈａｏｙａｎｇＣｉｔｙＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐ.ꎬＳｈａｏｙａｎｇ４２２０００)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ(ＭｇＰａ)ｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｉｅｎｙｅａｓｔｄｏｕｂｌｅ￣ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ.ＴｈｅＭｇＰａｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈＰＣＲｕｓｉｎｇｐＥＴ３０ａ￣ＭｇＰａａｓｔｅｍｐｌａｔｅａｎｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｌｉｇａ￣ｔｅｄｗｉｔｈｐＢＴ３ＳＴＥａｎｄｐＢＴ３ＳＵＣｖｅｃｔｏｒｓｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｂａｉｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａａｎｄｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａꎻｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎＮＭＹ３２ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｔｈｅｉｒｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.ＴｈｅｈｕｍａｎｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｐｌａｓｍｉｄｐＰＲ３￣Ｎ￣２０７￣ＺｅｎｇｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｔｈｅｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａｂａｉｔｐｌａｓｍｉｄａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄ.ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅＬａｃＺｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓ.ＴｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｆｏｒＤＮＡａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｂｙＢＬＡＳＴ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂａｉｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａａｎｄｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬｂｏｔｈｈａｄｎｏｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｉｅｓꎬａｎｄｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｎｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ.ＴｈｅｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＮＭＹ３２ｙｅａｓｔａｎｄｕｓｅｄａｓｒｅｃｅｐｔｏｒｏｆｙｅａｓｔｃｅｌｌ.Ａｔｏｔａｌｏｆ２８ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄＢＬＡＳＴａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｃｌｏｎｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏ２３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ.Ｉｔｗａｓｃｏｎ￣ｃｌｕｄｅｄｔｈａｔ２３ｋｉｎｄｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＭｇＰａｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｉｅｎｙｅａｓｔｄｏｕｂｌｅ￣ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍꎬａｎｄｔｈｕｓｌａｉｄａ８３微生物学杂志㊀２０１９年４月第３９卷第２期㊀ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＡｐｒ.２０１９Ｖｏｌ.３９Ｎｏ.２ｃｅｒｔａｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｔｏｅｎｕｎｃｉａｔｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＭｇＰａａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＭ.ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍꎻａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎꎻｙｅａｓｔｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍꎻｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ㊀㊀生殖支原体(ＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍꎬＭｇ)是一种基因组最小且能在无生命培养基中生长繁殖ꎬ同时与尿道炎㊁盆腔炎㊁不孕不育和宫颈炎等多种疾病密切相关的原核细胞型微生物[１￣５]ꎮ由于Ｍｇ生长缓慢ꎬ分离培养难度大ꎬ导致其致病机制尚未完全阐明ꎬ因此ꎬ开展Ｍｇ的致病机制研究对预防和控制Ｍｇ感染具有重要意义ꎮＭｇ没有细胞壁ꎬ但具有特殊的㊁呈烧瓶状的尖端结构ꎮＭｇ主要通过其尖端结构黏附或侵入宿主细胞ꎬ从而引起宿主的感染[２]ꎮ研究表明ꎬ位于尖端结构的生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)的羧基端在Ｍｇ的黏附与感染中起关键作用[６￣７]ꎮ然而ꎬ迄今为止尚不清楚ＭｇＰａ通过和宿主细胞膜上哪些蛋白发生相互作用ꎬ从而导致其黏附或侵入细胞引起宿主感染ꎮ本课题组在前期研究中ꎬ以重组ＭｇＰａ为靶分子ꎬ从人尿道上皮细胞Ｔ７噬菌体展示ｃＤＮＡ文库中筛选到ＭｇＰａ互作蛋白 ＲＰＬ３５[８]ꎻ本研究拟构建ＭｇＰａ的酵母诱饵载体ꎬ从人尿道上皮细胞(ＳＶ￣ＨＵＣ￣１)酵母双杂交ｃＤＮＡ文库筛选能与Ｍｇ￣Ｐａ发生相互作用的宿主蛋白ꎬ为进一步研究ＭｇＰａ的功能及其在Ｍｇ致病中的作用机制提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀质粒与质粒提取试剂盒㊀重组质粒ｐＥＴ￣３０ａ(＋)￣ＭｇＰａ由课题组前期制备并保存[９]ꎻ人尿道上皮细胞(ＳＶ￣ＨＵＣ￣１)酵母双杂交ｃＤＮＡ文库质粒ｐＰＲ３￣Ｎ￣２０７￣Ｚｅｎｇ委托上海海科生物技术有限公司制备ꎻ膜蛋白酵母双杂交系统(ＤＵＡＬｍｅｍ￣ｂｒａｎｅｓｔａｒｔｅｒｋｉｔ)和诱饵载体ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ为瑞士ＤｕａｌｓｙｓｔｅｍｓＢｉｏｔｅｃｈＡＧ公司产品ꎮＤＮＡ回收试剂盒和大肠埃希菌质粒提取试剂盒为Ｏｍｅｇａ公司产品ꎻ酵母质粒提取试剂盒购自索莱宝公司ꎮ１.１.２㊀培养基(％ꎬ质量分数)㊀大肠埃希菌培养基(ＬＢ):酵母提取液０ ５ꎬ蛋白胨１ꎬＮａＣｌ１ꎬｐＨ调至７ ０ꎻ酵母完全培养基(ＹＰＤＡ):酵母提取液１ꎬ胰蛋白胨２ꎬ葡萄糖２ꎬ腺嘌呤０ ０２％ꎻ酵母缺陷筛选培养基参照ＤＵＡＬｓｙｓｔｅｍ公司的ＤＵＡＬｍｅｍ￣ｂｒａｎｅｓｔａｒｔｅｒｋｉｔｓ说明书配制ꎮ１.１.３㊀酶㊀高保真ＤＮＡ聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司ꎻ限制性内切酶ｓｆｉＩ购自Ｆｅｒ￣ｍｅｎｔａｓ公司ꎻＤＮＡ连接酶ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ购自ＴＯＹＯＢＯ公司ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀诱饵载体构建㊀以ｐＥＴ￣３０ａ(＋)￣ＭｇＰａ为模板ꎬ利用合成好的引物(ＭｇＰａ￣Ｆ:５ᶄ￣ＡＡＧＧＣ￣ＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＣＣＴＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＣＣ￣３ᶄꎬＭｇＰａ￣Ｒ:５ᶄ￣ＣＣＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣ￣ＴＡＴＡＧＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧＧ￣３')扩增目的片段并回收ꎮ将回收到的片段和诱饵载体质粒ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ使用ＳｆｉＩ进行酶切(３７ħ㊁５ｈ)并回收ꎮ将回收后的目的片段分别与ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ载体连接ꎬ将连接产物转化已制备好的大肠埃希菌感受态ꎮ随机挑取４个大肠埃希菌转化子ꎬ接种于含卡那霉素的液体ＬＢ培养基ꎬ３７ħ㊁２５０ｒ/ｍｉｎ振荡培养１６ｈ后进行ＰＣＲ扩增(Ｆ引物:５ᶄ￣ＴＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＣＴＧ￣３ᶄꎬＲ引物:５ᶄ￣ＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴ￣３ᶄ)ꎬ以对诱饵质粒进行鉴定ꎬ各选取１个阳性克隆进行质粒抽提ꎬ然后测序并对测序结果进行ＢＬＡＳＴ比对ꎮ１.２.２㊀酵母转化㊀从ＹＰＤＡ平板挑取ＮＭＹ３２单菌落接种于４ｍＬＹＰＤＡ液体培养基中ꎬ３０ħꎬ２２５ｒ/ｍｉｎ振荡培养１８~２０ｈ至ＯＤ６００>１.５ꎻ转接于５０ｍＬＹＰＤＡ液体培养基ꎬ使初始ＯＤ６００约为０.２ꎬ振荡培养４~５ｈꎬ至ＯＤ６００＝０.６ꎻ离心收菌(４０００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎻ依次用２０ｍＬ无菌水㊁５ｍＬ０.１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ㊁５００μＬ０.１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ重悬菌体ꎬ混匀后分装至１.５ｍＬ离心管ꎬ每管５０μＬꎻ再依次加入５０％ＰＥＧ￣３３５０２４０μＬ㊁１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ３６μＬ㊁ｓｓＤＮＡ(２０ｍｇ/ｍＬ)５μＬ㊁质粒ＤＮＡ５μＬꎬ剧烈振荡１ｍｉｎ左右ꎬ至完全混匀ꎮ３０ħ水浴孵育３０ｍｉｎꎬ４２ħ水浴孵育２５ｍｉｎꎬ３０ħ水浴孵育３０ｍｉｎꎬ离心收菌ꎮ用３００μＬ无菌水悬浮菌体ꎬ温和混匀ꎬ涂布在相应的缺陷型筛选平板上ꎬ３０ħ恒温培养４ｄꎮ１.２.３㊀文库筛选与转化㊀从ＳＤ￣Ｌ平板上挑取单克隆菌落接种于ＳＤ￣Ｌ培养基５０ｍＬꎬ振荡培养１８ｈ后转接于５００ｍＬＹＰＤＡ液体培养基中ꎬ使初始ＯＤ６００约为０.２ꎬ振荡培养４~５ｈ至ＯＤ６００＝０.６ꎻ离心收菌(４０００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)后依次用３０ｍＬ无菌水㊁２０ｍＬ０.１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ㊁１０ｍＬ０.１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ重悬菌体ꎬ混匀后离心收菌(４０００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎬ弃上清ꎻ向离心管中依次加入５０％ＰＥＧ￣３３５０９.６ｍＬ㊁１ｍｏｌ/ＬＬｉＡｃ１.４４ｍＬ㊁ｓｓＤＮＡ(１０ｍｇ/ｍＬ)９３２期㊀㊀㊀㊀㊀王磊等:利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)相互作用的宿主蛋白㊀㊀４００μＬ㊁文库质粒ＤＮＡ２５μｇꎬ剧烈振荡１ｍｉｎ左右ꎬ至完全混匀ꎻ３０ħ水浴孵育３０ｍｉｎꎻ４２ħ水浴热激２５ｍｉｎꎻ３０ħ水浴复苏１ｈꎻ离心收菌(４０００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎻ用８ｍＬ无菌水重悬菌体ꎬ尽量温和地混匀ꎬ从中取２０μＬ培养物梯度稀释后涂效率平板ＳＤ￣ＴＬ３块ꎮ其余涂ＳＤ￣ＴＬＨ＋５ｍｍｏｌ/Ｌ３ＡＴ平板ꎬ每块２００μＬꎬ共４０块ꎻ３０ħ恒温培养３~４ｄꎬ记录转化效率ꎻ并根据转化子数量计算筛库效率ꎮ培养到第３天时ꎬ用无菌绒布对筛库平板进行影印清除ꎬ以消除受体菌背景生长的干扰ꎮ１.２.４㊀Ｈｉｓ和Ａｄｅ报告基因检测㊀从筛库平板中共挑取３８个初始阳性克隆转化子转接到ＳＤ￣ＴＬ缺陷型平板中继续培养２~３ｄꎬ将长出的３８个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至ＳＤ￣ＴＬ和ＳＤ￣ＴＬＨＡ＋６０ｍｍｏｌ/Ｌ３ＡＴ缺陷平板ꎬ３０ħ恒温培养３~４ｄꎬ以检测Ｈｉｓ和Ａｄｅ报告基因ꎮ１.２.５㊀阳性克隆激活ＬａｃＺ报告基因的检测㊀将３８个初始阳性克隆分别接种于ＳＤ￣ＴＬ培养液振荡培养过夜ꎬ离心收菌后弃上清ꎬ在每个反应中加入１００μＬ裂解液混合物以重悬菌体ꎬ将其转移至ＥＬＩＳＡ板ꎬ３７ħ孵育９０ｍｉｎ后测定每个孔对应的ＯＤ６１５和ＯＤ５４６值ꎬ分别计算相应的β￣ｇａｌａｃｔｏｓｉ￣ｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ＝ＯＤ６１５/ＯＤ５４６ꎮ１.２.６㊀酵母阳性克隆ＤＮＡ提取和测序比对㊀将通过３种报告基因检测的阳性克隆菌株分别抽提酵母质粒ꎬ然后转化大肠埃希菌Ｔｏｐ１０新鲜感受态并扩增ꎮ将含有阳性克隆的Ｔｏｐ１０转化子转接含有氨苄青霉素(５０μｇ/ｍＬ)的ＬＢ液体培养基ꎬ培养并扩增后抽提质粒ꎬ对质粒进行ＤＮＡ测序和ＢＬＡＳＴ比对ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＰＣＲ扩增得到ＭｇＰａ片段以ＭｇＰａ￣Ｆ和ＭｇＰａ￣Ｒ为引物ꎬｐＥＴ￣３０ａ(＋)￣ＭｇＰａ为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ如图１所示ꎬ在约８７０ｂｐ处有一明显条带ꎬ说明成功扩增出长度为８７０ｂｐ的目的片段ꎮ２.２㊀诱饵质粒ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ和ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的鉴定将构建好的ｐＢＴ３ＳＴＥ和ｐＢＴ３ＳＵＣ分别转化大肠埃希菌ꎬ随机挑取大肠埃希菌转化子４个ꎬ用质粒引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ结果表明成功扩增出长度约１２００ｂｐ的条带(图２)ꎬＰＣＲ产物经测序后与预期一致ꎮ２.３㊀ＭｇＰａ重组质粒自激活及其功能检测自激活检测显示ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ和ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ都有功能ꎬ且都不存在自激活现象ꎬ而ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的功能更强一些(图３)ꎬ因此ꎬ选用ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ进行下一步的文库筛选ꎮ图１㊀生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳分析Ｆｉｇ.１㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＭｇＰａ１:ＰＣＲ扩增产物ꎻＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒ１:ＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔꎻＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒ图２㊀诱饵质粒菌落ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳分析Ｆｉｇ.２㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｌｏｎｉａｌＰＣＲｏｆｂａｔｉｐｌａｓｍｉｄＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１~４:ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭＧＰＡ转化子ＰＣＲ产物ꎻ６~８:ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭＧＰＡ转化子ＰＣＲ产物Ｍ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１￣４:ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭＧＰＡＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎻ６￣８:ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭＧＰＡＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ图３㊀ＭｇＰａ重组质粒自激活检测Ｆｉｇ.３㊀Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｇＰａ１:阳性对照ꎻ２:阴性对照ꎻ３:ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的自激活检测ꎻ４:ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ的自激活检测ꎻ５:ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的功能检测ꎻ６:ｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ的功能检测１:Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻ２:Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻ３:Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＢＴ３ＳＵ￣ＭｇＰａ:４:Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａꎻ５:ＦｕｎｃｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａꎻ６:ＦｕｎｃｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＢＴ３ＳＴＥ￣ＭｇＰａ２.４㊀文库筛选用含有ｐＢＴ３ＳＵＣ￣ＭｇＰａ的ＮＭＹ３２酵母转化子制备感受态ꎬ将文库质粒ｐＰＲ３￣Ｎ￣２０７ＺｅｎｇＤＮＡ０４㊀㊀㊀㊀㊀微㊀生㊀物㊀学㊀杂㊀志㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷转入其中ꎬ接种ＳＤ￣Ｔｒｐ￣Ｌｅｕ￣Ｈｉｓ＋５ｍｍｏｌ/Ｌ３ＡＴ平板ꎮ计算筛库效率ꎬ结果共获得２.８ˑ１０６个转化子ꎬ转化效率为１.１ˑ１０５/μｇ(图４)ꎮ图４㊀ＭｇＰａ文库筛选效率Ｆｉｇ.４㊀ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＭｇＰａｌｉｂｒａｒｙ２.５㊀Ｈｉｓ和Ａｄｅ报告基因检测如图５所示ꎬ从文库筛选得到的３８个阳性克隆中ꎬ编号为１１㊁１３㊁１４㊁１５㊁２３和２６的６个克隆未能通过ＡＤＥ２和ＨＩＳ３报告基因检测ꎬ其余３２个克隆均通过ＡＤＥ２和ＨＩＳ３报告基因检测ꎮ２.６㊀ＬａｃＺ报告基因检测将β￣ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性值与阴性对照进行比较ꎬ如其β￣半乳糖甘酶活性值大于阴性对照值ꎬ则判定为通过了ＬａｃＺ报告基因的检测ꎮ结果表明有６个克隆(编号分别为２㊁５㊁７㊁８㊁１１㊁２３号)未能通过ＬａｃＺ报告基因检测ꎬ其余３２个克隆均通过检测(图６)ꎮ因此ꎬ本研究筛选到的与ＭｇＰａ相互作用的阳性克隆共有２８个ꎮ图５㊀阳性克隆ＡＤＥ２和ＨＩＳ３报告基因的检测Ｆｉｇ.５㊀ＲｅｐｏｒｔｇｅｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｌｏｎｙＡＤＥ２ａｎｄＨＩＳ３１~３８:克隆编号ꎻ＋:阳性对照ꎻ－:阴性对照１￣３８:ｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒꎻ＋:ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻ－:ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ图６㊀ＭｇＰａ阳性克隆β￣半乳糖苷酶活性检测Ｆｉｇ.６㊀Ａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆβ￣ＧａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｆｏｒＭｇＰａｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｌｏｎｙ１~３８:克隆编号ꎻ３９:阳性对照ꎻ４０:阴性对照１￣３８:ｃｌｏｎｅｎｕｍｂｅｒꎻ３９:ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻ４０:ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２.７㊀酵母阳性克隆ＤＮＡ提取和测序比对将２８个阳性克隆进行ＤＮＡ测序ꎬ并在Ｇｅｎ￣Ｂａｎｋ数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对分析ꎮ其中３个克隆在ＮＣＢＩ数据库中未查到同源序列ꎬ２５个克隆分别归属于２３种不同的蛋白编码基因(表１)ꎮ㊀㊀１４２期㊀㊀㊀㊀㊀王磊等:利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)相互作用的宿主蛋白㊀㊀表１㊀可能与生殖支原体黏附蛋白发生相互作用的蛋白Ｔａｂｌｅ１㊀ＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭ.ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ克隆号基因代码基因名称１ＸＭ＿０１６９５９８５７.１ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:Ｐａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓｔｒｉｂｂｌｅｓｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ１(ＴＲＩＢ１)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔＸ３ꎬｍＲＮＡ３ＡＬ５９０４５５.２０ＨｕｍａｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍｃｌｏｎｅＲＰ１１￣２７８Ｊ１７ｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１ꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅ４ＮＭ＿００５６６９.４Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｃｅｓｓｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ５(ＲＥＥＰ５)ꎬｍＲＮＡ６ＢＴ０５８３６１.１ＳａｌｍｏｓａｌａｒｃｌｏｎｅＣｏｎｔｉｇ４４０５６０ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＬ３７ａｐｕｔａｔｉｖｅｍＲＮＡꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓ９ＡＦ０５９６１７.１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｓｅｒｕｍ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｋｉｎａｓｅｍＲＮＡꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓ１２ＮＭ＿００１０１０９２４.１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ１７１ｍｅｍｂｅｒＡ１(ＦＡＭ１７１Ａ１)ꎬｍＲＮＡ１６ＸＭ＿０１７５２６４３９.１ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:ＣｅｂｕｓｃａｐｕｃｉｎｕｓｉｍｉｔａｔｏｒＨ３ｈｉｓｔｏｎｅꎬｆａｍｉｌｙ３Ａ(Ｈ３Ｆ３Ａ)ꎬｍＲＮＡ１７ＸＭ＿０１７０２１０９２.１ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＦＫ５０６ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ３(ＦＫＢＰ３)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔＸ１ꎬｍＲＮＡ１８ＮＧ＿０１５８４５.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｒｅｌｅａｓｅｆａｃｔｏｒ(ＰＴＲＦ)ꎬＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１７１９ＮＭ＿００１１０１.３Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓａｃｔｉｎｂｅｔａ(ＡＣＴＢ)ꎬｍＲＮＡ２０ＡＬ１１０２３９.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｍＲＮＡꎻｃＤＮＡＤＫＦＺｐ５６６Ｅ１４４(ｆｒｏｍｃｌｏｎｅＤＫＦＺｐ５６６Ｅ１４４)２１ＮＭ＿００５９５２.３Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ１Ｘ(ＭＴ１Ｘ)ꎬｍＲＮＡ２２ＮＭ＿００１８６６.２Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ７Ｂ(ＣＯＸ７Ｂ)ꎬｍＲＮＡ２４ＡＫ０７４９６０.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃＤＮＡＦＬＪ９０４７９ｆｉｓꎬｃｌｏｎｅＮＴ２ＲＰ３００２８３６ꎬｈｉｇｈｌｙｓｉｍｉｌａｒｔｏＰｌｅｘｉｎＡ２２７ＸＭ＿００９４４６４０９.２ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:ＰａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓＧＡＴＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２(ＧＡＴＡ２)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔＸ３ꎬｍＲＮＡ２８ＮＭ＿０１４７３６.５ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＫＩＡＡ０１０１(ＫＩＡＡ０１０１)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔ１ꎬｍＲＮＡ２９㊁３０㊁３４ＢＣ０３４３４９.１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙꎬｍｅｍｂｅｒ６ｂꎬｄｅｃｏｙꎬｍＲＮＡ(ｃＤＮＡｃｌｏｎｅＭＧＣ:２１０７９ＩＭＡＧＥ:４７５２５０７)３１ＢＣ０００１４１.１Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｖ￣ｍｙｃｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓｖｉｒａｌｏｎｃｏｇｅｎｅｈｏｍｏｌｏｇ(ａｖｉａｎ)ꎬｍＲＮＡ(ｃＤＮＡｃｌｏｎｅＭＧＣ:５１８３ＩＭ￣ＡＧＥ:２９８５８４４)ꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓ３２ＸＭ＿００９４２５３７５.２ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ:ＰａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓＤＡＺａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ２(ＤＡＺＡＰ２)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔＸ３ꎬｍＲＮＡ３３ＮＭ＿００１１６３２８６.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＥＷＳＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１(ＥＷＳＲ１)ꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｖａｒｉａｎｔ４ꎬｍＲＮＡ３６ＮＭ＿１９８５４１.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＩＧＦｌｉｋｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ１(ＩＧＦＬ１)ꎬｍＲＮＡ３７ＫＸ７０２２３３.１ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｈａｐｌｏｇｒｏｕｐＨ１ａ１ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎꎬｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅ３８ＮＭ＿０１４０４１.３Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｓｕｂｕｎｉｔ１(ＳＰＣＳ１)ꎬｍＲＮＡ３㊀讨㊀论Ｍｇ于１９８１年首次从非淋菌性尿道炎患者中分离出来[２]ꎮ研究表明Ｍｇ与盆腔炎㊁宫颈炎和非淋菌性尿道炎等疾病相关ꎬ同时也是一种艾滋病相关支原体[５ꎬ１０]ꎮＭｇ没有细胞壁ꎬ其细胞膜中含有较多的膜蛋白ꎬ其中含量最高的黏附蛋白(ＭｇＰａ)与Ｍｇ黏附或感染宿主细胞密切相关[５]ꎮＤＵＡＬｍｅｍｂｒａｎｅ系统是一种基于分离泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统ꎬ能够直接在酵母内原位检测蛋白￣蛋白之间的相互作用ꎬ不需要核定位信号ꎬ且泛素蛋白对相互作用蛋白的影响很小[１１]ꎮ因此ꎬ该系统可以用来检测胞质蛋白与膜蛋白或者两个膜蛋白之间的相互作用ꎮ本研究首先构建了能表达ＭｇＰａ的诱饵质粒ꎬ该重组质粒能正确表达并且不能自主激活报告基因ꎬ用于筛选ＭｇＰａ互作蛋白的诱饵ꎮ然后将基于膜蛋白酵母双杂交的人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库与此诱饵载体共同转化入宿主菌ꎬ再对阳性克隆进行筛选ꎬ结果共筛选到２８个阳性克隆ꎬＤＮＡ测序与ＢＬＡＳＴ比对分析的结果表明其归属于２３种不同的蛋白ꎬ这些蛋白可能为与ＭｇＰａ发生相互作用的蛋白ꎮ筛选到的２３个蛋白中ꎬ包含肿瘤坏死因子受体超家族成员６Ｂ㊁金属硫蛋白和细胞色素氧化酶等ꎮ肿瘤坏死因子受体超家族成员与其膜受体的相互作用与机体免疫系统的功能高度相关ꎬ并可能与某些获得性免疫缺陷病的病因学相关[１２]ꎮ肿瘤坏死因子受体超家族成员６Ｂꎬ即诱捕受体３(ＤｃＲ３)位于细胞膜ꎬ故推测Ｍｇ可能通过识别肿瘤坏死因子受体超家族成员６Ｂꎬ破坏细胞信号的正常传递ꎬ从而加速艾滋病的进展ꎮ此外ꎬＤｃＲ３水平在胃癌㊁肝癌㊁胆囊癌㊁细菌感染㊁肾衰竭等多种疾病中均升高[１３￣１４]ꎮ金属硫蛋白(ＭＴ)是一类分子量低㊁半胱氨酸含量丰富的蛋白质ꎬ与体内多种金属的转运相关ꎮ近年的研究表明ꎬ金属硫蛋白与肿瘤㊁中枢系统疾病㊁遗传性金属代谢病等多２４㊀㊀㊀㊀㊀微㊀生㊀物㊀学㊀杂㊀志㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷种疾病相关ꎬ且ＭＴ的过度表达与肿瘤的类型和分级相关[１５￣１６]ꎮ本研究的结果表明ꎬＭｇ感染宿主后通过ＭｇＰａ与金属硫蛋白发生互作ꎬ可能会导致宿主细胞抗氧化系统的失调ꎮ细胞色素氧化酶(ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｘｉｄａｓｅꎬＣＣＯ)是线粒体电子传递链末端的酶ꎬ在生物体代谢过程中极其重要ꎮ研究证实ＨＩＶ￣Ｔａｔ蛋白能够通过破坏线粒体来抑制细胞色素氧化酶的活性[１７]ꎮ我们发现ＭｇＰａ可能与ＣＣＯ发生相互作用ꎬ表明ＭｇＰａ有可能破坏宿主的能量系统从而导致宿主细胞受损ꎮ本研究筛选到的第６个克隆为６０Ｓ核糖体蛋白ꎬ与我们前期从人尿道上皮细胞Ｔ７噬菌体展示ｃＤＮＡ文库中筛选到的ＭｇＰａ互作蛋白ＲＰＬ３５一致[８]ꎻ另外ꎬ本研究筛选到的金属硫蛋白㊁细胞色素Ｃ氧化酶和Ｈ３组蛋白等与邓湘赢[１８]经改进的病毒铺覆蛋白印记技术和质谱分析等方法从人尿道上皮细胞膜蛋白中鉴定到的能与ＭｇＰａ互作的蛋白一致ꎮ因此ꎬ这进一步说明本研究利用膜蛋白酵母双杂交技术筛选到的这些蛋白可能为ＭｇＰａ的互作蛋白ꎮ由于酵母双杂交试验的结果有可能存在假阳性ꎬ在下一步研究中将使用ＧＳＴ￣ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ和荧光能量共振转移等技术对这些蛋白进行进一步验证ꎬ并研究这些蛋白的定位及其能否抑制Ｍｇ感染人尿道上皮细胞进行进一步研究ꎬ以对其是否为Ｍｇ的受体进行确证ꎮ总之ꎬ本研究利用膜蛋白酵母双杂交系统从人尿道上皮细胞ｃＤＮＡ文库中筛选到能与ＭｇＰａ发生相互作用的蛋白ꎬ为了解ＭｇＰａ的生物学功能及Ｍｇ与宿主细胞相互作用的机制提供参考ꎮ参考文献:[１]㊀张岱ꎬ刘朝晖.生殖道支原体感染诊治专家共识[Ｊ].中国性科学ꎬ２０１６ꎬ２５(３):８０￣８２.[２]㊀ＴｕｌｌｙＪＧꎬＴａｙｌｏｒ￣ＲｏｂｉｎｓｏｎＤꎬＣｏｌｅＲＭꎬｅｔａｌ.ＡＮｅｗｌｙＤｉｓ￣ｃｏｖｅｒｅｄＭｙｃｏｐｌａｓｍａｉｎＴｈｅＨｕｍａｎＵｒｏｇｅｎｉｔａｌＴｒａｃｔ[Ｊ].Ｌａｎ￣ｃｅｔꎬ１９８１ꎬ１(８２３３):１２８８￣１２９１.[３]㊀ＨａｍａｓｕｎａＲ.Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍｉｎｍａｌｅｕｒｅｔｈｒｉｔｉｓ:Ｄｉａｇ￣ｎｏｓｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎＪａｐａｎ[Ｊ].ＩｎｔＪＵｒｏｌꎬ２０１３ꎬ２０(７):６７６￣６８４.[４]㊀ＬｉｓＲꎬＲｏｗｈａｎｉ￣ＲａｈｂａｒＡꎬＭａｎｈａｒｔＬＥ.Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉ￣ｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｍａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｒａｃｔｄｉｓｅａｓｅ:ａｍｅｔａ￣ａ￣ｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓꎬ２０１５ꎬ６１(３):４１８￣４２６.[５]㊀ＲａｍａｚａｎｚａｄｅｈＲꎬＫｈｏｄａｂａｎｄｅｈｌｏｏＭꎬＦａｒｈａｄｉｆａｒＦꎬｅｔａｌ.ＡＣａｓｅ￣ｃｏｎｔｒｏｌＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍＩｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎＷｏｍｅｎｗｉｔｈＮｏｒｍａｌＰｒｅｇｎａｎｃｙａｎｄＳｐｏｎｔａｎｅｏｕｓＡｂｏｒｔｉｏｎｕｓｉｎｇＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＯｓｏｎｇＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＲｅｓＰｅｒｓｐｅｃｔꎬ２０１６ꎬ７(５):３３４￣３３８. [６]㊀Ｉｖｅｒｓｏｎ￣ＣａｂｒａｌＳＬꎬＷｏｏｄＧＥꎬＴｏｔｔｅｎＰＡ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＭｙ￣ｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍＭｇｐＢＡｄｈｅｓｉｎｔｏＰｒｅｄｉｃｔＭｅｍｂｒａｎｅＴｏ￣ｐｏｌｏｇｙꎬＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｅＡｎｔｉｂｏｄｙＡｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙꎬＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅＡｍｉｎｏＡｃｉｄＤｉｖｅｒｓｉｔｙꎬａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｙＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃＥｐｉｔｏｐｅｓ[Ｊ].ＰＬＯＳＯＮＥꎬ２０１５ꎬ１０(９):ｅ１３８２４４. [７]㊀ＭａＬꎬＪｅｎｓｅｎＪＳꎬＭａｎｃｕｓｏＭꎬｅｔａｌ.Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉ￣ｄｅｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓｉｎｔｈｅＭｇＰａｏｐｅｒｏｎａｎｄｉｔｓｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｃｈｒｏ￣ｍｏｓｏｍａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ[Ｊ].ＪＭｅｄＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌꎬ２０１２ꎬ６１(２):１９１￣１９７.[８]㊀戴佩ꎬ邓湘赢ꎬ余敏君ꎬ等.从Ｔ７噬菌体展示ｃＤＮＡ文库筛选生殖支原体黏附蛋白的互作蛋白[Ｊ].中国免疫学杂志ꎬ２０１８ꎬ３４(５):６５３￣６５７.[９]㊀ＺｅｎｇＹꎬＬｉｕＬꎬＨｅＪꎬｅｔａｌ.ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｍｉｃｅｐｉｔｏｐｅｏｆｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ[Ｊ].ＣａｎＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０１２ꎬ５８(７):８９８￣９０８.[１０]ＦｕｃｈｓＷꎬＫｒｅｕｔｅｒＡꎬＨｅｌｌｍｉｃｈＭꎬｅｔａｌ.ＡｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃａｎａｌｓｅｘｕａｌｌｙｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＨＩＶ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｍｅｎａｔｔｅｎｄｉｎｇａ￣ｎａｌｃａｎｃｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ[Ｊ].ＢｒＪＤｅｒｍａｔｏｌꎬ２０１６ꎬ１７４(４):８３１￣８３８.[１１]ＮａｋａｍｕｒａＹꎬＨａｓｈｉｍｏｔｏＴꎬＩｓｈｉｉＪꎬｅｔａｌ.Ｄｕａｌ￣ｃｏｌｏｒｒｅｐｏｒｔｅｒｓｗｉｔｃｈｉｎｇｓｙｓｔｅｍｔｏｄｉｓｃｅｒｎｄｉｍｅｒｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｏｆＧ￣ｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｕ￣ｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｓｉｎｇＣｒｅ/ｌｏｘＰｓｉｔｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｙｅａｓｔ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇꎬ２０１６ꎬ１１３(１０):２１７８￣２１９０. [１２]熊娟ꎬ徐笑红.肿瘤坏死因子超家族成员分子结构的研究进展[Ｊ].医学综述ꎬ２０１１ꎬ１７(２２):３４０７￣３４０９.[１３]ＬｉｎＹꎬＹｅｎＣꎬＣｈｅｎＨꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｓｅｒｏｌｏｇｉｃｄｅｃｏｙｒｅｃｅｐｔｏｒ３(ＤｃＲ３)ｌｅｖｅｌｓａｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｌｏｗｅｒｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎＨＩＶ￣１/ＡＩＤＳｐａｔｉｅｎｔｓ[Ｊ].ＪＦｏｒｍｏｓＭｅｄＡｓｓｏｃꎬ２０１５ꎬ１１４(６):４９８￣５０３.[１４]ＬｉｕＹＪꎬＳｈａｏＬＨꎬＺｈａｎｇＪꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｅｃｏｙｒｅｃｅｐｔｏｒ３ａｎｄｓｏｌｕｂｌｅｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎｍｙｅｌｏｉｄｃｅｌｌｓ￣１ｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｂａｃｔｅｒｉａｌｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ[Ｊ].ＡｎｎＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂꎬ２０１５ꎬ１４(１):１￣７. [１５]宁凤ꎬ傅俊江ꎬ陈汉春.金属硫蛋白及其生物学功能[Ｊ].中国生物化学与分子生物学报ꎬ２０１７ꎬ３３(９):８９３￣８９９. [１６]ＢｉｚｏńＡꎬＪｅꎬｄｒｙｃｚｋｏＫꎬＭｉｌｎｅｒｏｗｉｃｚＨ.Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｍｅｔａｌｌｏ￣ｔｈｉｏｎｅｉｎｉｎｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ[Ｊ].ＰｏｓｔｅｐｙＨｉｇＭｅｄＤｏｓｗ(Ｏｎｌｉｎｅ)ꎬ２０１７ꎬ７１(１):９８￣１０９.[１７]ＬｅｃｏｅｕｒＨꎬＢｏｒｇｎｅ￣ＳａｎｃｈｅｚＡꎬＣｈａｌｏｉｎＯꎬｅｔａｌ.ＨＩＶ￣１Ｔａｔｐｒｏｔｅｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙｉｎｄｕｃｅｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａ￣ｔｉｏｎａｎｄｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｘｉｄａｓｅ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓꎬ２０１２ꎬ３(３):ｅ２８２.[１８]邓湘赢.生殖支原体ＭｇＰａ特异结合多肽的功能鉴定与ＭｇＰａ细胞受体的鉴定[Ｄ].衡阳:南华大学ꎬ２０１７.３４２期㊀㊀㊀㊀㊀王磊等:利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(ＭｇＰａ)相互作用的宿主蛋白㊀㊀。
2021年第6期（总第287期） 文献综述57酵母双杂交技术研究进展刘国涛1，张树宇2，魏 凯2*（1.山东省滨州市畜牧兽医管理服务中心，山东 滨州 256600；2.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安）中图分类号：S816.76 文献标识码：A 文章编号：1007-1733（2021）06-0057-03 酵母双杂交系统是研究活细胞内蛋白质与蛋白质之间相互作用的一种强大且常用的分子生物学技术。
该技术不仅能够检测细胞内稳定的蛋白互作，而且可以检测微弱的或者瞬时的蛋白相互作用。
实验方法具有成本低，易操作，设计简单等一系列优点，在生物学实验中的应用十分广泛。
酵母双杂交技术在众多生物学相关领域应用广泛且前景广阔。
本文对酵母双杂交技术的基本原理、应用、发展前景等方面进行综述。
蛋白质在生命活动的的许多过程发挥着不可或缺的作用，如细胞间的信号转导，胞内物质的代谢及细菌病毒对细胞的入侵等。
研究蛋白质相互作用对于人们深入了解预防传染病，靶向治疗多基因疾病有重要意义。
酵母双杂交技术设计简单及其对微弱或短暂蛋白互作的检测能力使其在互作蛋白筛选过程中得到广泛应用。
1 酵母双杂交技术的基本原理1986年Keegan 等[1]发现了酵母细胞中的Gal4结构可结合特定的DNA 序列（上游激活域，UAS ），从而在半乳糖存在的情况下激活转录。
1989年，Fields 和Song 通过描述一种基因系统来检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）中直接的蛋白质-蛋白质相互作用，彻底改变了蛋白质相互作用分析[2]。
Gal4有两个不同功能域即：N 端DNA 结合域（DNA-BD ）和C 端（转录）激活域（AD ），两个单独的域均独立于另一个而维持其功能。
在诱饵蛋白上加上BD 结构域，在猎物蛋白上加上AD 结构域，当诱饵和猎物结合时，BD 和AD 结构域在空间上相互接近，发挥转录因子的作用。
DNA-BD 结构域识别并结合GAL 上的UAS （上游激活序列），AD 结构域激活基因转录，从而使酵母特定基因如LzcZ 、HIS3、MEL1、ABAr 的表达，使酵母菌能够在特定的营养缺陷培养基上生长，同时水解培养基上的X-α-Gal [2]，使无色透明的X-α-Gal 分解从而使菌落产生蓝斑，降低了假阳性率；也可通过AbA 抗生素筛选报告基因的表达而在抗生素培养基上生长，提高了准确性。
酵母双杂实验原理及技术蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。
在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。
在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。
一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。
在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。
GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。
〔综 译〕酵母双杂交系统的研究进展与应用马洪波 杜 坚 珠海出入境检验检疫局(珠海 519020) 酵母双杂交系统作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,在近几年来得到了广泛运用。
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
大量的研究文献表明,酵母双杂交系统既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。
因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
1 酵母双杂交系统基本原理 酵母双杂交系统首先是由Fields和S ong等1在研究真核基因转录调控中建立的。
酵母双杂交系统最初是在人们对酵母转录因子G A L4的认识基础上的。
天然G A L4分子由1条多肽链组成,含有881个氨基酸,1个完整的酵母转录因子G A L4可分为结构上可以分开的、功能上相互独立的2个结构域:位于N端1～174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端768～881位氨基酸区段的转录激活域(Activation domain,DAN-AD)。
DNA-BD能够识别位于G A L4效应基因(G A L4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating Sequence,UAS),并与之结合。
而AD则是通过同转录机(transcription machinery)中的其它成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录2。
DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在上游较为接近时,则呈现完整的G A L4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录(图1)。
酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。
本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。
二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。
转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。
在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。
如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。
三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。
设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。
2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。
植物遗传资源学报2006,7(4):477～483Journal of Plant Genetic Res ources利用酵母双杂交系统研究植物与病毒蛋白相互作用的进展黄大辉,张增艳,辛志勇(中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物遗传育种重点实验室,北京 100081) 摘要:在长期进化中,植物形成了抵御病毒等病原微生物侵染的精细防御系统。
在病毒侵染、复制和传播过程中,其编码的一些蛋白,如外壳蛋白、运动蛋白、复制酶类等能够与植物基因编码的蛋白发生相互作用。
酵母双杂交系统是体外研究蛋白质间相互作用的有利工具,不但可以用于研究已知蛋白质的互作,还可以发现新蛋白,揭示特定蛋白互作网络与作用机制,在植物蛋白与病毒蛋白互作研究中已得到广泛的利用。
本文主要综述利用酵母双杂交系统研究植物与病毒蛋白相互作用的国内外进展。
关键词:酵母双杂交;植物;病毒收稿日期:2006209228基金项目:国家“863”计划(2004AA222120)作者简介:黄大辉(19772),男,在读博士,研究方向为小麦抗病分子生物学通讯作者:张增艳,研究员,博导,主要从事小麦分子生物学研究;辛志勇,研究员,博导,主要从事小麦遗传育种研究Advances of the I nteracti on between Protei n s of Pl ant andVi rus Usi n g Yeast Two Hybr i d M ethodHUANG Da 2hui,Z HANG Zeng 2yan,X I N Zhi 2yong(Key L aboratory of C rop Genetics and B reeding of M inistry of A griculture /Institute ofC rop Science,Chinese A cade m y of A gricultural Sciences,B eijing,100081) Abstract:During l ong ti m e evoluti on,p lants devel oped elaborate defense pathway and comp licated mechanis m sagainst virus and other pathogens .V irus p r oteins,such as coat p r otein (CP ),move ment p r otein (MP )and poly 2merase p r otein,would interact with host p lant p r oteins during virus infecti on p r ocess .The yeast t w o hybrid syste m is a useful method t o analyze the interacti on bet w een p r oteins in vitr o and app lied widely in studying the interacti on bet w een p r oteins of p lant and virus .This article mainly p resented the advances of the p r otein interacti on of p lant and virus by using yeast t w o hybrid during the past decade .Key words:Yeast t w o hybrid;Plant;V irus 在长期进化过程中,植物发展起来一系列防御病原微生物的精细网络系统。
