酵母双杂交
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立i 。
典型的真核生长转录因子，如GAL4 GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA
结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
基本原理
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而
且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白—蛋白的相互作用。主要有二类载体：a 含DNA -binding domain 的载体；b 含DNA-activating domain 的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读
框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱
动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenee)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用bin di ng-doma in 基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli 转录抑制因子)的DNA-bd 编码序列。常用的activating-domain 基因有：GAL4(768-881)和
疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：〈1〉易于转化、便
于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活
结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的
作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋
白间的结合作用。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为
达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动
子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表
达等检测方法均很敏感。
结构组成酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要结构域，如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v， p21cip1蛋白与增殖细胞核抗原(proliferating-cell nuclear antigen，PCNA)的结合序列vi 等。此
外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。
特点与优点
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵ 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白
质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、
器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及
膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了
RAP1 与RIF1ii、P21cip1 与CDK2iii、p16 与CDK4iv 等之间的相互作用。
局限性和存在的问题
酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，
有多方面的应用，但仍存在一些局限性。⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相
互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖
基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折
叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞
膜受体蛋白等的研究。⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA 吉合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成
稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假阳性"的发生；发展哺乳动物双杂交系统更
好地研究蛋白将的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因（常用lacZ和HIS3）有以下优势vii:⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因，可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力，
尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
哺乳动物双杂交系统毗也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中，一种感兴趣的蛋白与Gal4--DNA结合结
构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以
融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT共同转染
哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两
个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实了
P53蛋白与大T抗原的相互作用，得到了酵母双杂交系统相同的结果。且
较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细
胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段
常见问题的解决与改进
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下
，
报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA
的特异性结合，则也可单独激活报告基因的表达。因此，为排除假阳性就需
要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因，且每个报告基
因的上游调控区各不相同，这可减少大量的假阳性。另外，报告基因通常整
合到染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：（1）这种相互作用是
否会在细胞内自然发生，即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。（2）某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋
